抗黃曲霉毒素M1抗體制備及檢測(cè)方法建立

1、抗黃曲霉毒素M1抗體制備及檢測(cè)要領(lǐng)創(chuàng)立【關(guān)鍵詞】黃曲霉毒素1；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)摘要：目的制備針對(duì)黃曲霉毒素1的單克隆抗體并創(chuàng)立針對(duì)黃曲霉毒素1的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)要領(lǐng)。要領(lǐng)利用B細(xì)胞雜交瘤技能，創(chuàng)立能排泄抗黃曲霉毒素1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，創(chuàng)立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)要領(lǐng)。效果研制出1株能特異性排泄抗黃曲霉毒素1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，定名為2F2。該單克隆抗體的Ig亞類為IgG1，親和常數(shù)為2810-11l/L。該抗體與黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素2等布局雷同物有薄弱的交織反響，具有較

2、高的特異性。在此底子上創(chuàng)立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)要領(lǐng)。該要領(lǐng)的最低檢出濃度為007ng/l，校正曲線的線性范疇為0022ng/l，線性方程y=-04364x+02693(R2=09949)。要領(lǐng)的加標(biāo)接納率為725%1313%。結(jié)論制備了具有高特異性和親和力的抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，并創(chuàng)立了快速、敏捷的針對(duì)黃曲霉毒素1的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)要領(lǐng)。關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素1；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Keyrds：aflatxin1;nlnalantibdy;enzye-linkediunsrbetassay黃曲霉毒素1(aflatxin1,AF1)是動(dòng)物攝入黃曲霉毒素B1(AFB1)后在

3、體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，存在于動(dòng)物體內(nèi)可食部門(mén)，如乳、肝、蛋類等，此中以乳最為常見(jiàn)，且乳與乳成品中的AF1在消費(fèi)和貯藏期間相對(duì)不變，巴氏消毒難以粉碎1。AF1的急性毒性與AFB1大抵雷同，可引起實(shí)行動(dòng)物產(chǎn)生腫瘤2，50g/(kgb)的AF1可致大鼠肝癌及結(jié)腸腺癌3，別的尚有AF1引起牙原性腫瘤的報(bào)道4。鑒于AF1對(duì)人類康健組成埋伏的威脅，在我國(guó)食用乳與乳成品者又多為嬰幼兒、老年人和體弱多病者，因此，必需對(duì)其含量舉行監(jiān)控，限定AF1在牛奶或乳成品中的污染程度，到達(dá)庇護(hù)消耗者康健的目的。因此，創(chuàng)立正確、輕便、快速、敏捷、接納率高、不需特別裝備和可在下層實(shí)行室開(kāi)展的檢測(cè)闡發(fā)要領(lǐng)非常需要。本文旨在制備

4、抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，并對(duì)抗體特性舉行判斷，為進(jìn)一步研制具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的免疫學(xué)快速檢測(cè)試劑盒提供技能支持。1質(zhì)料與要領(lǐng)11質(zhì)料111東西2造就箱(美國(guó)Queue公司)；清潔事情臺(tái)(北京半導(dǎo)體裝備一廠)；生物倒置顯微鏡(日本歐林巴斯光學(xué)株式會(huì)社)；酶標(biāo)闡發(fā)儀(瑞士SUNRISE公司)；電子闡發(fā)天平(瑞士ettler公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Herle公司)；平凡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；電泳儀(美國(guó)BIRAD公司)；微量可調(diào)移液器(法國(guó)Gilsn公司)；細(xì)胞造就板(96孔(美國(guó)star公司)；24孔(美國(guó)Gib公司)；酶標(biāo)板(96孔，美國(guó)rning公司)。112試劑黃曲霉毒素1，黃

5、曲霉毒素1-BSA偶聯(lián)物(AF1-BSA)、牛血明凈卵白(BSA)、抗體亞類測(cè)定試劑盒(Ig,IgG,IgA,IgD,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3)、黃曲霉毒素B1(AflatxinB1)、黃曲霉毒素B2(AflatxinB2)、黃曲霉毒素G1(AflatxinG1)和黃曲霉毒素G2(AflatxinG2)(美國(guó)Siga公司)。RPI1640造就基，選擇性造就基，福氏佐劑(完全、不完全)、二甲基亞砜(DS)，3,3,5,5四甲基聯(lián)苯氨(TB)、吐溫20(Teen20)、聚乙二醇(PEG，4000)、青霉素、鏈霉素(美國(guó)Gib公司)；辣根過(guò)氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山試劑公司)；

