結核病實驗室質量保證及快速診斷進展-Bacteria

1、結核病實驗室質量保證及快速診斷進展國家結核病參比實驗室1內容結核病實驗室工作在結核病控制中的作用為什么要進行EQAEQA 培訓的重要意義4. 結核病實驗室相關的流行病學理論5. 痰涂片鏡檢的操作原理6. 全球結核病快速診斷進展2結核病實驗室工作在結核病控制中的作用診斷 （發(fā)現傳染源）治療 （確定治療方案）療效評價結核病控制策略和措施的評估3Diagnosis of Pulmonary TB Relatedto Numbers of Tubercle Bacilli10102103104105106Poor microscopy (25%)Good microscopy (55%)Culture

2、 / PCR (25%)X-ray/clinical only (20%) AFB per ml of sputumSlide Courtesy: Van Deun A, Nov 20034細菌 讓人們聯(lián)想到什么?疾病傳染性流行性食物腐敗在目前已知的細菌中有1%的細菌可以導致人患病在目前已知的細菌中有4%的細菌可以導致植物得病 95%已知細菌不具有致病性5為什么要進行EQA增加人員的責任心推行標準化、規(guī)范化操作確保實驗室服務質量的提高生物安全的需要加強實驗室網絡、采集信息6痰涂片鏡檢EQA 培訓的意義強化EQA的理解，有利于積極推廣提高實驗室服務質量提高對結核病實驗室工作的重視逐步提高結核病防

3、治人員特別是結核病實驗室工作人員的地位7結核病實驗室相關的流行病學理論結核病的發(fā)病學和流行冰山理論水庫理論病因分析和療效評價81. 細胞2. 通過從環(huán)境中攝取化合物和能量維持其結構3. 對外部刺激的反應性4. 復制、繁衍并傳遞給其子代遺傳信息5. 進化適應環(huán)境生命的5 個基本特征9結核分枝桿菌在人體中的生活周期感染感染 95%后期表現 - 5%病變早期進展 - 5%例如： HIV, 嬰幼兒例如：移民10結核分枝桿菌的生活周期感染人體內生存由肺中排入空氣中進入細胞內侵犯人體免疫防御系統(tǒng)免疫激活和營養(yǎng)限制免疫病理釋放調控因子, 例如 sigma factors釋放抗原性蛋白改變營養(yǎng)需要改變細胞壁1

4、1微生物和人類Very few microbes arealways pathogenicMany microbes arepotentially pathogenicMost microbes arenever pathogenic12potential pathogen isolated from or detected in clinical samples Recognised syndromes patients clinical condition e.g. septicaemia, endocarditis,osteomyelitis meningitis,UTI, pneumo

5、niapharyngitis我們如何知道特定的病原微生物致病?診斷和有效的治療不僅依靠分離病原微生物，而且在于建立實驗室和病人臨床癥狀的聯(lián)系13如何推測特定病原體可以致病?Kochs 推測病原體必須在每一例病例中都出現病原體可以從宿主中分離并且可以在純培養(yǎng)基中生長當特定的病原體接種到健康機體時特定的疾病會發(fā)生病原微生物可以在實驗動物中恢復14Spectrum of virulencepoliomyelitis in a child0.1-1% of infections are clinically apparentrubella50% of infections are clinically

6、 apparentrabies100% of infections are clinically apparent傳染性疾病的冰山理論asymptomatic infectionclassical clinical diseaseless severe disease15水庫理論發(fā)病人數死亡人數治愈人數現有病人數16痰涂片鏡檢的操作原理17分枝桿菌的發(fā)現歷史1590 年荷蘭楊森父子發(fā)明了顯微鏡19世紀末,顯微鏡技術、染色技術已應用于微生物檢測,分枝桿菌的發(fā)現條件已成熟在發(fā)現結核菌前,科霍已是一位在微生物學方面取得豐碩成果的學者.18Robert Koch 第一個證明細菌可以致病1876傳染病的

7、微生物病因學病因學 - 疾病的病因建立 “科學規(guī)則” 來確定微生物和疾病的病因和效應關系Kochs 原理19Koch確定了3個重要疾病的病因 1. 霍亂 (fecal-oral disease)Vibrio cholerae2. 結核病 (pulmonary infection)Mycobacterium tuberculosis3. 炭疽(sheep and cattle)Bacillus anthracis20結核病Figure 24.9結核分枝桿菌：棒狀抗酸菌. 可以在人與人之間傳播牛型結核桿菌: 美國的病例數,不在人與人之間傳播鳥胞內分枝桿菌，可以感染 AIDS晚期患者21分辨率和對比

