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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。zhidaoshu生物化學(xué)實驗指導(dǎo)書適用專業(yè)：生物技術(shù)、生物工程、食品科學(xué)與工程生物與食品工程學(xué)院生物科學(xué)系生物化學(xué)實驗細則為了保證生物化學(xué)實驗的順利進行，培養(yǎng)同學(xué)們掌握良好、規(guī)范的生物化學(xué)基本實驗技能，特制定以下實驗細則，請同學(xué)們嚴(yán)格遵守。實驗前應(yīng)提前預(yù)習(xí)實驗指導(dǎo)書并復(fù)習(xí)相關(guān)知識。嚴(yán)格按照生物化學(xué)實驗分組，分批進入實驗室，不得遲到。非本實驗組的同學(xué)不準(zhǔn)進入實驗室。進入實驗室必須穿實驗服。各位同學(xué)進入各自實驗小組實驗臺后，保持安靜，不得大聲喧嘩和嬉戲，不得無故離開本實驗臺隨便走動。絕對禁止用實驗儀器或藥

2、物開玩笑。實驗中應(yīng)保持實驗臺的整潔，廢液倒入廢液桶中，用過的濾紙放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或隨地亂丟。實驗中要注意節(jié)約藥品與試劑，愛護儀器，使用前應(yīng)了解使用方法，使用時要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，不得擅自移動實驗儀器。否則，因非實驗性損壞，由損壞者賠還。使用水、火、電時，要做到人在使用，人走關(guān)水、斷電、熄火。做完實驗要清洗儀器、器皿，并放回原位，擦凈桌面。實驗后，要及時完成實驗報告。2006年1月目錄生物化學(xué)實驗細則1目錄2實驗1蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng)3實驗2醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白6實驗3SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量11實驗4凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)分子量16實驗5DNA的瓊

3、脂糖凝膠電泳20實驗6唾液淀粉酶的性質(zhì)和活力測定24實驗7生物氧化與電子傳遞25實驗8植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用27實驗1蛋白質(zhì)的沉淀、變性反應(yīng)（3學(xué)時）目的要求1.加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認識。2.了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義。3.了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。原理在水溶液中，蛋白質(zhì)分子表面形成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的膠體顆粒，所以蛋白質(zhì)溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質(zhì)膠體顆粒的穩(wěn)定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態(tài)形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。這種反應(yīng)可分為以下兩種類型：1可逆沉淀反應(yīng)在發(fā)生沉淀

4、反應(yīng)時，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但它的分子內(nèi)部、空間結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)，沉淀因素除去后，能再溶于原來的溶劑中。這種作用稱為可逆沉淀反應(yīng)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)以及利用等電點的沉淀，提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應(yīng)。2不可逆沉淀反應(yīng)在發(fā)生沉淀反應(yīng)時，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來的天然性質(zhì)，這時蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來溶劑中的作用稱為不可逆沉淀反應(yīng)。重金屬鹽、生物堿試劑，強酸、強堿、加熱、震蕩、超聲波、有機溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存

5、在（如電荷）并不析出，因此，變性蛋白質(zhì)不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。試劑和器材一、試劑1.蛋白質(zhì)溶液：10ml/組取5ml雞或鴨蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻后用48層紗布過濾，新鮮配置。2.蛋白質(zhì)氯化鈉溶液：3ml/組取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻后，以紗布濾去不溶物（加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白）。3.其余試劑：硫酸銨粉末（10克/組），飽和硫酸銨溶液(150ml)，3%硝酸銀（280ml），0.5%乙酸鉛（200ml），濃硫酸（5ml/組），5%磺基水楊酸（100ml），0.1%硫酸銅（100ml），飽和硫酸銅溶液（4

6、00ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），飽和氯化鈉溶液（25ml），10%氫氧化鈉溶液（500ml）。二、器材試管（15支/組），過濾漏斗（1個），試管架1個/組，玻璃棒1支/組，沸水浴4臺，量筒（總需要20ml1,200ml1），燒杯（總需要100ml2，4002），試劑瓶（12個/組，附膠頭滴管10支/組），移液管（5ml6/組，1ml3/組），濾紙1盒，洗瓶1個/組，廢液缸1個/組，藥匙1個/組，移液管架1個/組操作方法一、蛋白質(zhì)的可逆沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)的鹽析作用(分級鹽析)二、蛋白質(zhì)的不可逆沉淀反應(yīng)1.重金屬沉淀蛋白質(zhì)2.酸沉淀蛋白質(zhì)1）2）3.加熱沉淀蛋白質(zhì)取5

7、支試管，編號，按下表加入有關(guān)試劑（單位/滴）。試劑管號蛋白質(zhì)溶液0.1%乙酸10%乙酸飽和氯化鈉10%氫氧化鈉蒸餾水123451010101010555227225將各管混勻，觀察記錄各管現(xiàn)象后，放入沸水浴中加熱10min，比較各管的沉淀情況。思考題1.名詞解釋：水化層；雙電層；蛋白質(zhì)變性；鹽溶與鹽析；蛋白質(zhì)等電點沉淀。2.將實驗結(jié)果寫在實驗報告中操作方法的對應(yīng)位置上并就實驗現(xiàn)象作簡要解釋。3.根據(jù)實驗現(xiàn)象，討論下列問題：蛋白質(zhì)可逆沉淀與不可逆沉淀的本質(zhì)區(qū)別是什么？簡述蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)、變性作用和凝固作用的相互關(guān)系。4.作為殺菌劑，氯化汞是怎樣起作用的？實驗2醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白（4

