實驗一光合細菌培育

1、關(guān)于實驗一光合細菌的培育第一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、實驗?zāi)康模和ㄟ^本實驗，了解并掌握光合細菌的培養(yǎng)方法。第二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、實驗儀器設(shè)備：光和細菌的培養(yǎng)設(shè)備：包括滅菌設(shè)備、培養(yǎng)容器、培養(yǎng)用具和檢測 儀器。1.滅菌設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋，用于高壓濕熱滅菌。2、培養(yǎng)容器 (1)試管：15mmL160mm(中型試管)。主要用于液體培養(yǎng)和斜面 培養(yǎng)。 20mmL180mm(大型試管)。主要用于制平板深層試管 或盛無菌 水等。(2)培養(yǎng)皿： 610cm(常用9cm).用于制作平板培養(yǎng)基，以分離 菌種和觀察菌落形態(tài)。 (3)移液管：容量110ml(常用1m

2、l、5ml、10ml)，制備培養(yǎng)基、稀 釋液體、吸取樣品等使用。第三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(4)錐形瓶(有、無具塞磨口兩種)：30500ml。用于各種光和細菌單體或組合連續(xù)培養(yǎng)的逐級擴大培養(yǎng)用。(5)三角燒瓶：5005000ml，用于擴大培養(yǎng)。(6)細口瓶：500020000ml，用于擴大培養(yǎng)和生產(chǎn)性大量培養(yǎng)。(7)塑料薄膜袋：用于生產(chǎn)性大量培養(yǎng)。(8)大型塑料水槽：一般為圓柱形。容量為300500L，用于生產(chǎn)性大量培養(yǎng)。 第四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3、培養(yǎng)用具 (1)操凈工作臺：用于菌種的分離和接種。(2)恒溫培養(yǎng)箱（或人工氣候箱，光照培養(yǎng)箱）：主要用

3、于培養(yǎng)菌種和小型培養(yǎng)使用。箱內(nèi)必須帶有鎢絲燈泡的人工光源。(3)電冰箱和冷藏冰柜：主要用于菌種和某些有機試劑的保存以及光和細菌母菌種液的長期保存(5-10)。(4)接種環(huán)：用于菌種取樣、接種。(5)電動離心機：用于液體菌種濃縮和采收。第五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(6)空壓機：用于微氣方式培養(yǎng)。(7)電風扇和排氣風扇：用于培養(yǎng)時控溫、調(diào)穩(wěn)。(8) 分析天平：用于試驗產(chǎn)品烘干后的稱重及分析稱樣等。(9）此外，應(yīng)還有分液漏斗、載波片、蓋玻片、酒精燈及電光源(碘鎢燈、白熾燈泡等)設(shè)施及其支架、控溫設(shè)備和充氣設(shè)備。 第六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三、實驗內(nèi)容：1.光和細

4、菌培養(yǎng)基的制備2.光合細菌菌種的分離3.菌種的培養(yǎng) 4.菌種的保存5.光和細菌的大量培養(yǎng) 6.光合細菌的培養(yǎng)技術(shù)和保種技術(shù)。第七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四、實驗步驟與方法：（一）光和細菌培養(yǎng)基的制備Sawad培養(yǎng)基(1975)：用于單菌落分離和莢膜紅假單孢菌的培養(yǎng)。 第八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.微量金屬元素(T.m.) 貯液培方EDTA 2.5g ZnSO47H2O 10.95g MgSO4H2O 1.54g CuSO45H2O 0.39g CoCl26H2O 0.2g FeSO47H2O 7.0g 蒸餾水 1000ml第九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于

5、2022年6月 2.生長素貯液培方：生物素 1mg 煙酸(尼克酸) 0.1mg 對氨基苯甲酸 10mg 維生素B1 100mg蒸餾水 1000ml。酵母膏和生長素貯液二者有一即可(即：有了酵母膏就不必加生長素)。第十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）光合細菌菌種的分離培養(yǎng)光和細菌，首先要有菌種，菌種可以從別的單位獲得。如果別的單位沒有適合的菌種，就要從自然生態(tài)環(huán)境中分離。分離菌種的工作要求雖然比較高，但也并非高不可攀，只要按照要求操作，就能分離出需要的菌種。第十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1.采樣 要根據(jù)光和細菌的生態(tài)特點，選擇光和細菌大量分布的地方采樣。 目前，

6、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)使用的光和細菌，主要是紅螺菌科的一些種類。這些光和細菌是以有機質(zhì)作為光和細菌的碳源和供氫體，故廣泛分布在被有機質(zhì)污染的地方，如河底、湖底、海底、水田、溝渠和污水池塘的泥土以及豆制品廠、淀粉廠和食品工業(yè)等廢水排水溝處呈橙黃色或分紅色的泥土中。 第十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月光和細菌在污水池塘等有機質(zhì)含量豐富的地方，分布數(shù)量更大。在以上所述地方都可以采集樣品。采樣工具有杯、采水器和采泥器，淺水處直接用杯舀取少量樣品，深水處借用采水器和采泥器采樣，采集到的底泥連同水一起放入廣口瓶中帶回。第十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2.富集培養(yǎng)采集的樣品中光和細菌的數(shù)量

