植物抗寒性的分子機(jī)制

1、植物抗寒性的分子機(jī)制摘 要植物在低溫馴化過程中能誘導(dǎo)許多基因的表達(dá)，產(chǎn)生的一系列低溫誘導(dǎo)蛋 白，進(jìn)而提高植物的抗寒能力。在冷馴化過程中，質(zhì)膜首先感受冷信號(hào)，調(diào)節(jié)胞 質(zhì)中IP3的含量，誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+濃度的升高，從而激活CBF基因的表達(dá)。不飽 和脂肪酸也有助于提高植物的抗寒性。關(guān)鍵詞：耐寒性低溫誘導(dǎo)蛋白CBF轉(zhuǎn)錄因子不飽和脂肪酸分子機(jī)制ABSTRACTPlant can induce expression of many genes during cold acclimation, a series of proteins named low-temperature-induced protei

2、ns are produced, and then improve the ability of plants freezing tolerance. Plant cells can sense cold stress at the cell membrane, then increase cytosolic Ca2+ and trigger the expression of CBFs during cold acclimation. Fatty acid desaturases can also improve the ability of planfs freezing toleranc

3、e.Key words : cold tolerance low-temperature-induced proteins CBF transcriptional factor fatty acid desaturases molecular mechanisms目錄 TOC o 1-5 h z 前言4 HYPERLINK l bookmark21 o Current Document 低溫誘導(dǎo)蛋白及其功能5 HYPERLINK l bookmark24 o Current Document 1.1防止細(xì)胞冰凍缺水5 HYPERLINK l bookmark27 o Current Docum

4、ent 1.2保護(hù)酶在低溫下正常行使功能5 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 1.3低溫誘導(dǎo)具有調(diào)節(jié)功能的蛋白6 HYPERLINK l bookmark33 o Current Document 1.4低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)RNA起穩(wěn)定作用的蛋白質(zhì).6 HYPERLINK l bookmark36 o Current Document 1.5低溫誘導(dǎo)熱激蛋白6 HYPERLINK l bookmark39 o Current Document 低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控8 HYPERLINK l bookmark42 o Current Document

5、 2.1植物中的CBF轉(zhuǎn)錄因子8 HYPERLINK l bookmark45 o Current Document CBF轉(zhuǎn)錄因子的功能8 HYPERLINK l bookmark49 o Current Document CBF轉(zhuǎn)錄因子作用機(jī)制8 HYPERLINK l bookmark53 o Current Document CBF2基因負(fù)向調(diào)控CBF1、CBF3基因的表達(dá)9 HYPERLINK l bookmark56 o Current Document 2.2低溫脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)9 HYPERLINK l bookmark59 o Current Document 2.3 RNA的

6、修飾和核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)10 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 脂肪酸的去飽和作用與植物的抗凍性11 HYPERLINK l bookmark65 o Current Document 研究展望.12 HYPERLINK l bookmark69 o Current Document 參考文獻(xiàn)：13刖言凍害是農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害的一種，即作物在0C以下的低溫使植物細(xì)體內(nèi)結(jié)冰， 對(duì)膜造成機(jī)械性破壞，或?qū)е录?xì)胞質(zhì)脫水，嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)發(fā)育甚至導(dǎo)致死亡， 這在溫帶地區(qū)最常見。因此，低溫是影響植物生長(zhǎng)、發(fā)育及其地理分布的重要環(huán) 境限制因素之一。但是有些植物在低溫但非冰凍

7、的環(huán)境生長(zhǎng)一段時(shí)間后，卻增強(qiáng) 了抗凍能力，從而能耐受細(xì)胞外結(jié)冰，這個(gè)適應(yīng)過程稱為冷馴化(cold acclimation) 或低溫馴化。根據(jù)植物的種類，達(dá)到最大抗凍性的低溫馴化時(shí)間從數(shù)天至數(shù)周不 等，不同種類植物可以耐受-10C至-60C以下的溫度。因此，低溫馴化是植物提 高抗凍性的有效途徑1，5。近二十年來，世界各地的科研工作者圍繞在低溫馴化過程中植物發(fā)生的生理 生化和分子水平的各種變化進(jìn)行了大量的研究，在低溫誘導(dǎo)蛋白、低溫誘導(dǎo)基因、 cDNA文庫的構(gòu)建、DNA序列的測(cè)定和同源性分析、體外轉(zhuǎn)錄及翻譯等方面取 得了很多成果，至今已建立了低溫誘導(dǎo)的大麥、小麥、水稻、菠菜、苜蓿、擬南 芥和甘藍(lán)型油