8、學(xué)時）目的要求學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)電泳的一般原理及方法。掌握用醋酸纖維素薄膜電泳分離蛋白質(zhì)的操作技術(shù)。原理帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。帶電顆粒之所以能在電場中向一定的方向移動，并具有一定的遷移速度，是取決于帶電顆粒本身性質(zhì)的影響，以及電場強度、溶液的pH值、離子強度及電滲等因素的影響。蛋白質(zhì)具有兩性性質(zhì)，在溶液中可解離的基團除肽鏈末端的氨基和羧基外，還有很多側(cè)鏈基團在一定的pH條件下能解離而使蛋白質(zhì)帶電。當(dāng)溶液的pHpI（等電點）時，蛋白質(zhì)帶負電荷，在電場中向正極移動，而的pHpI時，則帶正電荷，電泳時向負極移動。由于蛋白質(zhì)分子在溶液中解離成帶電的顆粒，所以在電

9、場中除等電點外均能定向泳動，其電泳的方向和速度主要決定于所帶電荷的性質(zhì)，以及所帶電荷數(shù)量、顆粒大小和形狀。不同的帶電顆粒在同一電場中泳動速度不同，常用遷移率來表示。遷移率的定義是指帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。其計算公式如下：式中：m為遷移率（cm2/Vs）；v為顆粒的泳動速度（cm/s）；E為電場強度（V/cm）；為顆粒泳動的距離（cm）；為支持物的有效長度（cm）；V為實際電壓（V）；t為電泳時間（s）。各種蛋白質(zhì)的等電點、分子量及顆粒大小各不相同，在某一指定的pH值溶液中，各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，因而在電場中遷移的方向和速度不同。根據(jù)這個原理，就可以從蛋白質(zhì)混合物中將各種蛋白質(zhì)分

10、離出來。因此，電泳技術(shù)在生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中被廣泛用于生物大分子或小分子（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等）的分離純化與分析鑒定等。同時此項技術(shù)也普遍用于臨床診斷和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，并已發(fā)展成為這些部門的重要分析分離手段。醋酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維素薄膜為支持物的一種區(qū)帶電泳。這種薄膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，厚度為120m，滲透性強，對樣品無吸附作用，用它作支持物進行電泳，電泳效果比紙電泳好，具有樣品用量少，分離速度快，電泳圖譜更為清晰，靈敏度也較高（5g/ml以上）等優(yōu)點。目前已廣泛應(yīng)用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測定等方面。本實驗以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離各種血清蛋

11、白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點及形狀不同（如圖2-1），在電場中遷移速度不同。分子量小、等電點低、在相同堿性pH緩沖體系中、帶負電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場中遷移速度快。例如，正常人血清在pH8.6的緩沖體系中電泳1h左右，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動最快，其余依次為1，2，-及-球蛋白（如圖2-2）。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度法定量，也可直接進行光吸收掃描自動繪出區(qū)帶吸收峰及相對百分比。臨床醫(yī)學(xué)常利用它們間相對百分比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。蛋白質(zhì)名稱等電點（pI）分子量清蛋白-球蛋白

12、-球蛋白-球蛋白4.885.065.126.857.50690001-2000002-30000090000150000156000300000圖2-1人血清中5種蛋白質(zhì)的等電點及分子量圖2-2正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖1為清蛋白（或稱為白蛋白），2、3、4、5分別為1-、2-、-及-球蛋白，6為點樣原點試劑和器材一、測試材料未溶血的人或動物血清。二、試劑1.巴比妥巴比妥鈉緩沖液（PH8.6，0.07mol/L，離子強度0.06）：稱取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥鈉（AR），置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600ml，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml。置4保存，備

13、用。2.染色液（0.5%氨基黑10B）：稱取0.5g氨基黑10B，加蒸餾水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml，混勻溶解后置具塞試劑瓶內(nèi)貯存。漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸餾水50ml，混勻置具塞試劑瓶內(nèi)貯存。4.透明液：臨用前制備。甲液：取冰乙酸（AR）15ml，無水乙醇（AR）85ml，混勻置試劑瓶內(nèi)，塞緊瓶塞，備用。乙液：取冰乙酸（AR）25ml，無水乙醇（AR）75ml，混勻置試劑瓶內(nèi)，塞緊瓶塞，備用。5.保存液：液體石蠟。6.定量洗脫液（0.4mol/LNaOH溶液）：稱取16g氫氧化鈉（AR）用少量蒸餾水溶解后定容至1000ml。三

14、、器材醋酸纖維素薄膜（28cm），培養(yǎng)皿（直徑910cm），解剖鑷子，點樣器，直尺和鉛筆，電泳儀及電泳槽，玻璃板（1212cm），試管及試管架，吸量管（2ml，5ml），吹風(fēng)機，普通濾紙。操作方法一、薄膜與儀器的準(zhǔn)備1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇用鑷子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在1530s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點等，則表示薄膜不均勻應(yīng)棄去，以免影響電泳結(jié)果。將選好的薄膜用鑷子輕壓，使其完全浸泡于緩沖液中約30min后，方可用于電泳。電泳槽的準(zhǔn)備根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙

15、條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩各膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端侵入電極緩沖液內(nèi)。當(dāng)濾紙條全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁，因而稱為濾紙橋。電極槽的平衡用平衡裝置（或自制平衡管）連接兩個電泳槽，使兩個電極槽內(nèi)的緩沖液彼此處于同一水平狀態(tài)，一般需平衡1520min，注意，取出平衡裝置時應(yīng)將活塞關(guān)緊。點樣制備點樣模板取一張干凈濾紙（1010cm），在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標(biāo)志區(qū)。點樣用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間輕