7、一般較少，并且含有不少雜菌，難以直接進行分離，必須進行富集培養(yǎng)。所謂富集培養(yǎng)，就是為要分離的光和細菌提供適宜的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，使其大量增殖。同時抑制雜菌的生長。第十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 富集培養(yǎng)除了培養(yǎng)基以外，還要給培養(yǎng)物制造缺氧的培養(yǎng)環(huán)境。為此，先將采回的樣品(泥土或水)裝入玻璃圓筒或大型試管或具塞的磨口玻璃瓶中，再倒入預(yù)先配制好的液體培養(yǎng)基，充分攪拌，使樣品與培養(yǎng)基充分分散混合，然后在玻璃圓筒或大型試管中加入液體石蠟，以完全隔絕空氣，防止空氣中的氧氣溶解于培養(yǎng)基中（圖1，a）。光和細菌的富集培養(yǎng)法a.玻璃圓筒富集培養(yǎng)法 b.具塞磨口玻璃瓶富集培養(yǎng)法 1.液體石蠟

8、2.橡皮圈 3. 塑料布第十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月如果用具塞的磨口瓶，則要加滿培養(yǎng)液，蓋上瓶塞，讓多余的培養(yǎng)液總瓶口溢出，瓶內(nèi)不能有氣泡存在。瓶口套上塑料薄膜，用橡皮筋扎以減少水分蒸發(fā)（圖1，b）。第十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月為了加快光和細菌的增殖，除了缺氧的環(huán)境條件以外，適宜的溫度和光照度也很重要。培養(yǎng)溫度一般為2530 ，光照強度為500010000lx，最好一天24h連續(xù)光照，經(jīng)過26周的富集培養(yǎng)，在培養(yǎng)容器的內(nèi)壁逐漸出現(xiàn)光和細菌菌落，或整個培養(yǎng)液長成紅色。一般地說，海水光和細菌比淡水光和細菌生長緩慢，故富集培養(yǎng)的時間更長。第十七張，PPT共三十

9、八頁，創(chuàng)作于2022年6月如果富集培養(yǎng)初步獲得成功，就用吸管或移液管插入菌液中或光和細菌大量繁殖的泥層中，將菌液吸入大型試管或具塞磨口瓶中，加入培養(yǎng)基，按前述的方法和條件繼續(xù)培養(yǎng)。反復(fù)多次后，光和細菌壓倒其他細菌而占絕對優(yōu)勢，培養(yǎng)液呈深紅色，這時富集培養(yǎng)成功。 第十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月（ 3）分離方法一旦富集培養(yǎng)成功，就可以分離培養(yǎng)。淡水生長的紫色非硫細菌生長速度較快，在一周左右移植比較合適，而海水生長的紫色非硫細菌生長速度較慢，培養(yǎng)三周以上才能移植。菌種的分離一般采用平板分離法。平板分離法是使待分離的菌種以單個細胞在平板培養(yǎng)基上分散開，形成一個個菌落，從而達到分離的目

10、的。第十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月紅螺菌屬的分離方法:利用紅螺菌屬細菌具有快速運動的能力來分離這種細菌的方法。在載波片上加一滴無菌水，再在它的近旁加一滴紫色非硫細菌的富集培養(yǎng)液，無菌水旁加一滴培養(yǎng)液，當培養(yǎng)液與無菌水滴結(jié)合時，紅螺菌較其他微生物更快地達到培養(yǎng)液的部位，用微吸管吸出到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這樣反復(fù)移植幾次后，就能在瓊脂斜面或平板上分離取得紅螺菌的菌落，并進一步分離而取得純培養(yǎng)物。第二十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4.菌種的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)方式大量培養(yǎng)光和細菌，通常采用兩種方式進行培養(yǎng)。一種是全封閉式厭氣光照培養(yǎng)方式，另一種是開放式微氣光照培養(yǎng)方式。第二十

11、一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(1) 全封閉式厭氣光照培養(yǎng)全封閉式厭氣光照培養(yǎng)是采用無色透明的玻璃容器或塑料薄膜袋，經(jīng)消毒后，裝入消毒好的培養(yǎng)液接入20%50%的菌種母液，使整個容器均被液體充滿，加蓋（或扎緊袋口），造成厭氣的培養(yǎng)環(huán)境，置于有陽光的地方或人工光源進行培養(yǎng)，定時攪動，在適宜的溫度下，因經(jīng)過510天的培養(yǎng)，即可達到指數(shù)生長期高峰，此時可采收或進一步擴大培養(yǎng)。第二十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 開放式微氣光照培養(yǎng)開放式微氣光照培養(yǎng)，一般采用容量為100200L的塑料桶或500L的鹵蟲孵化桶為培養(yǎng)容器。底部成錐形并有排放開關(guān)的鹵蟲孵化桶比較理想。在桶

