微生物快速檢測技術與原理講解課件

1、華粵企業(yè)集團有限公司 2成立于1991年，是目前中國最具規(guī)模的實驗室儀器設備供應商之一。目前是全球70多個品牌在中國的總代理，分別涉及生物制藥、微生物、分子生物、生物細胞、IVF及實驗室耗材等領域。345常規(guī)微生物項目：細菌總數、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數、霉菌總數致病微生物項目：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等微生物檢測的發(fā)展趨勢快速化自動化標準化全程追溯市場銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨，尤其是一些保質期較短的產品。減少物流的壓力，盡可能減少庫存，加快資金周轉。節(jié)約人力資源成本對于運行HACCP質量保證體系的企業(yè)來說，

2、快速檢測方法非常重要?？梢钥焖贆z測原料及半成品的微生物狀況，以采取相應的措施控制最終產品的微生物情況?？焖贆z測產品不少，但真正使用的企業(yè)不多。原因一：成本的原因。絕大多數快速檢測產品來自國外，成本相對偏高，而中國的人力成本相對便宜，對于檢測量小的企業(yè)，不會考慮快速檢測；而對于每天檢測量大的企業(yè)又擔心成本問題。原因二：技術的原因。雖然市面上有不少微生物快速檢測產品，但或多或少都有一定的技術局限性。一方面與樣品的加工工藝有關（譬如添加防腐劑等），另外一方面與檢測產品的技術原理等有關。美國EPIC、Celsis、Millipore、PALL英國DWS Rabit奧地利Sylab Bactrac 法國

3、 Bact/Alert 3D、Tempo美國Soleris， Biolumix 法國AES Chemunex Bactiflow、D-count、RDI 日本DoxATP法：EPIC、CelsisMPN法：Tempo膜過濾染色法： Millipore、PALL電化學法：DWS Rabit 、SyLab Bactrac 4300、 Dox顏色變化：Soleris、Biolumix、Bact/Alert 3D流式細胞技術： AES Chemunex Bactiflow、D-count激光掃描技術： AES Chemunex RDIATP （三磷酸腺苷）來源于細菌、酵母 、霉菌、生物膜組織殘留、人的

4、污染等用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對生產線和管道進行快速清潔程度檢測。改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無菌檢測或終產品檢驗。EPICCelsis優(yōu)點：通常用于進行商業(yè)無菌檢測?？纱蟠罂s短庫存時間，減少物流壓力和成本。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通常懷疑假陰性和假陽性的可能，特別是用ATP單個檢測代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測，其風險是一定存在的。(如保溫增菌時間不夠，菌數未達到一定數量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標菌未大量增菌等原因)美國默克Millipore Milliflex Quantum 美國Pall公司的Pallchek可過濾樣品經

5、膜過濾后，將菌截留在特殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增菌后取出，加入熒光試劑，熒光染料在微生物體內分解后積累，通過檢測熒光信號來到達計數的功能優(yōu)點：縮短培養(yǎng)時間，提高靈敏度，適合于菌數較低的可過濾產品使用。缺點：儀器較昂貴，運行成本比較貴。基于MPN(最大近似值)原理，實現自動計數Tempo 將一定濃度的樣品稀釋液加入定量的專用培養(yǎng)基后，通過充填方式將樣品液充填至48孔測試卡后，經適當的培養(yǎng)（細菌總數測定要求37培養(yǎng)40h），根據各孔道內細菌的生長狀況，由讀卡站進行熒光檢測，自動讀取結果并換算出樣品中的目標菌數值。優(yōu)點： 自動動化程度高一些。缺點：主要用于檢測菌落總數 耗材成本昂貴英國DWS

6、公司的Rabit奧地利Sylab公司的Bactrac4300日本的DOXBactrac4300DWS RabitDetection Time (DT)電導率單位對數期穩(wěn)定期界限值IDT與樣品中的菌數的對數呈線性關系 校準曲線表示菌數對數與IDT的關系校準時，同時做電化學法和標準方法，將菌數與IDT填入表格中，自動生成標準曲線，并自動計算相關系數及離散度。Log cfuA (DT) + b優(yōu)點：檢測成本低，檢測時間明顯縮短。 可用于微生物生長曲線測定，微生物抑菌研究，防腐劑和消毒劑研究等領域。缺點：儀器較昂貴，定量檢測時需要校正曲線。目前只能檢測細菌總數、大腸菌群和大腸桿菌方法的準確性和檢測精度