16、輕按壓，吸去多余的緩沖液。無光澤面向上平放在點樣模板上，使其底邊與模板底邊對齊。點樣區(qū)距陰極端1.5cm處。點樣時，先用玻片一端截面沾取一定量的血清，然后將沾有樣品的玻片截面垂直地與纖維素薄膜點樣區(qū)處輕輕接觸，樣品即呈一條線“印”在薄膜上，（如圖2-3）使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成細窄而均勻的直線。此步是實驗的關(guān)鍵，點樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點樣技術(shù)后再正式點樣。圖2-3醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖虛線處為點樣位置電泳用鑷子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上，如圖所示。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄

17、膜，則薄膜之間應(yīng)相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。圖2-4電泳裝置剖視示意圖1.濾紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽支架5.電極室中央隔板用導(dǎo)線將電泳槽的正、負極分別連接，注意不要接錯。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，用電泳儀上細調(diào)節(jié)旋扭調(diào)到每厘米膜寬電流強度為0.3mA（8片薄膜則為4.8mA）。通電1015min后，將電流調(diào)節(jié)到每厘米膜寬電流強度為0.5mA（8片共8mA），電泳時間約5080min。電泳后調(diào)節(jié)旋扭使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。染色與漂洗血清蛋白染色與漂洗脫色用解剖鑷子取出電泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中，浸染5min。取出后再用

18、漂洗液浸洗、脫色，每隔10min換漂洗液一次，連續(xù)數(shù)次，直至背景藍色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風(fēng)機的冷風(fēng)將薄膜吹干。五、透明將脫色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即緊貼于干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡。約23min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置待其自然干燥，或用吹風(fēng)機冷風(fēng)吹干且無酸味。再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當(dāng)薄膜完全潤濕后用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最后將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓平。此薄膜透明，區(qū)帶著色清晰，可用于光

19、吸收計掃描。長期保存不褪色。注意事項醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關(guān)鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄均勻，如漂浮1530s時，膜片吸水不均勻，則有白色斑點或條紋，這提示膜片厚薄不均勻，應(yīng)棄去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界限不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重復(fù)。由于醋酸纖維素薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復(fù)到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕走。點樣時，應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴散

20、。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點參差不齊，影響分離效果。吸干的程度以不干不濕為宜。為防止指紋污染，取膜時，應(yīng)戴指套或用夾子。緩沖液的選擇醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥緩沖液，其濃度為0.050.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的厚薄有關(guān)。在選擇時，先初步定下某一濃度，如電泳槽電極之間的膜長度為810cm，則需電壓25V/cm膜長，電流強度為0.40.5mA/cm膜寬。當(dāng)電泳時達不到或超過這個值時，則應(yīng)增加緩沖液濃度或進行稀釋。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，并由于擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。3.

21、加樣量加樣量的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則，檢測方法越靈敏，加樣量越少，對分離更有利。如加樣量過大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費時。如電泳后用洗脫法定量時，每厘米加樣線上需加樣品0.15L，約相當(dāng)5-1000g蛋白。血清蛋白常規(guī)電泳分離時，每厘米加樣線加樣量不超過1L，相當(dāng)于60-80g蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時，加樣量則應(yīng)多些。對每種樣品加樣量應(yīng)先作預(yù)實驗加以選擇。點樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時，動作應(yīng)輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。4.電量的選擇電泳過程應(yīng)選擇合

22、適的電流強度，一般電流強度為0.40.5mA/cm膜寬為宜。電流強度高，則熱效應(yīng)高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散。5.染色液的選擇對纖維素薄膜電泳后應(yīng)根據(jù)樣品的特點加以選擇。其原則是燃料對被分離樣品有較強的著色力，背景易脫色；應(yīng)盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免引起醋酸纖維素薄膜溶解。應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色深不易脫去；時間太短，著色淺不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進行復(fù)染。6.透明及保存透明液應(yīng)臨用前配制，以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)而影響透明效果。這些試劑最好

23、選用分析純。透明前，薄膜應(yīng)完全干燥。透明時間應(yīng)掌握好，如在透明乙液中浸泡時間太長則薄膜溶解，太短則透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液體石蠟中，使薄膜軟化。如有水，則液體石蠟不易浸入，薄膜不易展平。思考題1.名詞解釋：區(qū)帶電泳；電滲現(xiàn)象；電泳遷移率2通過本次實驗，討論下列問題：（1）簡述醋酸纖維薄膜電泳原理。（2）根據(jù)人血清中血清蛋白各組分等電點，如何估計它們在pH8.6的巴比妥巴比妥鈉電極緩沖液中，移動的相對位置。（3）醋酸纖維素薄膜與濾紙相比較，有哪些優(yōu)點？實驗3SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量（4學(xué)時）目的要求1學(xué)習(xí)SDSPAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理。2掌握SDSPAG

24、E測定蛋白質(zhì)分子量的操作方法。原理聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（acrylamide,簡稱Acr）和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,簡稱Bis）在加速劑和催化劑的作用下聚合而成的高分子物質(zhì)，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和分子篩性質(zhì)。以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,簡稱PAGE）。由于各種蛋白質(zhì)所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同，在電泳中會產(chǎn)生不同的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，不連續(xù)電泳還有濃縮效應(yīng)，因而有不同的遷移率。聚丙烯酰胺凝膠由于富含酰胺基，故它是穩(wěn)定的親水凝膠。結(jié)構(gòu)中不帶電荷，