12、底部裝一氣石，培養(yǎng)時微充氣，是桶內(nèi)的光和細菌呈上下緩慢翻動。在桶的正上方距桶面30cm左右裝一有罩的白熾燈泡，使液面照度達2000lx左右。培養(yǎng)前把容器消毒，加入消毒好的培養(yǎng)液，接入20%50%的菌種母液，照明，微氣培養(yǎng)。在適宜的溫度下，因經(jīng)過710d的培養(yǎng)，即可達到指數(shù)生長期高峰，此時可采收或進一步擴大培養(yǎng)。第二十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(2) 培養(yǎng)方法光和細菌的培養(yǎng)，按次序分為容器、工具的消毒，培養(yǎng)基的制備，接種和培養(yǎng)管理四個步驟(1) 容器、工具的消毒所有培養(yǎng)用容器(如試管、三角燒瓶等)、工具(如移液管、分液漏斗等)都必須在用前用去污粉、洗液、或肥皂粉等刷洗并沖洗干凈

13、，如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸容器、工具洗刷干凈后，用以下幾種方法進行消毒滅菌:第二十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1)加熱消毒法 A 直接燒灼消毒B 煮沸消毒C 高溫烘箱干燥消毒(干熱滅菌)D 高壓蒸汽消毒(濕熱滅菌)E 化學藥品消毒法a.酒精(C2H5OH)： b.高錳酸鉀(KMnO4)：c.石炭酸(酚C6H6OH)： d.鹽酸(HCl)： 第二十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2)培養(yǎng)基的配制3)滅菌和消毒 (3)接種培養(yǎng)基配好后(培養(yǎng)基需冷卻的要冷卻到適宜的溫度，應(yīng)立即進行接種。開始時由于菌種數(shù)量少，先在試管中培養(yǎng)，然后再逐漸往大培養(yǎng)容器接種。隨著菌種數(shù)量增

14、加，可以加大接種量，掌握在20%50%，即菌種母液量和新配培養(yǎng)液量之比為1:4(20%)1:1(50%)，尤其是微氣培養(yǎng)，接種量不應(yīng)低于1:4(20%)。(4)培養(yǎng)管理第二十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月光和細菌的培養(yǎng)過程中，管理工作包括： A.日常管理操作和測試； B.生長情況的觀察和檢查； C.出現(xiàn)問題的分析處理。第二十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1) 日常管理操作和測試a.攪拌和充氣b.調(diào)節(jié)光照度 c.調(diào)節(jié)溫度： 2) 生長情況的觀察和檢查3)問題的分析和處理第二十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3)問題的分析和處理通過日常管理、檢測、檢查，了解

15、光和細菌的生長情況，就可以結(jié)合當時的環(huán)境條件的變化進行分析，找出影響光和細菌生長繁殖的原因，采取相應(yīng)的措施。第二十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月影響光和細菌生長的原因很多：內(nèi)因：菌種是否優(yōu)良。外因：光照、溫度、pH值、營養(yǎng)、敵害、厭氣程度等。光照、溫度、pH值同時影響著光和細菌的生長，而且光照、溫度、pH值之間是互相制約的，即溫度高，光照應(yīng)弱；溫度低，光照應(yīng)強。如果溫度高，光照強，pH值就會迅速升高，培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀，抑制光和細菌的生長。如果溫度低，光照弱，光和細菌得不到最佳能源，生長速度也慢。經(jīng)試驗得出光和細菌生長的最適條件是：溫度1520時，光照3000050000lx，培養(yǎng)基

16、pH值為7.0；溫度2530時，光照為30005000lx，培養(yǎng)基pH值為7.0。 第三十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月光和細菌培養(yǎng)過程中的問題分析例1 出現(xiàn)問題：測定pH值無大變化，O.D.值不上升，生長受阻。檢查結(jié)果：水溫42，其余條件正常。分析原因：溫度超出生長適應(yīng)范圍。第三十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月例2出現(xiàn)問題：測定O.D.值，升高較慢，光和細菌生長繁殖不快。檢查結(jié)果：磁力攪拌棒偏于邊緣，不起攪拌作用，其余條件正常。分析原因：菌液無攪拌，影響光和細菌的生長。第三十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月例3出現(xiàn)問題：測定pH值和O.D.值均不上升，發(fā)

17、生附壁現(xiàn)象。檢查結(jié)果：環(huán)境條件正常，培養(yǎng)措施得當。分析原因：培養(yǎng)基配制出現(xiàn)差錯，對光和細菌不適合，菌種老化。第三十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4.菌種的保存保存菌種的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基。其配方與分離菌種的培養(yǎng)基相同。也可以根據(jù)分離菌株的特殊要求而另行配制。保存方法第三十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1、培養(yǎng)基盛于小型試管中，經(jīng)滅菌處理待冷卻凝固后備用。2、將分離出來的菌種，穿刺接種于盛有固體培養(yǎng)基的試管中。3、將接種試管置于厭氧光照條件下培養(yǎng)，待長好后取出。4、在光和細菌已充分生長的試管中，加入無菌液體石蠟，以隔絕空氣。也可將保存用的菌株試管，放入大型試管中，其底部加吸氧劑（焦性沒食子酸碳酸鈉），大試管用塞子塞緊并減壓抽氣（圖4）