杜鵑基因組微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建

1、杜鵑基因組微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2015.03.030Constructing Microsatellite-enriched Library of Rhododendron simsii Planch.WANGShu-zhen ，JIN Wei-bin ，XIANGJun，ZHENGYong-liang ， FANG Yuan-ping ，GAN Jian-ping ， CHENG Hu，a DU Hang(Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement a

2、nd Resource Comprehensive Utilization/College of Life Science， Huanggang NormalUniversity ， Huanggang 438000 ， Hubei ， China )： ( AG)n microsatellite-enriched library of Rhododendron simsii Planch. was constructed by FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences COntaining repeats ) method. Among356 posit

3、ive colonies verified by colony PCRof (AG) n microsatellite-enriched library， 233 colonies werechosen for further sequencing. Results showed that 202 colonies contained microsatellites ，accounting for 86.7%. Discarding sequences with miscellaneous peak ，overlapping peaks and weak signal ， 39 sequenc

4、es were selected for primer exploitation. The perfect ， imperfect and compound microsatellite repeat types were 22 ， 5 and 12 ， respectively. The FIASCO method was efficient for constructing the enrichment library of R. simsii Planch. microsatellite. It will lay foundation for developing microsatell

5、ite markers and studying genetic diversity and genetic structure of Rhododendron species.杜鵑花( Rhododendron spp. )泛指杜鵑花科( Ericaceae ) 杜鵑花屬(Rhododendron)植物，具有極高的觀賞價(jià)值，并被譽(yù) 為“花中西施”和“木本花卉之王” 1， 2 。杜鵑花在亞洲、歐 洲、北美洲等地廣泛分布， 并且因氣候條件不同而垂直分布明顯， 從而形成了常綠大喬木、常綠小喬木、常綠灌木、落葉灌木等不 同形態(tài)特征的地理居群 3 。杜鵑花兼有美學(xué)觀賞、生態(tài)保護(hù)、 藥用治療、科學(xué)研究等

6、價(jià)值 1 。杜鵑花屬近 1 000 種，中國有 571種，其中特有種多達(dá) 400 多個(gè)4 。在中國，云南、西藏、 四川三省 (自治區(qū)) 交匯處的橫斷山脈是世界杜鵑花的發(fā)源地和 分布中心 5 。近幾年來，在氣候變化與人類活動日漸加劇的大 背景下， 杜鵑花的種質(zhì)資源也受到不同程度的影響， 甚至出現(xiàn)退 化現(xiàn)象。因此，亟須對現(xiàn)有的杜鵑花資源進(jìn)行科學(xué)的評價(jià)，并制 定切實(shí)可行的遺傳保護(hù)策略。微衛(wèi)星( Microsatellite )，又稱簡單重復(fù)序列( Simple sequenee repeat , SSR，是以16 bp核苷酸為重復(fù)單位且均 勻分布于生物基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列。 微衛(wèi)星標(biāo)記因其分布廣泛

7、、多態(tài)性強(qiáng)、信息含量豐富、遺傳穩(wěn)定性好、共顯性遺傳等特 點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于作物的遺傳結(jié)構(gòu)分析、 遺傳育種、 圖譜構(gòu)建、 基因定位、親緣關(guān)系分析及種質(zhì)資源鑒定等研究中6-9。Naito等10率先從R. metternichii基因組內(nèi)開發(fā)了 SSR分子標(biāo)記。Tan等11從R. simsii 基因組內(nèi)開發(fā)了 8個(gè)SSR標(biāo)記。Wang 等12從R. decorum基因組內(nèi)開發(fā)了 24個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。Wang等 13從 R. delavayi 和 R. decorum 基因組內(nèi)開發(fā)了 38 對 SSR 引物，其中9對可以跨物種擴(kuò)增。Delmas等14Charrier 等15 用 454 焦磷酸測序技術(shù)從

8、 R. ferrugineum 基因組內(nèi)開發(fā)了 18 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記?，F(xiàn)有的SSR標(biāo)記難以滿足對杜鵑花種群的遺傳變異特征、基因流、種群進(jìn)化歷史、遺傳圖譜構(gòu)建等研究 中對微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量的需求。因此，本研究以(AG)n 為探針構(gòu)建杜鵑花特有種杜鵑( Rhododendron simsii Planch. )的基因 組微衛(wèi)星富集文庫， 旨在為杜鵑花群體遺傳學(xué)分析、 遺傳圖譜構(gòu) 建、花期性狀基因的關(guān)聯(lián)分析、QTL定位等研究提供高效的 SSR標(biāo)記。材料與方法材料材料來源 杜鵑樣品取自湖北省麻城市龜峰山山頂 “杜鵑花王”的幼嫩葉片。 樣品采集后置于自封袋內(nèi)， 并放入冰 盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室置-80 C冰箱備用。