25、因而在電場中電泳電滲現(xiàn)象極為微小。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能限制蛋白質(zhì)大分子的擴散運動，具有良好的抗對流作用。在合適濃度范圍內(nèi)還具有較好的透明度，一定的機械強度，以及化學(xué)上惰性、吸附作用很小等許多優(yōu)點。十二烷基硫酸鈉（簡稱SDS）是陰離子表面活性劑，它在水溶液中，以單體和分子團的混合形式存在。單體SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合生成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。由于SDS帶有大量負電荷，所以生成的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物所帶的負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)所帶凈電荷的差異，均帶有相同密度的負電荷，。在蛋白質(zhì)溶液中，加入SDS和巰基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽組分分成單個亞單位，

26、SDS可使蛋白質(zhì)亞單位中的氫鍵、疏水鍵打開，因此SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物形狀近似雪茄形的長橢圓棒，不同復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸改變則與蛋白質(zhì)的分子量成正比?；谏鲜鰞煞N情況，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是與橢圓棒的長度有關(guān)，也就是只與蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。在電泳體系中加入十二烷基硫酸鈉（簡稱SDS），則電泳遷移率主要依賴于蛋白質(zhì)分子量，而與所帶的凈電荷和形狀無關(guān)，這種電泳方法稱為SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）。蛋白質(zhì)分子量在10，000200，000之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系

27、，可用下列公式表示：上式中，為蛋白質(zhì)分子量；為常數(shù)；為斜率；為相對遷移率（即蛋白質(zhì)的電泳遷移距離除以示蹤染料遷移距離）。根據(jù)上述方程將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳遷移率與分子量的對數(shù)作圖，可制作出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)的電泳遷移率，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其近似分子量。不同的凝膠濃度適用于不同的分子量范圍（見表3-1），可根據(jù)所測分子量的范圍選擇最適凝聚濃度，并盡可能選擇分子量范圍和性質(zhì)與待測樣品相近的蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。凝膠濃度交聯(lián)度分子量范圍5%2.6%25,000200,00010%2.6%10,00070,00015%2.6%10,00050,000表3-1分子量范

28、圍與凝膠濃度的關(guān)系由于SDSPAGE具有設(shè)備簡單、快速，分辨率和靈敏度高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程、醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)等方面。SDSPAGE作為一種測定蛋白質(zhì)分子量的方法，盡管對于大部分蛋白質(zhì)來說，在比較廣泛的分子量范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率與其分子量的對數(shù)確實存在著線性關(guān)系，但是有許多蛋白質(zhì)是由亞基或兩條以上肽鏈組成的（如血紅蛋白、胰凝乳蛋白酶等），他們在變性劑和強還原劑的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類的蛋白質(zhì)，SDSPAGE測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整蛋白質(zhì)的分子量。為此，對這類樣品分子量的測定，還必須采用其他測定方法作參照。當(dāng)然這也使得S

29、DSPAGE特別適用于寡聚蛋白及其亞基的分析鑒定和分子量的測定。另外，還有一些電荷異常和構(gòu)象特殊的蛋白質(zhì)（如組蛋白F1），含有較大輔基的糖蛋白和含有二硫鍵較多的蛋白質(zhì)，以及一些結(jié)構(gòu)蛋白（如膠原蛋白）等，它們在SDS凝膠系統(tǒng)中，電泳的遷移率與分子量的對數(shù)不呈線性關(guān)系。因此，為了測得真實和完整的蛋白質(zhì)分子量，通?？刹捎枚喾N方法進行測定和相互驗證。試劑與器材一、試劑1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)試劑盒（20次/支）：按使用說明配制2.胰蛋白酶3.連續(xù)體系SDSPAGE有關(guān)試劑1）0.2mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液：稱Na2HPO412H2O51.58g及NaH2PO42H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。

30、2)樣品溶解液（上樣液）：10ml/組0.01mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1%SDS、1%巰基乙醇、10%甘油和0.02%溴酚藍。用來溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測蛋白質(zhì)樣品。配制方法見表3-2：SDS巰基乙醇甘油溴酚藍0.2mol/LpH磷酸鹽緩沖液加重蒸水至最后總體積為100mg0.1ml1ml2mg0.5ml10ml表3-2連續(xù)體系樣品溶解液3)凝膠貯液：稱Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，過濾后置棕色瓶內(nèi)，4貯存可用12個月。4)凝膠緩沖液：6ml/組稱SDS0.2g，加0.2mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液至100ml。4貯存，用前稍加溫使SDS溶解。5)1%TEM

31、ED：取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶內(nèi)4貯存。6)10%過硫酸銨（AP）：1ml/組稱AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶內(nèi)4貯存。7)電極緩沖液（0.1%SDS，0.1mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液）：稱SDS1克，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液，再用蒸餾水定容至1L。8)2%瓊脂（糖）粉：20ml/組稱瓊脂（糖）2g，加100ml上述電極緩沖液，4貯存。4.固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。5.染色液：考馬斯亮藍R2500.125g，加上述固定液250ml，過濾后應(yīng)用。6.脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1

32、L。二、器材夾心式垂直板電泳槽（附帶凝膠模1351001.5mm，1臺/組），直流穩(wěn)壓電源（電壓300600V，電流50100mA），移液管（1ml2/組，5ml1/組，10ml2/組），燒杯（50ml3/組），細長頭的滴管1只/組，1ml注射器，微量注射器（10或50L），大培養(yǎng)皿（120160mm1/組），不銹鋼藥鏟1個/組，大燒杯（盛放廢液）2個/組，洗瓶2個/組（分別盛重蒸水、蒸餾水），濾紙一盒，細銅絲（2小段/組），移液管架1個/組操作方法一、安裝夾心式垂直板電泳槽夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。這種電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由1個凵形

