新型納米仿生骨植入材料的生物相容性的初步研究

1、新型納米仿生骨植入材料的生物相容性的初步研究【摘要】研究新型納米仿生骨植入材料的生物相容性?！痉椒ā坎捎霉撬杌|(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，通過法檢測細(xì)胞相對增殖度，對材料的細(xì)胞毒性進(jìn)展分級(jí)評價(jià)，并采用直接接觸培養(yǎng)法，觀察細(xì)胞在材料上的黏附與分布?！窘Y(jié)果】材料的細(xì)胞毒性分級(jí)在之間，骨髓基質(zhì)細(xì)胞可嚴(yán)密附著于材料外表，黏附生長，并有突起向材料的連通微孔內(nèi)伸展?！窘Y(jié)論】新型納米仿生骨植入材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞無毒性作用，符合醫(yī)用生物材料的平安要求。【關(guān)鍵詞】仿生復(fù)合材料骨髓基質(zhì)細(xì)胞浸提液生物相容性：【】【】，【】，-【】：；新型生物材料的生物相容性是影響其臨床應(yīng)用的主要因素，材料的孔徑形狀、大小以及孔隙率對引導(dǎo)細(xì)

2、胞的附著、侵潤和生長有著重要的作用，由于本實(shí)驗(yàn)材料需要植入體內(nèi)與骨組織嚴(yán)密接觸，因此材料的骨細(xì)胞相容性是本研究的主要內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)采用骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)對新研制的新型納米仿生骨植入材料進(jìn)展了初步評價(jià)，為今后進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。材料和方法材料與儀器新型納米仿生骨植入材料：-羥基丁酸-羥基戊酸共聚物溶膠-凝膠生物活性玻璃-，華南理工大學(xué)材料學(xué)研究所提供。主要儀器和設(shè)備：醫(yī)用超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測儀、倒置相差顯微鏡中山三院中心實(shí)驗(yàn)室提供；-掃描電鏡能譜分析儀信息產(chǎn)業(yè)部電子五所國防科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。主要試劑和材料：培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、等購自晶美生物制品公司。

3、實(shí)驗(yàn)方法材料的掃描電鏡觀察常規(guī)枯燥、外表噴金，進(jìn)展檢查，直接觀察材料的構(gòu)造、多孔形態(tài)、孔徑和孔的貫穿性。材料的孔隙率測定采用常規(guī)稱量法，計(jì)算材料的孔隙率。骨髓基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代采用全骨髓培養(yǎng)法直接貼壁法進(jìn)展原代培養(yǎng)，取傳代生長良好的代細(xì)胞制作細(xì)胞生長曲線。植入材料浸提液的制備植入材料用環(huán)氧乙烷消毒備用，確定材料浸提液的標(biāo)準(zhǔn)濃度為培養(yǎng)液與材料外表積之比：，將支架材料浸入完全培養(yǎng)液中，標(biāo)準(zhǔn)條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中浸提，吸出浸提液，無菌封存，保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯臃椒ㄖ苽浔?、倍、倍、倍、倍、倍?biāo)準(zhǔn)濃度的浸提液。法評價(jià)材料的毒性分級(jí)根據(jù)已繪制的細(xì)胞生長曲線，確定本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞接種濃度和接種的細(xì)胞數(shù)量，測

4、定不同浸提液濃度分組的細(xì)胞相對增殖率，按級(jí)毒性分級(jí)法評分：級(jí)；級(jí)；級(jí)；級(jí)；級(jí)。植入材料的細(xì)胞相容性將植入材料用高糖完全培養(yǎng)基浸泡，使用前用無菌濾紙吸干，置于孔板中。取生長狀態(tài)良好的第代培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為，滴加于材料外表接種于支架材料上，每塊材料上接種細(xì)胞液?滋，靜置后參加培養(yǎng)基至浸沒材料。常規(guī)換液一次，分別于、將細(xì)胞-材料復(fù)合物用或體積分?jǐn)?shù)為戊二醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，乙酸異內(nèi)酯置換，臨界點(diǎn)枯燥，外表噴金后掃描電鏡觀察。結(jié)果材料的構(gòu)造材料呈白色，略有彈性，外表為泡沫多孔狀構(gòu)造圖，掃描電鏡下見材料為疏松多孔構(gòu)造，孔隙多并互相聯(lián)通，孔隙大小約?滋，其中可見納米級(jí)的顆粒鑲嵌或包裹在基體孔壁上圖。

5、材料的孔隙率材料孔隙率的檢測結(jié)果顯示：骨植入材料的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的生長標(biāo)準(zhǔn)曲線，本研究骨植入材料浸提液進(jìn)展細(xì)胞毒性分析的實(shí)驗(yàn)分別在、分三次進(jìn)展，在細(xì)胞培養(yǎng)的開場、進(jìn)入快速增殖期、以及細(xì)胞數(shù)量到達(dá)極限值之前的三個(gè)時(shí)間段完成檢測。結(jié)果見表，可見各濃度組不同時(shí)期的毒性分級(jí)均在級(jí)之間。統(tǒng)計(jì)軟件分析研究結(jié)果顯示：隨著材料浸提液濃度的增高，值略有下降，但該變化并不具有顯著性差異；高濃度的材料浸提液對細(xì)胞生長的影響與低濃度相比并不存在顯著性差異；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量都明顯增加，、三個(gè)測試時(shí)間點(diǎn)上，各濃度組細(xì)胞增殖數(shù)值與對照組相比無明顯差異。不同濃度材料浸提液組，在、天時(shí)檢測的值變化曲