6、30%H22(優(yōu)級(jí)純，北京化工場(chǎng))；二甲基甲酰胺、過(guò)碘酸鈉、酸楚、硼氫化鈉、無(wú)水乙醇、乙醚、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化銨、硫酸銨、氫氧化鈉、無(wú)水碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸鈉等，均為闡發(fā)純以上(北京化學(xué)試劑市肆)。113溶液體系參考文獻(xiàn)5制備。114細(xì)胞系與實(shí)行動(dòng)物小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0由本室傳代，并經(jīng)8氮雜鳥(niǎo)嘌呤處置懲罰。雌性BALB/小鼠，體重1820g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)行動(dòng)物研究所動(dòng)物繁育場(chǎng))。12要領(lǐng)121免疫動(dòng)物接納小劑量長(zhǎng)周期的免疫方案。對(duì)68周齡的雌性BALB/小鼠，體重1820g，初次免疫用100g黃曲霉毒素1-小牛血明凈卵白(BSA)與等

7、量完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。2周后，用50g黃曲霉毒素1-BSA與等量不完全福氏佐劑混勻后，腹腔注射。今后每隔2周用50g黃曲霉毒素1-BSA與等量不完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。8周后脾內(nèi)免疫50g黃曲霉毒素1-BSA作為增強(qiáng)免疫，3d后取脾細(xì)胞舉行交融。122細(xì)胞交融免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)以101混淆，用50%聚乙二醇(PEG)作交融劑。交融細(xì)胞懸于含20%小牛血清的選擇造就基內(nèi)，分種于加有BALB/小鼠腹腔排泄細(xì)胞作滋養(yǎng)層的96孔細(xì)胞造就板中，置5%2,37孵箱中造就，當(dāng)鏡檢雜交瘤克隆生長(zhǎng)達(dá)1/31/2視野時(shí)，取上清舉行篩眩123雜交瘤挑選及抗體檢測(cè)以黃曲霉毒素1-

8、BSA為包被抗原，用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法挑選排泄抗黃曲霉毒素1抗體的細(xì)胞孔，用黃曲霉毒素1間接競(jìng)爭(zhēng)按捺性ELISA法確證。以免疫小鼠的血清為陽(yáng)性比較，以Sp2/0細(xì)胞造就的上清液為空缺比較，以細(xì)胞造就板中未長(zhǎng)出克隆的細(xì)胞造就上清為陰性比較，陽(yáng)性細(xì)胞孔的判斷尺度為(A試驗(yàn)-A空缺)/(A比較-A空缺)21。124雜交瘤細(xì)胞克隆化接納造就瓶?jī)?nèi)正確計(jì)數(shù)稀釋法8。當(dāng)一連3次100%陽(yáng)性，即可將雜交瘤細(xì)胞凍存于液氮罐中。125單克隆抗體的消費(fèi)接納動(dòng)物體內(nèi)誘生單克隆抗體的要領(lǐng)6。126單克隆抗體的純化接納飽和硫酸銨法對(duì)腹水舉行純化7。13單克隆抗體的判斷抗體的免疫球卵白種別及亞類判斷接納抗體亞類測(cè)定試劑

9、盒舉行測(cè)定?？贵wIgG含量接納二喹啉甲酸(BA)卵白測(cè)定試劑盒舉行測(cè)定?？贵w分子量接納十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)法8?？贵w滴度測(cè)定以黃曲霉毒素1-BSA為包被抗原，從110000開(kāi)始將抗體舉行倍比稀釋，以Sp2/0細(xì)胞造就上清為陰性比較，用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA要領(lǐng)測(cè)定抗體滴度，以(A試驗(yàn)-A空缺)/(A比較-A空缺)21的最大稀釋倍數(shù)為滴定盡頭?？贵w親和力的測(cè)定接納間接非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法，即測(cè)定抗體的親和常數(shù)9。抗體的特異性和抗體的敏捷度用間接競(jìng)爭(zhēng)按捺性ELISA法舉行測(cè)定，參試毒素為黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2，黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素2。14樣品提取

10、根據(jù)國(guó)度尺度要領(lǐng)提炔10。15黃曲霉毒素1間接競(jìng)爭(zhēng)按捺性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)要領(lǐng)試驗(yàn)條件的最正確組適用棋盤(pán)滴定法確定。(1)用黃曲霉毒素1-牛血明凈卵白毗連物(00625ng/l)包被酶標(biāo)微孔板，每孔100l，4留宿；(2)酶標(biāo)板參加差異濃度的黃曲霉毒素1尺度溶液或樣品提取液和單克隆抗體溶液的混淆液100l(該混淆液為毒素尺度溶液或樣品提取液與單克隆抗體溶液按11混淆，提早混淆好，4留宿)，371h；(3)酶標(biāo)板參加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的羊抗鼠抗體，每孔100l，371h；(4)酶標(biāo)板加底物溶液，每孔100l，3730in；(5)每孔參加停頓液50l，于450n處測(cè)定吸光度值(A)。(6