33、硅膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上貯槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下貯槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定。各部分按下列順序組裝：裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。將長、短玻璃板分別插到凵形硅膠框的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。豎直電泳槽，用細長頭滴管吸取已熔化的2%瓊脂（糖）加在長玻璃板下端與硅膠框交界的縫隙內(nèi)，其目的是封住空隙，加瓊脂（糖）溶液時中應(yīng)避免有氣泡。二、配膠及

34、凝膠板的制備1.配膠根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。表3-3表示配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量（單位/ml）。凝膠濃度試劑5%7.5%10%凝膠貯液30%Acr0.8%Bis3.335.006.660.2mol/LpH7.2磷酸緩沖液內(nèi)含0.2%SDS10.0010.0010.001%TEMED2.002.002.00重蒸餾水4.572.901.1310%AP0.100.100.20表3-320ml不同濃度分離膠各試劑用量2.凝膠板的制備按表配制20ml10%濃度的膠，將分離膠混合液直接倒入兩塊玻璃板的縫隙內(nèi)直至距離短玻璃板上緣0.5cm處，插入樣品槽模板。凝膠聚合

35、約需30min，2030min后，小心拔出梳形樣品槽模板，用窄條濾紙吸去殘余水分，注意不要弄破凹形加樣槽的底面。倒入電極緩沖液即可準(zhǔn)備加樣。三、加樣加樣體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為1015L。如果樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除。加樣時，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。四、電泳上槽接負極，下槽接正極，打開電源，將電流調(diào)至20mA，待樣品進入分離膠后，將電流調(diào)至60mA，待染料前沿遷移至距硅膠框底邊11.5cm處，停止電泳。五、凝膠板剝離電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟撬開短玻璃板

36、，在凝膠板切下一角作為前沿標(biāo)記。在兩側(cè)溴酚藍染料區(qū)帶中心，插入細銅絲作為前沿標(biāo)記。六、染色與脫色先用固定液將凝膠固定1小時，再將染色液倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，染色40min左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率。七、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距細銅絲間的距離（cm）（即染料遷移距離）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離（cm）（即樣品遷移距離），如圖所示。按下式計算相對遷移率mR：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的相對遷移率為橫坐標(biāo)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品相對遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。圖3-1樣

37、品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白在連續(xù)SDS分離示意圖樣品槽1,2,4,5,為待測樣品，樣品槽3為標(biāo)準(zhǔn)蛋白思考題名詞解釋：聚丙烯酰胺凝膠電泳中濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)；2.根據(jù)實驗結(jié)果繪出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出待測蛋白的分子量。3.通過本次實驗學(xué)習(xí)，討論下列問題：1）SDSPAGE用于蛋白質(zhì)分子量測定的基礎(chǔ)是什么？2）對于由多條肽鏈組成的蛋白質(zhì)，SDSPAGE能否測定出它的分子量，如何測定出？實驗4葡聚糖凝膠過濾層析法測定蛋白質(zhì)分子量(4學(xué)時)目的要求1.初步掌握利用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)分子量的原理。2.學(xué)習(xí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液制作Ve,Kav對的“選擇曲線”以及測定未知蛋白質(zhì)樣品分子量的方法。原理凝

38、膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體，它們的內(nèi)部有很細微的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。目前關(guān)于凝膠層析的原理有許多假設(shè)和理論，普遍接受的是分子篩效應(yīng)。凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸液膨脹，然后裝入層析柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，流速緩慢，以至最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。對凝膠層析分離的簡單過程可用圖4-1表示。圖4-1小分子由于擴散作用進入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留，大分子被排阻在凝膠顆粒外面，在顆粒之間迅速通過。當(dāng)凝膠裝柱后，柱床容積為“總?cè)莘e”Vt，它由V0

39、,Vi,Vg三部分組成:式中V0為外容積，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相容積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)流動相的容積；Vi為內(nèi)容積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相容積，相應(yīng)于一般層析法中的固定相容積；Vg為凝膠本身的容積。洗脫容積Ve是自加入樣品時算起，到組分最大濃度峰出現(xiàn)時所流出的容積，它與V0,Vi的關(guān)系為：式中Kd為分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)，只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？障兜拇笮》植加嘘P(guān)。上式可改寫成：Kav是有效分配系數(shù)，對交聯(lián)度小的凝膠Kav與Kd差別較小，而對交聯(lián)度大的凝膠二者差別較大。Kav可用下式表示：根據(jù)凝膠層析原理，對同一類型化合物的特征與組分的分子量

40、有關(guān)。流過凝膠柱時，按分子大小順序流出，分子量大的走在前面。洗脫容積Ve是該物質(zhì)分子量對數(shù)的線性函數(shù)：式中，為常數(shù)，為分子量。也可以用（有效分配系數(shù)）代替，與分子量的關(guān)系同上式，只是常數(shù)不同。通常多以對分子量的對數(shù)作圖得一曲線，稱為“選擇曲線”。如圖4-2所示。選擇曲線的斜率說明凝膠性質(zhì)的一個很重要的特征。在允許的工作范圍內(nèi)，曲線愈陡，則分級愈好，而工作范圍愈窄。凝膠層析主要決定于溶質(zhì)分子量大小，每一類型的化合物如球蛋白類等都有自己特殊的選擇曲線，可用于測定未知物的分子量，測定時以使用曲線的直線部分為宜。圖4-2球蛋白分子量選擇曲線為了測定分子量，就必須知道一根特定柱的Vt，V0和Vi，從而計

