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1、 第十四章 微生物制藥技術(shù) Microbial Medicines微生物學(xué)的奠基人偉大的巴斯德我國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品醬油、醋、腐乳等享譽(yù)世界我國(guó)的釀酒已經(jīng)有4000多年的歷史我國(guó)的醬油距今已有3000年的歷史1857年巴斯德證明發(fā)酵是由于微生物的作用密閉式發(fā)酵罐第一節(jié) 發(fā)酵技術(shù)一、發(fā)酵的概念什么叫發(fā)酵？原始概念：果汁或麥芽谷物受酵母菌作用產(chǎn)生二氧化碳及能量的過(guò)程?，F(xiàn)代概念：將所有通過(guò)微生物或動(dòng)植物細(xì)胞或經(jīng)過(guò)生物工程改造的“工程菌”培養(yǎng)制備工業(yè)產(chǎn)品或轉(zhuǎn)化某些物質(zhì)的過(guò)程。二、微生物發(fā)酵類(lèi)型（一）根據(jù)微生物發(fā)酵過(guò)程是否需要氧氣分類(lèi)1、需氧發(fā)酵2、厭氧發(fā)酵（二）根據(jù)微生物發(fā)酵規(guī)模的不同分類(lèi)1、淺層發(fā)酵（表

2、面培養(yǎng)法）2、深層發(fā)酵（深層培養(yǎng)法）（三）根據(jù)微生物發(fā)酵培養(yǎng)基物理狀態(tài)不同分類(lèi)1、固體發(fā)酵2、液體發(fā)酵1.微生物菌體發(fā)酵 是以獲得具有某種用途的菌體為目的的發(fā)酵。用于面包制作的酵母發(fā)酵及用于人類(lèi)或動(dòng)物食品的微生物菌體蛋白發(fā)酵是比較傳統(tǒng)的菌體發(fā)酵工業(yè)。新的菌體發(fā)酵可用來(lái)生產(chǎn)藥用真菌，如香菇菌、依賴(lài)蟲(chóng)蛹而生存的冬蟲(chóng)夏草菌、與天麻共存的密環(huán)菌等藥用菌。2.微生物酶發(fā)酵 酶普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中。因?yàn)槲⑸锓N類(lèi)多、產(chǎn)酶的品種多、生產(chǎn)容易和成本低等特點(diǎn)，所以目前工業(yè)應(yīng)用的酶大多來(lái)自微生物發(fā)酵。3.微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵 微生物代謝產(chǎn)物很多。在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所產(chǎn)生的產(chǎn)物，如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)和糖類(lèi)

3、等是菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的，這些產(chǎn)物叫做初級(jí)代謝產(chǎn)物。在菌體生長(zhǎng)靜止期，某些菌體能合成一些具有特定功能的產(chǎn)物，如抗生素、生物堿、植物生長(zhǎng)因子等。這些產(chǎn)物與菌體生長(zhǎng)繁殖無(wú)明顯關(guān)系，叫做次級(jí)代謝產(chǎn)物。 （四)、根據(jù)微生物發(fā)酵產(chǎn)品類(lèi)型不同分類(lèi)4.微生物的轉(zhuǎn)化發(fā)酵 微生物的轉(zhuǎn)化是利用微生物細(xì)胞的一種或多種酶，把一種化合物轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物?？蛇M(jìn)行的轉(zhuǎn)化反應(yīng)包括：脫氫反應(yīng)、氧化反應(yīng)、脫水反應(yīng)、縮合反應(yīng)、氨化反應(yīng)、脫氨反應(yīng)等。 5.生物工程細(xì)胞的發(fā)酵 是指利用生物工程技術(shù)所獲得的細(xì)胞，如DNA重組的“工程菌”，細(xì)胞融合所得的“雜交”細(xì)胞等進(jìn)行培養(yǎng)的新型發(fā)酵。此類(lèi)發(fā)酵的產(chǎn)物多種多樣，如用基因工