7、值得考慮需要專用的電極盒，試劑相對也比較貴美國的Soleris、Biolumix法國的BacT/Alert 3DBiolumix微生物生長導致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化，記錄達到突變點的時間。培養(yǎng)基內含有顏色指示劑與阻抗法類似，可以實現快速檢測。缺點：需要購買原廠的預裝培養(yǎng)基，應用范圍受限制，成本高昂。與阻抗法類似，可以實現快速檢測。缺點：需要購買原廠的預裝培養(yǎng)基，應用范圍受限制，成本高昂。BacT/Alert 3D 主要應用在醫(yī)院臨床的血培養(yǎng)；以及藥品和食品等無菌產品的檢測基于微生物生成產生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器顏色由藍綠色變淺，由L

8、ED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強度。光強度與微生物數量有一定關系。優(yōu)點：用于臨床血培養(yǎng)缺點：耗材太貴，而且含有對環(huán)境有害AsCO2丹麥Foss BactoScan FC法國AES chemunex Bactiflow 、D-count可用于非過濾產品流式計數 : 線性流體 單細胞分析 靈敏的檢測頭對微生物進行核酸染色，用流式細胞技術進行計數FOSS BactoScan FC 優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)缺點：死活細胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)，靈敏度不夠高適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數Chemunex公司將流式細胞技術與活細胞熒光探針標記及激光掃描技術相結合，推出

9、最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的D-count 和ScanRDI微生物快速檢測儀。其最大的特點是只檢測活細胞數，速度比較快。EnzymeViability substrateFree fluorochromeMicro-organismDetectorDetectorLaserFlow Cell細胞標記 細胞計數 直接單細胞標記 細胞無增菌要求直接對活細胞和酵母、霉菌進行標記D-countChemScan RDI2. 標記3. 激光掃描1. 過濾 1. 過濾2. 標記3. 激光掃描樣品過濾預標記60 min濾膜轉移ChemScanRDI 儀器分析標記30 min優(yōu)點：速度非常

10、快，尤其是激光掃描技術缺點：耗材太貴、維護保養(yǎng)比較復雜 流式細胞技術需要復雜的前處理 激光掃描技術只適合于可過濾樣品流式細胞技術和激光掃描技術的優(yōu)缺點顯色培養(yǎng)基法：技術成熟，產品很多。免疫學方法：產品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結果需要確認。通常的原理有ELISA、熒光酶免、免疫磁分離等方法。市場上的產品多。分子生物學方法：以基因探針檢測法和PCR法為主?；蛐酒貉芯繜狳c。 顯色及熒光底物技術顯色及熒光底物: 由化學及合成技術獲得 特殊酶天然裂解相似結構的分子 酶裂解時釋放發(fā)色及熒光混合物專一性酶活性，目視觀察底物結構共價鍵 (糖苷的, 肽聚, 磷酸二氫聚 )由酶進行專一

11、性識別糖類脂類蛋白胨色 原底 物 結 構共價鍵結合專一酶糖類脂類蛋白胨色原非裂解底物:不顯色 糖類脂類蛋白胨色源 游離或二聚物可顯色ALOA 原理:Beta-glucosidase activityBlue colonies-葡萄糖苷酶活性，藍色Phospholipase activityOpaque halo 磷酸酶活性，混濁暈Listeria spp.Listeria monocytogenes免疫磁分離法+定量PCRMatrix公司的免疫純化系統(tǒng)ELISA方法3M Tecra 公司的免疫捕獲快速檢測(略)GLISA-膠體金免疫層析致病菌快速檢測條(略)熒光酶免Vidas系列產品(略)Pa

12、thatrixAuto免疫純化15分鐘定量PCR快速確認1hr基因探針法及PCR方法在國外已經有相當成熟的表現。有普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结樂ㄒ话阋残枰鼍?，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡或熒光檢測器下獲得結果。PCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術判斷結果。試劑盒開發(fā)相對比較容易，只要找出特征的基因片斷，合成出引物即可。目前客戶比較關注的致病菌，包括沙門氏、李斯特氏、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCR試劑盒供應。BAXGene-trakGen-probeVe