41、算出Kd，Kav等。V0可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬的藍色葡聚糖2000等有顏色的溶液，通過測定大分子物質(zhì)的洗脫曲線，洗脫峰峰頂洗出的體積就是該柱的V0值。選一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出其洗脫體積Ve，減去V0就是Vi，常用硫酸銨來測定。Vt可用下式計算：為常數(shù)3.14，為柱直徑，為凝膠床的高度。試劑和器材一、試劑1.蛋白質(zhì)樣品（采用氯化高鐵血紅素溶液8mg/ml）：2ml/組2.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液：2ml/組3mg/ml藍色葡聚糖，8mg/ml肌紅蛋白，0.3mg/mlDNP-天冬氨酸。溶劑為含15%（V/V）甘油的洗脫緩沖液。3

42、.藍色葡聚糖2000（2mg/ml）：2ml/組4.硫酸銨（12mg/ml）：2ml/組5.洗脫液0.05mol/LTris鹽酸溶液(pH7.5)，內(nèi)含0.1mol/LNaCl：50ml0.1mol/LTris溶液與40.3ml0.1mol/L鹽酸混勻后，溶解0.585克NaCl，加水稀釋至100ml，即得洗脫液6.SephadexG-757.5%Ba(Ac)2二、器材層析柱：柱管（直徑1.01.3cm；管長90100cm）1個/組，試管（30支/組），玻璃棒1個/組，濾紙一盒，移液管（1ml2），721分光光度計、脫脂棉、試管架1個/組、鐵架臺1個/組操作方法一、一般操作方法1.凝膠的處理（

43、教師準(zhǔn)備）將稱好的干粉傾入過量的洗脫液中，在室溫下放置，使之充分溶脹。為了縮短時間，可在沸水浴中加熱將近100，這樣可縮短溶脹時間至幾小時，而且可以殺死細菌和霉菌，并排除凝膠內(nèi)氣泡。2.裝柱裝柱前將凝膠上面過多的溶液傾出，用真空干燥器抽盡凝膠中空氣。關(guān)閉層析柱出水口，并向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在緩慢攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約23cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關(guān)閉出水口。接著通過23倍柱床容積的洗脫液使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面上放一張濾紙片或一團脫脂棉，以防將來在加樣時

44、凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。3.加樣加緊上、下進出水口夾子，以防止操作壓改變。用1ml移液管吸取1ml樣品混合液，將移液管尖端小心插入柱中液面下方1cm處，小心釋放樣品，使其在脫脂棉上端形成一個層面，過程大約需要2分鐘完成?？吹綐悠穼觿偤猛耆魅肽z床時，向柱上小心的添加緩沖液至合適高度（約5cm左右），以保證流速的穩(wěn)定。（注意：不能使膠床上端無充裕的緩沖液，以防干裂）4.洗脫洗脫時，打開上、下進出口夾子，先收集10ml流出液，用洗脫液以每管4ml/管流速洗脫，用試管收集流出液，并對每管編號。當(dāng)所有有色物質(zhì)洗脫下來后，關(guān)閉螺旋夾停止洗脫。然后在對應(yīng)的波長下讀各管的光吸收值。二、蛋

45、白質(zhì)分子量的測定1.測定V0和Vi將0.5ml藍色葡聚糖2000和硫酸銨混合液（2mg/ml）上柱、洗脫，分別測出藍色葡聚糖的洗脫體積Ve即為該柱的V0，硫酸銨的洗脫體積Ve即為該柱的Vi。藍色葡聚糖的洗脫峰可根據(jù)顏色判斷，硫酸銨的洗脫峰用Ba(Ac)2判斷。2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按上述方法將1ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液上柱、洗脫，用試管收集。收集后，于以下對應(yīng)波長下讀各管的光吸收值：藍色葡聚糖（藍色）：650nm肌紅蛋白（琥珀色）：500nmP-天冬氨酸（黃色）：440nm以洗脫體積為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)作洗脫曲線。根據(jù)洗脫峰位置，量出每種蛋白質(zhì)的洗脫體積（Ve），然后以蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)lgMr

46、為縱坐標(biāo)，Ve為橫坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時根據(jù)已測出的V0和Vi以及計算出的Vt，求出Kav。也可以Kav為橫坐標(biāo)，lgMr為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.未知樣品分子量的測定將未知樣品按標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作。根據(jù)洗脫峰的位置，量出洗脫體積，也可以計算出Kav，分別由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品的分子量。思考題根據(jù)實驗中遇到的各種問題，概述做好本實驗的經(jīng)驗與教訓(xùn)。凝膠過濾的介質(zhì)有哪些，各過濾介質(zhì)的異同是什么？通過本次實驗學(xué)習(xí)，討論SDSPAGE和凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量的異同。實驗5DNA的瓊脂糖凝膠電泳（4學(xué)時）目的要求1.掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法。2.學(xué)習(xí)利用瓊脂糖電泳方法測定DNA片段大小

47、。3.學(xué)習(xí)有關(guān)建立DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的基本技術(shù)。原理DNA分子在堿性環(huán)境中（pH8.3緩沖液）帶負電荷，外加電場作用下，向正極泳動。不同的DNA片段由于其電荷、分子量大小及構(gòu)型的不同，在電泳時的泳動速率就不同，從而可以區(qū)分出不同的區(qū)帶，電泳后經(jīng)溴乙錠染色，在波長254nm紫外光照射下，DNA顯橙紅色熒光。瓊脂糖凝膠電泳對DNA的分離作用主要依據(jù)DNA的分子量及分子構(gòu)型，同時與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，電泳遷移率不相同。不同濃度的瓊脂糖凝膠適宜分離DNA片段大小范圍見表1。因而要有效分離大小不同的DNA片段，主要是選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度。不同構(gòu)型