4、程菌生產(chǎn)胰島素、干擾素等。（一）在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用1.生產(chǎn)出了種類(lèi)繁多的藥品2.發(fā)酵工程對(duì)醫(yī)藥工業(yè)的一個(gè)重大貢獻(xiàn)應(yīng)用發(fā)酵工程大量生產(chǎn)的基因工程藥品，有人生長(zhǎng)激素、重組乙肝疫苗、某些種類(lèi)的單克隆抗體、白細(xì)胞介素2、抗血友病因子等。三、發(fā)酵醫(yī)藥產(chǎn)品1、抗生素類(lèi) 抗生素是一類(lèi)由微生物產(chǎn)生的在低濃度下具有抑制或殺死其他微生物作用的化學(xué)物質(zhì)。 繼Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素后，最杰出的抗生素先驅(qū)是美國(guó)放線菌專(zhuān)家Waksman，他與同事在1941年從放線菌培養(yǎng)液中找到紫放線菌素。接著他又在1944年發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)用于臨床的從放線菌產(chǎn)生的抗生素鏈霉素。由于Waksman開(kāi)拓了尋找新抗生素來(lái)源的途徑，使人們?cè)趦H10

5、年左右的時(shí)間內(nèi)相繼發(fā)現(xiàn)了眾多的抗生素：如1947年找到第一個(gè)廣譜抗生素氯霉素和由細(xì)菌產(chǎn)生的多粘菌素；1948年發(fā)現(xiàn)了金霉素；1949年發(fā)現(xiàn)了新霉素；1950年發(fā)現(xiàn)了制霉菌素和土霉素；1952年發(fā)現(xiàn)了紅霉素；1953年發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素等。到目前為止，世界上已篩選出的抗生素已達(dá)9000種以上，應(yīng)用于臨床治療的在百余種左右（不包括半合成抗生素）。 分類(lèi)方法 種 類(lèi) 舉 例 根據(jù)生物來(lái)源 1由放線菌產(chǎn)生的抗生素 鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素 2由真菌產(chǎn)生的抗生素 青霉素、頭孢菌素 3由細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素 多粘菌素、桿菌肽 4由植物及動(dòng)物產(chǎn)生的抗生素 地衣酸、綠藻素、大蒜素 分類(lèi)方法種 類(lèi) 舉 例 根據(jù)抗生素的作用

6、對(duì)象 1抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的抗生素 青霉素、紅霉素、新霉素 2抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗生素 多粘菌素 3抗真菌的抗生素 放線酮、制霉菌素、灰黃霉素、兩性霉素 4抗腫瘤的抗生素 放線菌素D、絲裂霉素、博萊霉素、阿霉素 5抗結(jié)核分枝桿菌的抗生素 鏈霉素、新霉素、卡那霉素 6抗病毒和噬菌體的抗生素 艾霉素（ehrlichin） 7抗原蟲(chóng)的抗生素 嘌呤霉素、巴龍霉素 分類(lèi)方法種 類(lèi) 舉 例 根據(jù)抗生素的作用機(jī)制1抑制細(xì)胞壁合成的抗生素 青霉素、瑞斯托菌素2影響細(xì)胞膜功能的抗生素 制霉菌素、兩性霉素 3抑制核酸合成的抗生素 絲裂菌素、博來(lái)霉素、柔紅霉素 4抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素 鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、氯霉素

7、 5抑制生物能作用的抗生素 抗霉素（抑制電子轉(zhuǎn)移）短桿菌肽（抑制氧化磷酸化） 6. 影響細(xì)胞內(nèi)Na+、K+平衡的抗生素 鹽霉素 2、維生素類(lèi)藥物 目前采用微生物技術(shù)生產(chǎn)的維生素類(lèi)藥物及其中間體有維生素B2（核黃素）、維生素B12（氰鈷氨素）、2-酮基-L-古龍酸（維生素C原料）、-胡蘿卜素（維生素A前體）、麥角甾醇（維生素D2前體）等。 3、氨基酸類(lèi) 目前氨基酸主要用于生產(chǎn)大輸液及口服液，有些氨基酸尚有其特殊用途。如精氨酸鹽及谷氨酸鈉亦用于肝性昏迷的臨床搶救，解除氨毒。L-谷氨酰氨用于治療消化道潰瘍，L-組氨酸亦為治療消化道潰瘍輔助藥等。 4、核苷酸類(lèi)藥物 以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸類(lèi)物質(zhì)是60