8、菜等幾十種植物的cDNA文庫，并從中分離出上百種低溫誘導(dǎo)基 因。最新的研究表明，至少有300個(gè)低溫反應(yīng)基因參與了低溫馴化進(jìn)程。植物抗寒性研究已成為植物分子生物學(xué)中頗為引人注目的領(lǐng)域之一1，3。低溫誘導(dǎo)蛋白及其功能低溫誘導(dǎo)蛋白(cold induced protein),又稱冷誘導(dǎo)蛋白，是伴隨著植物的低溫 馴化而出現(xiàn)的新蛋白質(zhì)。研究表明，植物的低溫誘導(dǎo)蛋白具有十分廣泛的生理生 化功能1，8。1.1防止細(xì)胞冰凍缺水脫水是凍傷造成的主要傷害之一，所以低溫誘導(dǎo)基因編碼的部分蛋白與防止 細(xì)胞冰凍缺水有關(guān)。許多在冷馴化過程中誘導(dǎo)和積累的蛋白質(zhì)都具有高的 Gly 含量、高度親水性以及在達(dá)到沸點(diǎn)時(shí)仍能保持可溶

9、性這三個(gè)特點(diǎn)。這些特點(diǎn)是與 它們的潛在功能相關(guān)的。高含量的Gly可以使蛋白質(zhì)具有高度柔性和流動(dòng)性，促 使分子內(nèi)氫鍵的形成，使蛋白分子具有無規(guī)則卷曲構(gòu)型，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)免遭冰凍 和嚴(yán)重脫水的傷害。低溫誘導(dǎo)蛋白的高度親水性一方面參與初生冰晶晶格氫鍵 的形成，以減少細(xì)胞內(nèi)的冰凍傷害，另一方面把足夠的水分捕獲到細(xì)胞內(nèi)，以阻 止冰凍或水脅迫引起的局部缺水。苜蓿的冷馴化特異蛋白Casls具有大量Gly和 Thr，可使其在細(xì)胞中保持可溶性，利于提高植物在冰凍時(shí)忍受次級(jí)脫水脅迫的 能力1，6。1.2保護(hù)酶在低溫下正常行使功能擬南芥菜在冷馴化過程中存在一種COR15蛋白，在沸點(diǎn)時(shí)仍保持可溶性。 體外進(jìn)行的低溫保護(hù)

10、證明，COR15蛋白具有高效的低溫保護(hù)活性，能夠非常有 效地防止易受低溫影響的乳酸脫氫酶因冰凍而失活，它的保護(hù)效率比蔗糖高106 倍。擬南芥菜的低溫誘導(dǎo)蛋白LT165和LT178,在冷馴化過程中保護(hù)重要的酶分 子在低溫但非冰凍的溫度下正常行使功能1，4。1.3低溫誘導(dǎo)具有調(diào)節(jié)功能的蛋白Castonguay等(1994)發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)富含脯氨酸的低溫誘導(dǎo)蛋白一一苜蓿的 MSACIC蛋白。除被低溫誘導(dǎo)外不被其他條件所誘導(dǎo)。MSACIC富含Pro(18%)、 Ser(13%)、Thr(10%)和 Ala(9%)，結(jié)構(gòu)上和4種在植物發(fā)育過程中起調(diào)節(jié)作用的 蛋白非常相似。目前正在通過把MSACIC蛋白的反

11、義基因?qū)胲俎Ｒ匝芯克?耐凍性形成中的作用。從苜蓿中純化得到冷馴化特異蛋白Cas15，含一個(gè)重復(fù)4次的10肽基序， 它富含Gly，具親水性，屬可溶蛋白或外周蛋白，可能是一種定向到核的蛋白， 在基因調(diào)節(jié)或維持核的結(jié)構(gòu)與功能方面起作用1。1.4低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)RNA起穩(wěn)定作用的蛋白質(zhì)根據(jù)大麥(Hordeum vulgare)低溫誘導(dǎo)基因的cDNA克隆Pt59和Pa086的核 昔酸序列以及由最長(zhǎng)的開放讀框?qū)С龅陌被嵝蛄兄?，它們所編碼的蛋白具有 富含精氨酸的堿性結(jié)構(gòu)域。大麥耐凍能力的強(qiáng)弱和這些精氨酸基序的出現(xiàn)密切相 關(guān)，富含精氨酸的序列參與了蛋白質(zhì)和RNA間的相互作用。推測(cè)Pt59和Pa086 基