48、的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，不同構(gòu)型的DNA移動速度次序如下：共價閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。在同一濃度的凝膠中，分子量較小的DNA片段比較大的片段快。DNA片段的遷移距離（遷移率）與它的大小（分子量）的對數(shù)成反比。將未知DNA的遷移距離與已知分子大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)物的電泳遷移距離進行比較，即可計算出未知DNA片段的大小。瓊脂糖凝膠濃度/%可分辨的線性DNA大小范圍/kb0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1表5-1DNA大小范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系本實驗采用限制性內(nèi)切酶Hind或Eco

49、R酶解DNA的片段為標(biāo)準(zhǔn)物，建立其酶切圖譜，同時以酶解各片段的分子量為縱坐標(biāo)，以它們對應(yīng)的遷移率為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上，連接各點繪制出測定DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。共價閉環(huán)質(zhì)粒pBR322DNA只有一個EcoR酶切位點，酶解后成為一條線狀DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳，測量酶解后線型DNA的遷移距離，可以直接在分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其分子大小。試劑和器材一、試劑限制性內(nèi)切酶Hind、EcoR試劑盒標(biāo)準(zhǔn)DNA：按使用說明配制標(biāo)準(zhǔn)pBR322：按使用說明配制酶反應(yīng)終止液（100.1mol/LEDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚藍）：10L/組稱取3.72克EDTANa22H2O，20克Fico

50、ll，0.25克溴酚藍，溶解后定容至100ml。電極緩沖液（5TBE）：用前稀釋10倍稱取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTANa22H2O，溶解后用蒸餾水定容至200ml。使用前用蒸餾水稀釋10倍，稱為TBE稀釋緩沖液（0.5TBE）。溴乙錠（EB）染色貯存液（1mg/ml）：1滴/組將100mg溴乙錠溶于蒸餾水或電極緩沖液100ml，棕色瓶內(nèi)封好，避光保存。EB是誘變劑，配制和使用時應(yīng)戴乳膠手套，并且不要將該溶液灑在地面或桌面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)專門處理后，才能進行清洗或棄去。1%瓊脂糖二、器材Eppendorf離心管（1.5ml，預(yù)先高溫高壓滅毒，3

51、個/組）及其離心管架，電泳槽（1個/組），電泳儀（1個/2組），凝膠塑料托盤（1個/組），錐形瓶（100ml1，烘干），小燒杯（50，100，250ml），微量注射器（2L3，15L或20L1），一次性塑料手套(64只)，膠頭滴管（3），紫外反射投射儀，防護眼鏡，洗瓶2個（分別盛重蒸水和蒸餾水），大燒杯1個，膠頭滴管2支，量筒（50ml1），卡尺（學(xué)生自備）操作方法一、DNA的酶解取2只清潔、干燥、無菌的Eppendorf管，編號，按照限制性內(nèi)切酶Hind、EcoR試劑盒說明書用量，用微量注射器加入各種試劑質(zhì)粒DNA和pBR322，最后用雙蒸水補足至20L，小心混勻。37水浴保溫12h，然后各

52、小管內(nèi)加入2L的酶反應(yīng)終止液，混勻，終止酶促反應(yīng)，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２僮髑案髟噭┯昧恳磸?fù)核對，保證準(zhǔn)確無誤，所加試劑用量很少，必須認真操作。二、1.0%瓊脂糖凝膠板的制備用配套擋板將凝膠塑料托盤短邊缺口封住，置水平玻板或水平工作臺面上，將樣品槽模板（梳子）插進托盤長邊上的凹槽內(nèi)（距一端約1.5cm），梳齒底邊與托盤表面保持0.51mm的間隙，安置好后保持靜置狀態(tài)。圖5-1凝膠托盤的組裝1.托盤2.擋板3.梳子稱取0.3克瓊脂糖置于小錐形瓶中，加入30mlTBE稀釋緩沖液，在電爐上（或微波爐中）加熱融化，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生泡沫。待瓊脂糖冷卻至放在手背不覺太燙手（約60）后，滴一滴EB，然后將瓊脂

53、糖溶液在靠近擋板一側(cè)連續(xù)地倒入托盤內(nèi)（注意中間不要間斷），使凝膠緩慢而連續(xù)地展開直至在托盤表面形成一層約3mm厚均勻膠層（7.19.0cm）。膠內(nèi)不要存有氣泡，室溫下靜置約20分鐘。待凝固完全后，用小滴管在梳齒附近加入少量TBE稀釋液潤濕凝膠，雙手均勻用力輕輕拔出樣品槽模板（注意勿使樣品槽破裂），則在膠板上形成相互隔開的樣品槽。取下封邊的擋板，將凝膠連同托盤放入電泳槽平臺上，倒入大量TBE稀釋緩沖液直至浸沒過凝膠面23mm，要防止樣品槽內(nèi)窩存氣泡，可以用微量注射器挑除。三、加樣用微量注射器或移液槍將經(jīng)酶切的樣品液和未經(jīng)酶切的樣品液（要加2L的酶反應(yīng)終止液）分別加入到膠板的不同加樣槽內(nèi)，每個槽（