8、年代后逐步發(fā)展起來(lái)的。核苷酸類(lèi)物質(zhì)和氨基酸等類(lèi)似，是微生物的初級(jí)代謝產(chǎn)物，它們?cè)谏矬w內(nèi)受到嚴(yán)密的調(diào)節(jié)和控制，因此，用于工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)生菌都是經(jīng)過(guò)選育的突變株。用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的核苷酸類(lèi)藥物及其中間體有肌苷酸、肌苷、5-腺苷酸（AMP）、三磷酸腺苷（ATP）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、輔酶A（CoA）、輔酶I（CoI）、二磷酸胞苷（CDP）、膽堿等。 5、醫(yī)療用酶 以微生物作為酶源具有生產(chǎn)周期短，成本低的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)環(huán)境改變或遺傳變異，有可能大大提高酶的活性和產(chǎn)量?；蚬こ碳夹g(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，使得微生物體可生產(chǎn)其自身沒(méi)有的，甚至是自然界不存在的特殊蛋白質(zhì)和酶，大大擴(kuò)展了微生物發(fā)酵技

9、術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。酶工程技術(shù)的迅速發(fā)展和應(yīng)用，也極大地促進(jìn)了對(duì)微生物酶的研究和開(kāi)發(fā)。目前可用發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)的治療用酶有：鏈激酶、膠原酶、脂肪酶、纖維素酶、天冬酰胺酶、葡聚糖酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶等。 6、甾體類(lèi)激素 用微生物所進(jìn)行的甾體轉(zhuǎn)化主要有羥化、脫氧、加氫、環(huán)氧化等反應(yīng)以及側(cè)鏈或母核開(kāi)裂反應(yīng)等。目前可的松、氫化可的松、潑尼松、地塞米松及確胺舒松等甾體激素化學(xué)合成工藝中，已有反應(yīng)可用微生物轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)，并有良好的發(fā)展前景。 發(fā)酵工程的應(yīng)用（二）在食品工業(yè)上的應(yīng)用主要包括以下三方面。第一，生產(chǎn)傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品，如啤酒、果酒、食醋等，使產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量得到明顯的提高。第二，生產(chǎn)各種食品的添加劑。第

10、三，幫助解決糧食問(wèn)題。 谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑谷氨酸是味精的主要成分第三節(jié) 菌體制劑一、中藥菌體制劑1、靈芝2、冬蟲(chóng)夏草二、藥用酵母三、微生態(tài)制劑谷氨酸棒狀桿菌合成谷氨酸的途徑 谷氨酸棒狀桿菌在一定的條件下能夠利用環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)合成谷氨酸。 在工廠里是怎樣應(yīng)用谷氨酸棒狀桿菌來(lái)生產(chǎn)谷氨酸的？ 1、選擇菌種 是不是所有的谷氨酸棒狀桿菌都可用于谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)呢？我們應(yīng)該選育什么樣的谷氨酸棒狀桿菌作為菌種呢？只有選擇細(xì)胞膜通透較強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)不積累谷氨酸的谷氨酸棒狀桿菌做菌種才有可能獲得大量的谷氨酸。 2、培養(yǎng)基的配制有了菌種用什么樣的培養(yǎng)基去培養(yǎng)呢？培養(yǎng)基應(yīng)滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)所需要的碳源、氮源