9、試齊ij DNA限制性內(nèi)切酶 Msel、T4 DNA連接酶購自NEB(NewEngland Biolabs )。Taq DNA 聚合酶、dNTPs均購天根生 物公司。鏈霉親和素磁珠 M-280 試劑盒( Dynalbeads M-280 Streptavidin , 112-05D)、磁珠收集器(Dynal MPC 123-20D) 購于Invitrogen ?？寺≥d體pMD18-T購于TaKaRa轉(zhuǎn)化用的大 腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞由經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用 湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。AFLP接頭序列Oligo-Msel-A(5 -TACTCAGGACTCAT-)和 Oligo-Msel

10、-B(5 -GACGATGAGTCCTGA 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)XX公司合成。生物素標(biāo)記的(AQ n探針由Invitrogen 生物公 司合成： 5 -Biotin- (AG 13。Msel-N混合組由上海生工生 物工程技術(shù)服務(wù)XX公司合成：5 -GATGAGTCCTGAGTAAIN- N=A T , G, Co M13通用引物由南京金斯瑞生物公司合成。方法1.2.1基因組DNA提取DNA提取方法參照改良的 CTAB提取法16,并略作修改。提取的“杜鵑花王”基因組DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計(jì)檢測后，記錄原始結(jié)果， 并將基因組DNA稀釋至終濃度為100 ng/卩L,

11、-20 C保存?zhèn)溆?。微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建 參照 FlASCO( Fast lsolation by AFLP of Sequences COntaining repeats)方法構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫17。利用Msel限制性內(nèi)切酶對1卩g的 基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切成功的標(biāo)準(zhǔn)是出現(xiàn)1001 000 bp的彌散帶譜；將酶切后的基因組 DNA 片段回收并加 Mse l 接頭（ Oligo-MseI A 和 Oligo-MseI B ）；利用 Mse I-N 引物對連接 片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增（ 12/14/16/18/20 個(gè)循環(huán)），篩選擴(kuò)增產(chǎn)物剛 剛能在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物（1001 000 bp

12、）;將預(yù) 擴(kuò)增產(chǎn)物先后與 Biotin-（ AG）13 探針和鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行雜交，經(jīng)過系列非嚴(yán)格洗脫和嚴(yán)格洗脫后回收目的DNA片段；對回收的DNA片段進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增，回收200 800 bp的片段，與pMD18-T載體進(jìn)行TA克隆并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 TOP10感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂布在含有氨芐霉素的培養(yǎng)基上。1.2.3陽性克隆的測序及分析 經(jīng)氨芐抗性篩選和IPTG誘 導(dǎo)后，挑取白色克隆。以 M13通用引物進(jìn)行菌液PCR僉測，擴(kuò)增 產(chǎn)物在 1%的瓊脂糖凝膠上電泳分析，挑取擴(kuò)增片段大于500 bp的克隆交由南京金斯瑞生物科技XX公司測序。以M13通用引物進(jìn)行雙向測序，序列比對拼接后用

13、在線軟件 VecScreen （ http ： /VecScreen/ ）去除載體序列和 MseI 接頭序 列。利用軟件 TRF（ Tandem repeat finder ， version 3.2.1）17 查找序列的微衛(wèi)星位點(diǎn)。按照 Weber18 的微衛(wèi)星分類標(biāo)準(zhǔn) 對杜鵑花基因組SSR位點(diǎn)進(jìn)行分類。結(jié)果與分析2.1 提取的杜鵑基因組 DNA提取的“杜鵑花王”基因組 DNA在 0.8%的瓊脂糖凝膠上呈 現(xiàn)比較完整的DNA條帶，條帶大于20 kb，并且無明顯的DNA降 解現(xiàn)象（圖 1）。利用紫外分光光度計(jì)對提取的“杜鵑花王”基 因組DNA進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)改良的 CTAB法所提取的杜鵑花基因組

14、 DNA濃度和純度均比較好， OD260 nm/OD280 nm=1.746 3 DNA勺 濃度為3.76卩g/卩L。因此，提取的DNA適合后續(xù)杜鵑花微衛(wèi) 星富集文庫的構(gòu)建。微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建以及鑒定對1卩g “杜鵑花王”基因組 DNA的酶切結(jié)果見圖2,與未 處理的對照樣品相比，經(jīng) MseI限制性內(nèi)切酶酶切的 DNA呈彌散 帶型，并且大小分布在1001 000 bp之間，符合微衛(wèi)星富集文 庫構(gòu)建的要求。將回收后的酶切片段與 MseI 接頭相連，并對連 接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。根據(jù)文獻(xiàn)資料，設(shè)置不同的循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。 對比發(fā)現(xiàn)， 1 6個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上剛剛能夠呈現(xiàn)， 小于 14個(gè)循環(huán)的擴(kuò)