8、度人的肉眼不能看清小于0.1毫米的物體普通光學顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體電子顯微鏡不能看清小于0.1納米的物體22光學顯微鏡的基本原理為區(qū)分物體不同的兩點,這兩點的光學成像必須落在視網膜上不同的感光細胞上;顯微鏡下,光線經過顯微鏡物鏡折射成倒立放大的實像,然后經目鏡折射成正立放大的虛像;經顯微鏡放大后,人眼就可以區(qū)分物體不同的兩點,以達到觀察微小物體的目的;由于光線衍射的原因,普通光學顯微鏡不能區(qū)別小于0.2微米的物體；23電子顯微鏡下的結核分枝桿菌24生理條件下細菌的表面往往帶有大量負電荷 原因：細菌表面帶有正負電荷的基團，等電點多在PH以下，因此在中性或堿性條件下細菌的表面往往帶有

9、大量負電荷25染色反應Stains - salts composed of a positive and negative ion, one of which is colored (chromophore)堿性染料 著色基團帶正電荷dye+ Cl-酸性染料 著色基團帶正電荷Na+ dye-26分枝桿菌涂片鏡檢基本原理、待檢標本中存在分枝桿菌，即受檢者排菌、分枝桿菌的特殊結構決定了染色方法：染色劑 細菌表面帶負電荷,與堿性復紅易于結合,加熱 加深分枝桿菌著色程度脫色 為了易于鏡檢，應該使抗酸菌以外的所有物質近乎完全脫色復染 提供一個良好的對比，隱去背景中殘留的紅色，但不掩蓋抗酸菌。而且，復染既

10、要使涂片的背景易于鏡檢時調焦，同時又不能太深以至分散太多注意力27結核菌感染及排出示意圖28結核病29結核病30細胞壁革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌分枝桿菌脂質雙分子肽聚糖MYCOLATElipid + LPSporinsacyl lipidsarabinogalactaLAM31細胞膜兩種主要結構成分雙層磷脂double layer of phospholipids蛋白質proteins3233 Cell Membrane341. 痰涂片操作程序原理2. 二甲苯問題35 假陰性 假陽性技術錯誤 涂片: 太薄/太厚、暴露在紫外線下 標本中的混雜物質 / 加熱時間過長 / 使用污染的木簽 染色: 染色

11、質量不佳、未熱染、染色時 結晶/環(huán)境抗酸菌、 間太短、脫落、涂片未固定 交叉污染 脫色: 脫色不佳 脫色不佳 復染: 過染 染色不佳鏡檢員 視力缺陷、僅觀察少數視野、 經鏡油交叉污染讀片錯誤： 未經培訓 未經培訓記錄/報告： 記錄錯誤 記錄錯誤產生錯誤結果的常見原因36細菌感染的診斷病人臨床診斷血液生化Non-microbiological investigations 影像學標本分泌物 標本 37實驗室檢查是臨床診斷的必要環(huán)節(jié)38OUTLINE細菌學診斷 顯微鏡檢查術 培養(yǎng)免疫學診斷分子生物學診斷 Gen Probe 噬菌體檢測方法 HPLC 其他39結核分枝桿菌的細菌學診斷培養(yǎng)on pla

12、tes or in broth identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony顯微鏡檢查脫色復染染色unstained or stained with e.g. Gram stain 藥敏血清學DNA 方法by disc diffusion methods, breakpoints or MICs 40顯微鏡檢查Gram-染色抗酸染色Ziehl-Neelsen熒光染色Direct, e.g. auramineImmunofluorescence41培養(yǎng)Solid media

13、Agar platesFor IdentificationFor EnumerationSlopesFor safe long-term culture, e.g. Lowenstein-Jensen media for TBLiquid media (broth)For enrichment or maximum sensitivity42菌種鑒定形態(tài)學生長條件生化反應酶抗原分子生物學方法43非培養(yǎng)的診斷方法血清學檢測分子生物學方法其他（HPLC） 44什么是分子生物學診斷方法 ?為什么用分子生物學診斷方法 ?可得的分子生物學方法?2022/7/2545討論的議題45分子生物學方法是傳統(tǒng)方法

14、的必要補充顯微鏡檢查有假陽性 - T.vaginalis, N.gonorrhoeae胞內致病菌 viruses, M.genitalium 低敏感性 Chlamydia sp.,Neisseria sp.慢速生長 M. tuberculosis 46分子生物學方法 如何發(fā)揮作用?每個微生物擁有一些種屬特異的DNA序列分子生物學方法使得種屬特異性DNA可以衡量法醫(yī)鑒定47分子生物學方法是一系列DNA初級結構的方法雜交的互補序列方法擴增合成種屬特異的DNA序列-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G- T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A