11、、水、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)需求。這種培養(yǎng)基從組成成分和物理性質(zhì)上看屬于哪種培養(yǎng)基?從物理性質(zhì)上看是液體培養(yǎng)基，從化學(xué)成分上看是天然培養(yǎng)基。成分酸堿度豆餅水解液、玉米漿、尿素、磷酸二氫鉀、氧化鉀、硫酸鎂、生物素pH：783、滅菌配制好培養(yǎng)液后，是否可以立即加入菌種？不能需要進(jìn)行滅菌 將培養(yǎng)液投放到發(fā)酵罐中，通入98kPa的蒸汽進(jìn)行滅菌4、接種是否可以將所選擇的優(yōu)良谷氨酸棒狀桿菌直接加入發(fā)酵罐中？大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)需要大量的菌種，應(yīng)先經(jīng)過(guò)多次擴(kuò)大培養(yǎng)用于生產(chǎn)的菌種應(yīng)選擇處于哪個(gè)時(shí)期的谷氨酸棒狀桿菌？對(duì)數(shù)期5、發(fā)酵發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)該注意控制好哪些條件？溫度pH氧氣培養(yǎng)過(guò)程中不斷進(jìn)行攪拌的目的是什么？ _

12、使空氣形成細(xì)小氣泡，迅速溶解在培養(yǎng)液使培養(yǎng)液和菌種充分接觸，提高原料的利用率谷氨酸棒狀桿菌是好氧菌6、分離提純溫度30-37C，pH7-8，經(jīng)過(guò)28-32h，培養(yǎng)液中就會(huì)產(chǎn)生大量的谷氨酸50-100g/L提取出谷氨酸用適量的Na2CO3溶液中和過(guò)濾濃縮離心味精發(fā)酵工程的概念和內(nèi)容 （一）發(fā)酵工程的概念采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類(lèi)生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或者直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的一種新技術(shù)。發(fā)酵工程的概念和內(nèi)容（二）發(fā)酵工程的內(nèi)容菌種的選育培養(yǎng)基的配制滅菌擴(kuò)大培養(yǎng)和接種發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)品的分離提純等菌種的選育要想通過(guò)發(fā)酵工程獲得在種類(lèi)、產(chǎn)量和質(zhì)量等方面符合人們要求的產(chǎn)品，最重要

13、的是要有優(yōu)良的菌種。怎樣才能得到優(yōu)良的菌種呢？如果生產(chǎn)的是微生物直接合成的產(chǎn)物可以從自然界中先分離出相應(yīng)的菌種，再用物理或化學(xué)的方法使菌種產(chǎn)生突變，從突變個(gè)體中篩選出符合生產(chǎn)要求的優(yōu)良菌種。如果生產(chǎn)的是一般微生物不能合成的產(chǎn)品 可用基因工程、細(xì)胞工程的方法對(duì)菌種的遺傳特性進(jìn)行定向改造，以構(gòu)建工程細(xì)胞或工程菌，從而達(dá)到生產(chǎn)相應(yīng)產(chǎn)品的目的 培養(yǎng)基的配制 要進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，有了優(yōu)良的菌種還需要有與菌種相適應(yīng)的培養(yǎng)基。在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)該注意哪些事情呢？ （1）目的要明確。根據(jù)不同的菌種，應(yīng)選擇不同的材料配制培養(yǎng)基。配制的培養(yǎng)基應(yīng)滿(mǎn)足微生物在碳源、氮源、生長(zhǎng)因子、水、無(wú)機(jī)鹽等方面的營(yíng)養(yǎng)要求。（2）培養(yǎng)基的

14、營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)，以利于產(chǎn)物的合成。（3）pH要適宜。滅菌 發(fā)酵工程所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不能混入雜菌。這是為什么呢？在發(fā)酵過(guò)程中如混入其他微生物，將與菌種形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，對(duì)發(fā)酵過(guò)程造成不良影響。例如：如果在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中混入放線菌，則放線菌分泌的抗生素就會(huì)使大量的谷氨酸棒狀桿菌死亡。如果在青霉素生產(chǎn)過(guò)程中污染了雜菌，這些雜菌則會(huì)分泌青霉素酶，將合成的青霉素分解掉。滅菌 要在發(fā)酵前對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)施進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。怎樣才算滅菌徹底呢？ 用高溫、高壓的方式，殺死所有雜菌的胞體、芽孢和孢子。 擴(kuò)大培養(yǎng)和接種 在大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)中，需要將選育出的優(yōu)良菌種經(jīng)過(guò)多次擴(kuò)大培養(yǎng)，讓他們達(dá)到

