(完整版)凝膠遷移實驗(EMSA)實驗方法

1、（完整版）凝膠遷移實驗（EMSA）實驗方法凝膠遷移實驗（EMSA）實驗方法凝膠遷移實驗有稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗（EMSA，electrophoreticmobilityshiftassay）,是一種用于蛋白與核算相互作用的技術。最初是用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，也可應用與蛋白-DNA、蛋白一RNA互作研究。一、實驗原理EMSA主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針,當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物;這種復合物由于分子量大,在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有

2、結合蛋白的探針則較快;孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后，蛋白-探針復合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標探針發(fā)送互作。二、實驗操作步驟1、實驗前準備（1）合理的實驗方案根據研究目的合理設計特異性探針實驗組以及非特異性探針對照組,如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等。（2）樣本制備可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進行定量，實驗中等量加入蛋白。（3）探針制備根據實驗要求設計不同的探針并添加標記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購買。現(xiàn)在大多數(shù)實驗室已經不再使用放射性標記，生物素使用相對較多。2、形成

3、蛋白-探針復合物（1）在0.5ml離心管中按順序將下列組份混勻：蛋白樣本（2-5|ig）X|il(完整版)凝膠遷移實驗(EMSA)實驗方法polyd（I一C）1|ilBindingBuffer2|ilNuclease一FreeddH20X|il總體積9ul(2)冰浴5min后，加入1n探針.(對照組加1ul對照探針)PCR儀中室溫(2023C)溫育30min。3、制備凝膠，電泳(1)制備6。5非變性聚丙烯酰胺凝膠：(注意根據試劑情況按比例調整總體積)5XTBE1ml30%Acrylamide/Bis2.2mldeionized，sterilewater6.62ml80%Glycerol80ul

4、10%AP90ulTEMED10ul總體積10ml按標準步驟制備凝膠.加樣前先在預冷的0.5XTBEbuffer中120V預電泳10min,與電泳完畢后沖洗加樣孔.混合樣本及電泳緩沖液，點樣電泳。將電泳槽置于冰上或者4C環(huán)境中，恒壓100V進行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部23cm為止。(大約50-60min,根據實際情況調整電泳時間及電壓；電泳時間不宜過長)4、轉膜(1)在預冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。在預冷的0。5XTBE中進行轉膜。轉膜裝置應置于冰上或者低溫室中

5、，恒壓60V轉膜1h。(注意根據實際情況調整電壓及時間)。5、檢測(1)去除轉好的膜，放入合適的盛有緩沖液的容器中，沖洗。(注意整個檢測過程避免膜干燥)(2)去掉沖洗緩沖液，加入封閉液后輕微震蕩，室溫封閉20min。加入適量的HRP酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRPconjugate),室溫震蕩孵育45min。(勿將酶標記物直接加到膜上)去掉酶聯(lián)物稀釋液，用洗滌緩沖液洗膜三次，每次室溫輕微震蕩10min。配置反應底物，均勻加至膜上，室溫孵育5min。(可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，是底物均勻覆蓋，注意不要產生氣泡)化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像(曝光時間的長短可以根據檢測

6、方法不同而進行相應調整).三、實驗結果展示(美國SignosisEMSA實驗結果)IL卿幾卜訓“Mi、l，Ml四、Super一ShiftEMSA非純化的蛋白樣本和一個特定的探針可形成一個或幾個特異的蛋白復合物。確定復合物中蛋（完整版）凝膠遷移實驗（EMSA）實驗方法白的特征可能會困難，可以加入目的蛋白的抗體，進行超遷移實驗，即Super-ShiftEMSA?？贵w和蛋白/探針復合物中的蛋白結合，使復合物的遷移延遲,形成超遷移。Super-ShiftEMSA工作原理；在反應體系中，抗體與DNA/蛋白復合物中的蛋白產生反應形成復合物會引起復合物的體積變大，在非變性凝膠中的移動變慢而與DNA/蛋白復合

7、物區(qū)別開。進行Super-ShiftEMSA需要考慮以下因素：1）一般先做一般的EMSA測定，成功后才考慮做Super-ShiftEMSA實驗。2）不是所有的抗體都可以用于Super-ShiftEMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于Super-ShiftEMSA.3）抗體的濃度要高.一般10-20ul的反應液需要使用0.51ul原倍的抗體。3）為減少非特異性反應，盡量使用純化的抗體.4）單抗與多抗都可用于Super-ShiftEMSA，但多抗可能與DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠.在這種情況下，雖然看不到Super-Shift的帶，但應當可以看到DAN/蛋白復

8、合物的電泳帶明顯減少.五、常見問題1、為什么看不到遷移帶？1）蛋白樣本提取質量不高，蛋白降解或者提取量不足。2）樣本中沒有可以與探針結合的蛋白。3）探針與蛋白無特異性的相互作用。4）轉膜效率低，蛋白或者探針未轉移到膜上。5）曝光或者成像時間過短.在Super-ShiftEMSA測定中看不到Super-ShiftDNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因：6）抗體沒有工作不是所有的抗體都可以用于Super-ShiftEMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于Super-ShiftEMSA。7）測定的活化的DNA/蛋白復合物中沒有希望檢測的構成成分存在。此時既看不到Super（完整

9、版）凝膠遷移實驗（EMSA）實驗方法Shift的帶，也看不到DNA/蛋白復合物的量的減少.8）使用的抗體過度稀釋。一般1020ul的反應液需要使用0。51ul原倍的抗體.9）多抗與DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下，雖然看不到SuperShift的帶，但應當可以看到DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。2、為什么實驗背景高？1）曝光或者成像時間過長。2）封閉時間不足或者效率不高.3）洗滌效果不佳4）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。3、EMSA測定需要多少量的蛋白與標記的探針？對每一個特定的結合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的

10、量在20-2000ng間，可將蛋白：DNA的等摩爾比調整為蛋白的摩爾數(shù)是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要210ug蛋白形成特異的復合物。部分純化蛋白與粗制核抽提液應保存在-80C、探針應保存在一20C以防止降解.無論探針或是結合蛋白都應避免多次凍融。4、Poly（dl:dC）,非特異性競爭DNA,特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用？Poly（dl：dC）由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應中加入poly（dl：dC）,可抑制粗制核抽提液中轉錄調節(jié)因子與標記探針的非特異結合。結合溶液中的poly（dl:dC）的用量需在正式實驗前進行優(yōu)化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當用純化的蛋白作

11、凝膠遷移反應時，不必一定加入poly（dl:dC），如加入，則普通反應中所用終濃度不超過50T00ng。對核抽提液，每23ug核抽提液用1ugpoly（dl:dC）o為確定所形成的復合物的特異性，在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結合反應的競爭實驗一般，特異競爭探針是非標記的DNA，其序列與標記探針相同，故能與標記探針競爭與結合蛋白的反應。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同，但序列不同。（完整版）凝膠遷移實驗（EMSA）實驗方法如果結合蛋白與標記探針的結合被特異競爭探針抑制，而不受非特異探針的影響表明靶結合蛋白的存在。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競爭DNA通常是標記的探針用量的30-100倍（w/w）。5、用什么凝膠條件將蛋白質/探針復合物和游離的探針分離開？將結合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結合，蛋白/探針復合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度.也可將TGE緩沖液（12.5mMTris，pH8.3,95mM甘氨酸,0。5mMEDTA）用于不穩(wěn)定