15、-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G-48PCR 實驗室標本處理DNA 準備 潔凈屋儲存溶液混合點熱循環(huán)和擴增 檢測 QC & QA質量控制 和質量保證 R & DAlternatives: - commercial kits - robots + kitsNo alternative49 Bactec放射呼吸測定 以含有放射標記的軟脂酸為底物的液體培養(yǎng)基，自動測量分枝桿菌代謝14C軟脂酸脫致過程中釋放的14CO2的量。該法藥敏報告可縮短為4一12天。 分枝桿

16、菌生長指示管法 Bactec放射呼吸測定法的替代方法。以培養(yǎng)基中加入熒光釕復合物代替放射性標記，其熒光衰減與細菌代謝過程中O2的消耗量有關。熒光衰減可通過一系列不同的紫外透照管檢測。Bactec呼吸測定50流式細胞儀測定法 原理: 分枝桿菌細胞內的非特異性脂酶能水解培養(yǎng)基中加入的熒光素復合物(FDA)為游離的熒光素，因而分枝桿菌在生長過程中可造成熒光素的堆積，經FCM即可檢測到。51比色法 MTT法 MTT法為線粒體琥珀酸脫氫酶的作用底物，可被活細胞還原形成不溶性的Formazan產物,其生成量與活細胞數量成正相關。Formazan經溶解后，可在酶標儀上測定其光吸收值。 微孔板美蘭比色法 美蘭

17、為耗氧指示劑，有氧時為藍色，無氧時為粉紅色。Franzblau等以美蘭為指示劑在96孔微量板中培養(yǎng)細菌，培養(yǎng)基中加入抗結核藥物，微量板用Parafilm封口膜封閉。若細菌為藥物敏感株，可被加入的抗結核藥物抑制或殺死，首先表現為氧消耗停止。而耗氧指示劑在各獨立微小隔氧環(huán)境中的頗色變化可客觀反映氧被消耗的程度，從而反映細菌的生長狀態(tài)。52噬菌體生物擴增法 將分枝桿菌噬菌體感染結核分枝桿菌，未進入菌體內的噬菌體用特異的杭噬菌體物質滅活，進入菌體內的噬菌體得到保護而復制增殖，溶菌后釋放子代噬菌體，將此噬菌體與快速生長的恥垢分枝桿菌混合，接種在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察蝕斑的產生。蝕斑的數量與噬菌體數量有關

18、，也與在含抗結核藥物培養(yǎng)基上存活的結核分枝桿菌數有關。噬菌體法（Fast flaque)53噬菌體熒光素酶檢測法 Jacobs等將熒火蟲熒光素酶基因導入分枝桿菌噬菌體，這種噬菌體感染分枝桿菌后，熒光素酶基因被代謝活躍的分枝桿菌活化，在菌細胞內ATP存在的條件下，可產生光子，通過熒光檢測器測定發(fā)光信號。只有耐藥的分枝桿菌才能在含藥的培養(yǎng)墓上生長，產生光子，敏感菌和死亡菌不產生或產生后不能維持。 54 噬菌體生物擴增法原理示意圖55Gen Probe 方法檢測結核分枝桿菌1.原理2.菌種鑒定56RNA/RNA錯配法 Nash等(1997)首先將該法用于RFP耐藥菌株培養(yǎng)物的檢測。該法是基于雙鏈RN

19、A能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。將待檢菌株以及藥物敏感的參考菌株(H37Rv)的PCR產物混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通過轉錄形成兩條RNA，在進行雜交，若待檢測株為敏感株，則形成兩條互補的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待檢測菌株有突變發(fā)生，則不能與參考株RNA鏈完全配對，加入RNA酶后，雜交產物將在突變位點被切開，通過電泳即可檢測到。 57RussiaBrazilTokyoSwedenBirkhaugDanishPragueGlaxoTiceFrappierConnaughtPhippsPasteur分枝菌酸(HPLC)AlphaMethoxyKeto300 bp

20、200 bp100 bpBehr et al. J Bacteriol, 200058DNA 測序法Hirano等應用DNA測序法 DNA測序法被認為是檢測變異的“金標準”，可檢測出待檢基因上的所有突變位置和突變情況。利用PCR法擴增待檢基因，PCR產物可直接測序，24一48h即可提供精確序列，并準確判定堿基突變的位點，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐藥基因的檢測。59基因芯片 基因芯片 將耐藥基因的DNA或寡核苷酸序列標記到芯片上，從而快速的檢測出突變位點，可以在3個小時內完成。 60基因組學的問題多樣性 單核苷酸多態(tài)性,復制子,缺失,重排株水平差異和種屬特異性基因的作用是什么?基因的功能通常是未知的主要是根據同類中的功能來推論翻譯成效應分子信息如何引導診斷、預防、治療疾病61M. tuberculosis H37Rv 440萬堿基對 3924 預測基因 65.6