11、)盤(pán)算：黃曲霉毒素1含量(ng/g)=*V1*V2*X/(*V3)。式中：為酶標(biāo)板上測(cè)得的黃曲霉毒素1濃度(ng/l)，根據(jù)尺度曲線求得；V1為樣品提取液的總體積(l)；V2為定容樣液的體積(l)；V3為取出的樣品液的體積(l)；X為樣品提取液的稀釋倍數(shù)；為樣品的重量(g)。2效果21單克隆抗體的制備用黃曲霉毒素1-BSA免疫BALB/小鼠得到了較好的免疫應(yīng)答。細(xì)胞交融后，經(jīng)間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA要領(lǐng)挑選，并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA要領(lǐng)確證，從中選擇出對(duì)黃曲霉毒素1毒素有強(qiáng)按捺而陽(yáng)性比較孔較強(qiáng)的細(xì)胞株，經(jīng)34次亞克隆，到達(dá)3次100%陽(yáng)性，創(chuàng)立了1株不變排泄抗黃曲霉毒素1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，定

12、名為2F2。22單克隆抗體特性的判斷抗黃曲霉毒素1抗體亞類是IgG1，相對(duì)分子量是150KD，抗體的親和力常數(shù)是2810-11l/L?？贵w與黃曲霉毒素B1的交織反響率是155%，抗體與黃曲霉毒素G1的交織反響率是39%，抗體與黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素2和牛血明凈卵白的交織反響率均1%。23黃曲霉毒素1尺度品校正曲線用20%甲醇-磷酸鹽緩沖液將黃曲霉毒素1配成差異濃度尺度利用液(0,001,002,005,010,020,050,100,200,500,1000ng/l)，將抗黃曲霉毒素1單克隆抗體根據(jù)1106稀釋，用間接競(jìng)爭(zhēng)按捺性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)得校正曲線，線性范疇是00

13、22ng/l，線性方程是y=-04364x+02693(R2=09949)。最低檢出濃度為007ng/l。24加標(biāo)接納試驗(yàn)從市場(chǎng)上購(gòu)置鮮奶和奶粉，別離舉行05g/kg和10g/kg加標(biāo)接納試驗(yàn)。對(duì)鮮奶樣品的均勻加標(biāo)接納率別離為(112596)%和(877198)%，對(duì)奶粉的加標(biāo)接納率別離為(1197156)%和(1086147)%，對(duì)百般品的加標(biāo)接納率范疇為725%1313%。3討論在本研究中所制備的抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，對(duì)黃曲霉毒素1具有高敏捷度和高特異性，可用于創(chuàng)立檢測(cè)乳與乳成品中AF1污染程度的免疫學(xué)檢測(cè)要領(lǐng)，以期到達(dá)對(duì)種種奶成品開(kāi)展大范圍觀察，相識(shí)我國(guó)奶和奶成品中黃曲霉毒素的污染程

14、度。關(guān)于抗體的特異性，本研究選擇了黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素2和牛血明凈卵白舉行交織反響。由于黃曲霉毒素在天然界中有很多衍生物，其布局極其相似，創(chuàng)立在多克隆抗體底子上的AF1檢測(cè)要領(lǐng)多與其他黃曲霉毒素產(chǎn)生交織反響，而使其應(yīng)用代價(jià)低落11。本研究在對(duì)抗黃曲霉毒素1雜交瘤細(xì)胞株大量挑選的底子上，得到了1株能排泄抗AF1的雜交瘤細(xì)胞株2F2，用該細(xì)胞株消費(fèi)的抗體僅與黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素G1有薄弱的交織反響，與其他黃曲霉毒素的衍生物和牛血明凈卵白無(wú)交織反響。由于黃曲霉毒素1是污染奶和奶成品的重要組分，因此，接納2F2抗體創(chuàng)立的ELISA要領(lǐng)可以確保

15、對(duì)黃曲霉毒素1具有高度的特異性，不會(huì)影響黃曲霉毒素1ELISA試劑盒的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用。本研究樂(lè)成地挑選出可以或許排泄抗黃曲霉毒素1的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，制備出對(duì)黃曲霉毒素1具有高親協(xié)力、高特異性的單克隆抗體，并創(chuàng)立了快速、敏捷的檢測(cè)鮮奶及奶粉中黃曲霉毒素1污染程度的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)要領(lǐng)，為鮮奶及奶粉的快速篩檢提供了技能支持。參考文獻(xiàn)1DPHEish,ullenJ,HsiehLS,etal.anerriskspsedbyaflatxin1J.PrinessTakaatsuSyp，1985,16:57-65.2usuanV,staGB,TrifilettiR,etal.Funtinalipair

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