54、522.5mm）容積約為25L，因此加樣量不要超過20L，避免因樣品過多而溢出，污染鄰近樣品。加樣時，注射器針頭穿過緩沖液小心靠近加樣槽底部，但不要損壞凝膠槽，然后緩慢地將樣品推進槽內(nèi)，讓其集中沉于槽底部。加完一個樣品后的微量注射器應(yīng)反復(fù)洗凈后才能用以加下一個樣品。四、電泳加樣完畢，將靠近樣品槽一端連接負極，另一端連接正極（千萬不要搞錯），接通電源，開始電泳。在樣品進膠前可用略高電壓，防止樣品擴散，樣品進膠后，應(yīng)控制電壓降不高于5V/cm。當(dāng)染料帶移動到距離凝膠前沿約1cm時，停止電泳。五、觀察小心地取出凝膠置托盤上，將膠板推至預(yù)先浸濕并鋪在紫外燈觀察臺上的玻璃紙內(nèi)，在波長245nm紫外燈下進

55、行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，可觀察到清晰的條帶。觀察時應(yīng)帶上防護眼鏡，避免紫外燈對眼睛的傷害。六、制作測定分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線用卡尺量出DNAHind酶解各片段的遷移距離（cm），以DNA酶解各片段分子量為縱坐標(biāo)，它們的遷移距離為橫坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上連結(jié)各點劃出曲線，即為DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。DNAHind酶解各片段大小見表5-2。片段堿基對數(shù)目（kb）道爾頓（106）1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08表5-2DNAHind酶解片段注意事項溴乙錠（EB）是

56、誘變劑，配制和使用時應(yīng)帶乳膠手套，并且不要將該溶液灑在桌面或地面上。凡是沾污過EB的器皿或物品，必須經(jīng)過專門處理后，才能進行清洗或棄去。DNA酶解過程中，使用的器具都應(yīng)干凈，并經(jīng)消毒。配制時急需用滅菌的雙蒸水，還要防止限制性內(nèi)切酶被污染。加樣量的多少取決于加樣槽最大容積。可以采用大小不同的樣品槽模板以形成容積不同的加樣槽，加入樣品的體積應(yīng)略小于加樣槽容積，為此，對于較稀的樣品液應(yīng)設(shè)法調(diào)整其濃度或加以濃縮。DNAHind酶解后應(yīng)有8條帶，但實際上只能看見6條，分子量小的2條帶由于其熒光弱，往往看不見。思考題1.名詞解釋：DNA；限制性內(nèi)切酶；Marker2.根據(jù)實驗結(jié)果，解釋瓊脂糖凝膠電泳測定D

57、NA片段大小的根據(jù)，聚丙烯酰胺凝膠電泳能否測定DNA分子的大小，它們的區(qū)別是什么？3.說明DNA限制性內(nèi)切酶圖譜的構(gòu)建在核酸研究和遺傳工程等方面的應(yīng)用價值。實驗6唾液淀粉酶的性質(zhì)和活力測定（8學(xué)時）目的要求通過唾液淀粉酶性質(zhì)的測定，了解酶的專一性和多種因素對酶促反應(yīng)速度的影響，如：底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑和抑制劑等。通過對唾液淀粉酶活力的測定，學(xué)習(xí)酶活力、蛋白質(zhì)含量的測定方法，及酶活力和比活力的計算方法。試劑和器材主要器材：可見光分光光度計、試管、漏斗、移液管、恒溫水浴鍋、pH試紙等。主要試劑：可溶性淀粉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、酚、NaOH、HCl、乙醇、醋酸、醋酸鈉、牛

58、血清白蛋白溶液、考馬斯亮藍G250等。要求涉及的實驗操作：用考馬斯亮藍法制作蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。用3，5-二硝基水楊酸試劑法或Benedict試劑法制作葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。至少測定底物濃度、溫度、pH值、激活劑和抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響。時間內(nèi)容安排實驗前六周，教師向?qū)W生介紹實驗?zāi)康?、實驗條件、實驗材料，學(xué)生查閱文獻資料。實驗前五周，學(xué)生提交具體實驗方案和所需儀器、藥品清單，實驗室負責(zé)相關(guān)實驗藥品、設(shè)備的準(zhǔn)備工作。實驗開出。提交一份實驗報告，內(nèi)容包括：實驗的目的、實驗的原理、實驗試劑和器材、操作方法、實驗結(jié)果與分析、討論和實驗情況總結(jié)。參考書目（僅供參考，另外可以查閱期刊雜志）高級生化實驗教

59、程，王重慶等編生化實驗方法和技巧，張龍翔等編生物化學(xué)實驗，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社實驗7生物氧化與電子傳遞（3學(xué)時）目的要求1.掌握電子在電子傳遞鏈中的傳遞過程；2.了解體外實驗中研究電子傳遞鏈的方法。原理生物氧化過程中代謝物脫下的氫由NAD+或FAD接受生成還原型NADH或FADH2，再經(jīng)一系列電子傳遞體傳遞，最后與氧結(jié)合生成水。這些存在于線粒體內(nèi)膜上的氧化還原酶及其輔酶依次排列，順序地起傳遞電子或電子和質(zhì)子的作用，稱為電子傳遞鏈或呼吸鏈。在體內(nèi)，代謝中間產(chǎn)物琥珀酸在線粒體琥珀酸脫氫酶（輔酶FAD）的作用下脫氫氧化生成延胡索酸，脫下的氫使FAD還原成FADH2，再經(jīng)電子傳遞鏈傳遞，即FADH2Q細胞色素（bc1caa3），最后與氧結(jié)合生成水。在體外實驗中，組織細胞生物氧化生成琥珀酸的量可采用在琥珀酸脫氫時伴有顏色變化的化合物作氫受體來研究。本實驗以2，6-