15、一定數(shù)量以后，再進(jìn)行接種。 接種過(guò)程防止雜菌污染。發(fā)酵過(guò)程 將菌體接種到裝有培養(yǎng)液的發(fā)酵罐中，還需要對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行控制。發(fā)酵過(guò)程中要隨時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)菌數(shù)目、產(chǎn)物濃度以了解發(fā)酵進(jìn)程，及時(shí)添加必需的培養(yǎng)基成分來(lái)延長(zhǎng)菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期的時(shí)間，以得到更多的發(fā)酵產(chǎn)物。同時(shí)，還應(yīng)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行嚴(yán)格控制。 發(fā)酵過(guò)程哪些條件能影響菌體的發(fā)酵呢？發(fā)酵生產(chǎn)中溫度、pH、溶氧量、轉(zhuǎn)速等對(duì)發(fā)酵過(guò)程有重大影響。（哪些影響？）想一想：發(fā)酵過(guò)程中溫度升高的熱量來(lái)源？ 哪些因素會(huì)影響pH值？ 溶氧量的控制？分離、提純 菌體本身，如酵母菌和細(xì)菌等采用過(guò)濾、沉淀等方法將菌體從培養(yǎng)液中分離出來(lái)代謝產(chǎn)物采用蒸餾

16、、萃取、離子交換等方法進(jìn)行提取。7、酶抑制劑 臨床上應(yīng)用較早的酶抑制劑是由棒狀鏈霉菌產(chǎn)生的-內(nèi)酰胺酶抑制劑。-內(nèi)酰胺酶能水解青霉素等-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的酰胺鍵，從而使這類(lèi)抗生素失活，這是細(xì)菌對(duì)這類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。棒酸等-內(nèi)酰胺酶抑制劑自身抗菌活性不強(qiáng)，但它們與-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素聯(lián)合使用時(shí)，卻能顯著地增強(qiáng)后者的治療效果。目前兩者的復(fù)方制劑已廣泛應(yīng)用于臨床。 另一類(lèi)由微生物產(chǎn)生的酶抑制劑是-羥基-甲基-戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑。1976年日本遠(yuǎn)藤等報(bào)道從桔青霉的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有抑制HMG-CoA還原酶活性的物質(zhì)ML-236B（compactin），此后，在紅色紅曲

17、霉、土曲霉中相繼發(fā)現(xiàn)活性更強(qiáng)HMG-CoA還原酶抑制劑，后證實(shí)其主要成分為同一物質(zhì)，即洛伐他丁。1983年Serizawa等報(bào)道，通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化ML-236B而獲得一個(gè)新的羥基化的化合物，稱(chēng)為普伐他丁。目前發(fā)現(xiàn)的HMG-CoA還原酶抑制劑有數(shù)十個(gè)，其中已有三個(gè)作為降血脂藥物應(yīng)用于臨床。這類(lèi)藥物針對(duì)性強(qiáng)、療效顯著、毒副作用少、耐受性好而受到廣泛重視和好評(píng)。 實(shí)際上目前開(kāi)發(fā)中的微生物來(lái)源的酶抑制已涉及降血脂、降血壓、抗血栓、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥等各種藥物領(lǐng)域，這也是當(dāng)前微生物藥學(xué)研究中的熱門(mén)方向8、免疫調(diào)節(jié)劑免疫調(diào)節(jié)劑包括免疫抑制劑及免疫增強(qiáng)劑。 環(huán)孢菌素A是第一個(gè)在器官移植中廣泛應(yīng)用的免疫抑制