12、因編碼的蛋白在冷馴化過程中是以和RNA相互作用的方式起到穩(wěn)定特定RNA 的作用的1。1.5低溫誘導(dǎo)熱激蛋白熱激蛋白(heat shockprotein， Hsp )是一個(gè)蛋白家族，根據(jù)其分子量而區(qū)分為 Hspll0、Hsp90 和 Hsp70 等類群1。在研究植物熱激蛋白的早期，人們就已經(jīng)注意到低溫誘導(dǎo)合成的某些蛋白可 能與熱激誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白有關(guān)?，F(xiàn)代研究證明，低溫確實(shí)誘導(dǎo)了熱激蛋白的產(chǎn)生。 如菠菜、馬鈴薯、甘藍(lán)型油菜、水稻等植物在冷脅迫時(shí)分別可檢測(cè)到熱激蛋白的 表達(dá)，而且部分熱激蛋白還與脫水蛋白存在序列上的相似性，可減輕冷脅迫對(duì)膜 的損傷，從而增強(qiáng)了組織的耐寒性。由此可見，雖然熱激反應(yīng)和冷馴

13、化涉及不同 的適應(yīng)性反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生自己獨(dú)特的逆境蛋白，但不同逆境卻可以誘導(dǎo)相同的蛋 白。另一方面，推測(cè)低溫誘導(dǎo)的熱激蛋白的功能可能是單獨(dú)或者和其它HSP構(gòu) 成復(fù)合體參與把冷馴化中合成的多肽運(yùn)輸?shù)劫|(zhì)膜、核或細(xì)胞器中；也可能是作為 分子伴侶，具有穩(wěn)定的功能，幫助冷脅迫造成的變性蛋白進(jìn)行重新折疊，以恢復(fù) 其活性1，10。低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控2.1植物中的CBF轉(zhuǎn)錄因子近年來，科研人員在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)的了 CBF轉(zhuǎn)錄因子及其相應(yīng)的 低溫反應(yīng)途徑，使當(dāng)前抗寒分子生物學(xué)與基因工程研究取得了重大突破。其在抵 御驟然降低的低溫天氣，減少作物因低溫脅迫造成的減產(chǎn)等方面具有廣闊的應(yīng)用 前景罔。CBF轉(zhuǎn)錄因

14、子的功能在植物抗寒研究的早期階段，人們一直致力于低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)的研究以尋 找專一的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)了 CBF轉(zhuǎn)錄因子。CBF轉(zhuǎn)錄因子可與其調(diào)控的基 因上游CRT/DRE元件結(jié)合，從而調(diào)控該基因的表達(dá)。擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中CBF 轉(zhuǎn)錄激活因子的超表達(dá)導(dǎo)致許多生理生化變化，包括編碼產(chǎn)生LEA蛋白或親水 多肽，脯氨酸和多種可溶性糖類的合成積累。CBF轉(zhuǎn)錄因子與CRT/DRE DNA 調(diào)控元件特異結(jié)合，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，促進(jìn)這幾類物質(zhì)的合成與積累，從而 提高植物的抗逆性。另外，實(shí)驗(yàn)證明，轉(zhuǎn)基因擬南芥中CBF1和CBF2的超表達(dá) 導(dǎo)致正常溫度下COR6.6、COR15a、COR47、COR78等冷誘

15、導(dǎo)基因的表達(dá)或增 強(qiáng)1，8。CBF轉(zhuǎn)錄因子作用機(jī)制CBF基因能對(duì)低溫迅速作出反應(yīng)，但其表達(dá)的機(jī)制至今還不清楚。Gilmour 等(1998)曾提出一個(gè)CBF調(diào)節(jié)COR基因表達(dá)機(jī)理的假說。他們?cè)O(shè)想了一個(gè)未知 的轉(zhuǎn)錄激活因子ICE，并認(rèn)為CBF基因的啟動(dòng)子中存在一個(gè)低溫調(diào)節(jié)元件 ICEbox，轉(zhuǎn)錄激活因子ICE處于不活動(dòng)的狀態(tài)，其原因可能是在細(xì)胞質(zhì)中它被 一種負(fù)調(diào)節(jié)蛋白所隔離或者是以不能與DNA結(jié)合的形式或不能激活轉(zhuǎn)錄的形式 存在。當(dāng)植物處于低溫條件下時(shí)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，引起轉(zhuǎn)錄激活因子ICE 或相關(guān)蛋白發(fā)生變化，從而促使轉(zhuǎn)錄激活因子ICE誘導(dǎo)CBF基因的表達(dá)，CBF 基因能與COR基因啟動(dòng)子