15、增產(chǎn)物太少而不適合下游的磁珠富集，而多 于 18 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物過多， 會導(dǎo)致下游陽性克隆子重復(fù)出現(xiàn)， 因此選擇16個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物與 Biot in- (AG 13探針進(jìn)行雜 交。經(jīng)多次雜片段的洗脫后，采用95 C預(yù)熱的TE溶液洗脫與探針雜交的目的片段，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，并進(jìn)行TA克隆轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌TOP10細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫。經(jīng)氨芐抗性篩選和 IPTG誘導(dǎo)后，從平板上挑取了 356個(gè)克隆子。經(jīng)菌液PCF檢測， 挑取 233 個(gè)克隆片段大于 500 bp 的克隆交由測序公司測序(圖 3)。測序分析對上述測序的克隆， 舍棄雜峰、信號弱的序列， 最終得到( AG)n 微衛(wèi)星富集文庫的 2

16、02 條序列片段，部分測序結(jié)果見圖 4 。在 富含微衛(wèi)星位點(diǎn)的 202 條序列內(nèi)，有 26 個(gè)序列在微衛(wèi)星位點(diǎn)的 下游出現(xiàn)了疊峰；還有 31 個(gè)序列在微衛(wèi)星位點(diǎn)的上游側(cè)翼序列 過短，不適合后續(xù)的SSR引物設(shè)計(jì)；6個(gè)克隆與其他序列有重復(fù)。 因此，最后挑選了 139 個(gè)序列供后續(xù)研究。利用在線 TRF軟件對 139條微衛(wèi)星序列片段進(jìn)行分析， （ AG）n 文庫內(nèi)序列的 主要重復(fù)類型為（AG n、（GA n、（CT n、（TC）n，以及由 這些微衛(wèi)星重復(fù)單元組成的復(fù)合型微衛(wèi)星。 在所檢測的微衛(wèi)星位 點(diǎn)內(nèi)，重復(fù)次數(shù)最少為 8次，最多可達(dá) 36次，主要重復(fù)次數(shù)分 布在2231之間。不完美型的微衛(wèi)星位點(diǎn)，

17、重復(fù)序列之間插入 的堿基數(shù)為37個(gè)，以胞嘧啶和鳥嘌呤核苷酸堿基居多。復(fù)合 型微衛(wèi)星內(nèi)既有（ TC）n 與（ TA）n 雙堿基重復(fù)的混合類型，也 有（GA門與（AT） n混合的類型，更有 Cn和（CT） n類型的重 復(fù)組合。利用 Primer Premier 5.0 軟件對重復(fù)次數(shù)大于 12 的序列進(jìn) 行分析，有39個(gè)序列能夠設(shè)計(jì)出得分大于 85分的SSR引物，可 用于SSR引物開發(fā)的序列。這39個(gè)序列內(nèi)部的微衛(wèi)星類型、5 核心序列、3端側(cè)翼序列如表1所示。依據(jù) Weber19提出的 標(biāo)準(zhǔn)為序列進(jìn)行分類， 發(fā)現(xiàn)杜鵑的微衛(wèi)星富集文庫內(nèi)以完美型微 衛(wèi)星類型居多：完美型SSR有 22個(gè)，占56.41%

18、;不完美型5個(gè)， 占 12.82%;混合型 SSR有 12 個(gè)，占 30.77%。小結(jié)與討論在湖北麻城的龜峰山風(fēng)景區(qū)內(nèi)，有著連片面積達(dá) 6 000 多公 頃的杜鵑花灌木叢， 建群種主要是杜鵑。 該杜鵑群落的平均樹齡 在100300年之間，而被譽(yù)為“杜鵑花王”的樹齡大于500年，是世界上迄今為止發(fā)現(xiàn)的面積最大、 品種最純、 分布最集中的野 生古杜鵑群落。 龜峰山風(fēng)景區(qū)的杜鵑特有種和變種不僅為湖北省 生態(tài)旅游業(yè)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)， 也為杜鵑的遺傳育種提供了優(yōu)良 的材料 6 。因此，亟須對麻城杜鵑種質(zhì)資源進(jìn)行研究，而 SSR 標(biāo)記的開發(fā)是首要任務(wù)， 微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建則是從基因組信 息未知的物種內(nèi)開發(fā) SSR標(biāo)記的前提。微衛(wèi)星標(biāo)記可以通過基因組分離、 數(shù)據(jù)庫挖掘、 近緣物種轉(zhuǎn) 移等途徑獲得。 微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)是一件繁瑣且耗時(shí)的工作， 傳 統(tǒng)的微衛(wèi)星分離方法效率低且耗時(shí)，陽性率多為0.04%12%20。本研究通過對基因組 DNA的Msel酶切、特定接頭的連 接、Msel-N簡并引物的PCF預(yù)擴(kuò)增、生物素探針雜交、磁珠富 集、多次洗脫、回收目的片段等途徑構(gòu)建了杜鵑花（AG）n 微衛(wèi)星富集文庫，陽性克隆比率高達(dá) 86.7%。在構(gòu)建（AG n文庫的同時(shí)，也同時(shí)利用生物素標(biāo)記的 （AT） 13、