16、中的CRT/DRE元件結(jié)合，促進(jìn)COR基因的表達(dá)，提 高植物的抗凍性2, 4。2.1.3 CBF2基因負(fù)向調(diào)控CBF1、CBF3基因的表達(dá)對(duì)擬南芥CBF1、CBF2、CBF3基因在低溫調(diào)控中作用的研究表明，擬南芥 的CBF2基因敲除即形成CBF2基因突變體，在沒有面臨環(huán)境脅迫的條件下，植 株中低溫誘導(dǎo)基因LTI78、KIN1、COR47和COR15a基因的mRNA含量組成型 表達(dá)，經(jīng)過低溫處理后，mRNA的含量比對(duì)照的含量明顯減少。而在啟動(dòng)子上 不含CRT/DRE元件的RCI1A，RCI2A和DREB2A的低溫誘導(dǎo)基因的對(duì)照植株 和低溫處理的CBF2基因突變植株的表達(dá)水平并不受影響。而且，在沒

17、有環(huán)境脅 迫的條件下，CBF1和CBF3在CBF2基因突變植株中的表達(dá)水平比對(duì)照高了許 多。經(jīng)低溫處理，CBF1、CBF3在CBF2基因突變株中表達(dá)水平更高。由此可見， CBF2基因具有負(fù)向調(diào)控CBF1和CBF3基因表達(dá)的作用8。2.2低溫脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞膜上的鈣離子通道等信號(hào)感受器接受低溫脅迫信號(hào)后，誘導(dǎo)(保衛(wèi))細(xì) 胞釋放Ca2+，或者誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生二級(jí)信號(hào)分子，刺激細(xì)胞釋放Ca2+，激活蛋白 激酶參加蛋白質(zhì)磷酸化代謝過程，誘導(dǎo)脅迫靶基因表達(dá)。研究表明，作為第二信 使的Ca2+參與植物對(duì)低溫響應(yīng)過程，并與一些植物低溫誘導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控相 關(guān)，如擬南芥的cor6.6/kin1和苜蓿的cas15

18、。通過改變二級(jí)信號(hào)分子的生化代 謝途徑，影響鈣離子流釋放水平，可以調(diào)節(jié)低溫脅迫基因表達(dá)，影響植物的耐凍 性。在冷信號(hào)傳導(dǎo)過程中，1，4, 5-三磷酸肌醇(IP3)作為重要的信號(hào)分子介導(dǎo) 細(xì)胞內(nèi)鈣庫儲(chǔ)存的Ca2+釋放到胞質(zhì)，從而調(diào)控CBF和COR基因的表達(dá)。擬南 芥FRY1基因編碼肌醇多聚磷酸鹽1 一磷酸酶，能降解IP3,對(duì)冷信號(hào)傳遞進(jìn)行 負(fù)調(diào)控。而Fry1突變體植物的IP3含量比野生型高，COR基因表達(dá)增強(qiáng)，其抗 凍性也提高7, 11。2.3 RNA的修飾和核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)在冷馴化過程中，基因的誘導(dǎo)和組成性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄都需要加工、運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞 質(zhì)保持一種適合翻譯的構(gòu)型。RNA可被折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)從而影響它的

19、功能。在 冷的脅迫下，植物中一些含有CSP結(jié)構(gòu)域的蛋白上調(diào)，也可能是作為RNA伴侶 調(diào)節(jié)翻譯。RZ-1a是擬南芥中的一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)、甘氨酸含量豐富的RNA結(jié)合蛋 白，在冷的脅迫下上調(diào)。基因分析證明它在抗冷方面具有作用。另外一類RNA 伴侶，RNA解旋酶，也參與RNA的代謝。在植物中有一大類DEAD-box RNA 解旋酶。在擬南芥中其中的一個(gè)DEAD-box RNA解旋酶LOS4在植物的抗冷反 應(yīng)中起重要的作用，參與RNA有效的從核轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)。擬南芥中的核蛋白 AtNUP160(Arabidopsisnucleoporin)控制RNA的運(yùn)輸，在抗冷過程中是至關(guān)重要 的。另外，因?yàn)閘os4和atn

20、up160突變體沒有生長(zhǎng)和發(fā)育上的缺陷，在其他非生 物脅迫下也沒有明顯的變化，所以LOS4和AtNUP160蛋白只有在冷的脅迫下才 會(huì)影響RNA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)1，8, 12。三脂肪酸的去飽和作用與植物的抗凍性植物生理學(xué)研究表明，膜的流動(dòng)性對(duì)植物在低溫時(shí)維持生存起著重要作用， 正常情況下呈流動(dòng)液態(tài)鑲嵌狀態(tài)。對(duì)多種植物在低溫下生長(zhǎng)時(shí)體內(nèi)多不飽和脂肪 酸水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，冷馴化過程中，普遍伴隨著不飽和脂肪酸含量的升高。而且， 植物的冷敏感性與磷脂酰甘油中飽和及反式單不飽和脂肪酸分子形式的總體水 平呈正相關(guān)?；谶@些研究，曾提出一種至今仍被廣為接受的假說，即飽和脂肪 酸能使冷敏感植物的膜發(fā)生相變，膜中脂雙分

21、子層的相變又迅速破壞膜的完整性 從而導(dǎo)致植物細(xì)胞的受傷或死亡。因此，抗寒鍛煉的一個(gè)關(guān)鍵功能是改變物細(xì)胞 膜的脂肪酸組成1，6。膜脂脂肪酸的不飽和度均增加，可提高細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，尤其是葉綠體和線 粒體膜的穩(wěn)定性。水稻、小麥、油菜膜脂的不飽和度與品種的抗寒性成正比。植 物膜質(zhì)不飽和脂肪酸含量增加，能降低熔點(diǎn)，改變相變溫度，增加膜脂的流動(dòng)性， 從而有利于細(xì)胞膜的穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化植株的低溫傷害顯著降低，抗寒性明顯提高。 轉(zhuǎn)脂肪酸不飽和酶基因的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了低溫冷害的“膜脂相變”學(xué)說，也是 目前采用基因工程改良植物抗寒冷性的途徑之一 6。研究展望植物的抗寒性為數(shù)量性狀，受微效多基因控制。目前已經(jīng)從植物中分離

22、出的 百余種低溫誘導(dǎo)基因，只有少數(shù)真正具有抗寒作用，因此迫切需要篩選更廣泛的 種質(zhì)資源，尋找適合植物利用的抗寒基因。除此之外，Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是如何 協(xié)同作用將寒冷脅迫信號(hào)傳遞到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子又是如何調(diào)控各種 抗寒基因的表達(dá)，各種低溫誘導(dǎo)蛋白又是如何發(fā)揮抗寒活性等問題的分子機(jī)制研 究是植物抗寒凍基因工程的基礎(chǔ)。植物在感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)寒冷信號(hào)的過程中，有多種 調(diào)控基因參與編碼產(chǎn)生信號(hào)傳遞因子和調(diào)控蛋白質(zhì)。目前對(duì)植物感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)寒冷 信號(hào)的機(jī)制，以及植物抗寒凍的確切分子機(jī)制尚不很清楚。例如，在擬南芥和水 稻等植物中，存有不依賴于CBF的信號(hào)途徑。植物低溫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的研究雖然 已取得很大進(jìn)展，但迄今對(duì)低溫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的研究主要還是通過分析其與已知蛋 白質(zhì)的同源性及一些生理現(xiàn)象確定的，除少數(shù)確定為植物適應(yīng)脅迫過程中的必需 蛋白質(zhì)外，大部分低溫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的功能及其表達(dá)機(jī)制仍不清楚2,5。隨著全序列測(cè)定物種的增加以及大量表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的產(chǎn)生，精細(xì)遺 傳和物理圖譜的構(gòu)建，反向遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和比較基因組學(xué)在基因功能研究 中越來越顯示其重要性，人們對(duì)冷馴化的分子機(jī)制的了解必將越來越清晰3, 9。參考文獻(xiàn):劉良式等.植物分子遺傳學(xué).北京：科學(xué)出版社，1998, 499526.周筱娟.低溫誘導(dǎo)的植物抗凍基因研究進(jìn)展J.紹興文理學(xué)院學(xué)報(bào)