6、線圖顯示：各濃度組的值變化與對照組幾乎完全重疊。骨植入材料中細(xì)胞黏附和生長形態(tài)的觀察細(xì)胞培養(yǎng)第天，可見骨髓基質(zhì)細(xì)胞在材料外表嚴(yán)密貼壁生長，呈長梭形或有長突起的扁平多角形，突觸舒展明顯，相鄰細(xì)胞胞體相連，并向材料孔隙中伸延圖；細(xì)胞培養(yǎng)第天，可見大量骨髓基質(zhì)細(xì)胞在材料外表黏附、增殖，胞體呈梭形、多角形，細(xì)胞生長密集的地方可見細(xì)胞堆積復(fù)層生長圖；細(xì)胞培養(yǎng)第天，仍可見骨髓基質(zhì)細(xì)胞在材料外表黏附、生長，細(xì)胞呈不規(guī)那么形圖。討論充填材料的多孔構(gòu)造與骨的生長骨再生具有三個(gè)根本機(jī)制，即骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨生成。骨傳導(dǎo)是指宿主骨床周圍的毛細(xì)血管和骨祖細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞長入骨缺損區(qū)，而植入材料那么逐漸被宿主

7、新骨組織替代的過程。研究發(fā)現(xiàn)具有類似自然骨的連通微孔構(gòu)造的材料，可以支持和引導(dǎo)新生骨組織通過互相連通的孔道向材料的叢深生長，為骨組織的再生提供理想的支架構(gòu)造?？讖健⒖紫堵室约翱椎倪B通性是評價(jià)材料空間構(gòu)造的幾個(gè)重要的指標(biāo)。本研究采用的骨植入材料為疏松多孔構(gòu)造，孔徑大小為，孔隙率?？紫抖嗲铱卓字g互相連通，有助于新骨組織從材料外表長入內(nèi)部和血液流通。同時(shí)大量的微孔以及較大的比外表積，不僅可使材料體積小，易降解，同時(shí)又能獲得足夠的機(jī)械強(qiáng)度，以滿足臨床治療的需要。骨植入材料的毒性分析材料的細(xì)胞毒性是評價(jià)生物材料與細(xì)胞之間互相作用的最重要的指標(biāo)，而細(xì)胞相對增殖度，那么是材料細(xì)胞毒性評估中的一個(gè)重要參數(shù)。

8、本研究采用法來計(jì)算細(xì)胞，并將細(xì)胞相對增殖率換算成毒性分級(jí)級(jí)，來評估實(shí)驗(yàn)材料的細(xì)胞毒性。研究結(jié)果顯示隨著材料浸提液濃度的增高，值有所下降，但該變化并不具有顯著性差異，說明該材料浸提液濃度的進(jìn)步并不抑制細(xì)胞的生長、增殖；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量都明顯增加，在、三個(gè)測試時(shí)間點(diǎn)上，各濃度組細(xì)胞增殖數(shù)值與對照組幾乎完全重疊，高濃度組的材料浸提液對細(xì)胞生長的影響與低濃度組相比并不存在顯著性差異，說明該材料浸提液的細(xì)胞毒性并未出現(xiàn)濃度依賴性，即使是高濃度的材料浸提液在細(xì)胞培養(yǎng)的開場、進(jìn)入快速增殖期、以及細(xì)胞數(shù)量到達(dá)極限值之前的三個(gè)具代表性的時(shí)間段，都是平安、無毒的；倒置顯微鏡下可見各組各個(gè)時(shí)期的

9、細(xì)胞呈梭形，伸展充分，形態(tài)良好，細(xì)胞密度高，生長旺盛，可見大量分裂細(xì)胞，與對照組相比，無顯著性差異，說明各濃度組的細(xì)胞生長良好；各濃度組不同時(shí)期的毒性分級(jí)均在級(jí)之間，說明該材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞無細(xì)胞毒性作用，符合生物材料的醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)。本研究的骨植入材料共制備了終濃度為倍、倍、倍、倍、倍、倍、倍標(biāo)準(zhǔn)濃度的種浸提液，較全面地討論了該材料浸提液的細(xì)胞毒性。同時(shí)本研究根據(jù)材料植入體內(nèi)部位和使用目的的要求，選擇骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為體外培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，更好地模擬出了植入材料在體內(nèi)骨組織中的真實(shí)情況，準(zhǔn)確地反映出實(shí)驗(yàn)材料的細(xì)胞毒性及其與骨髓基質(zhì)細(xì)胞間的互相作用。骨植入材料的細(xì)胞相容性觀察植入材料與細(xì)胞之間的互相作用是研究植入材料細(xì)胞相容性的重要內(nèi)容，采用直接接觸的細(xì)胞培養(yǎng)法，可以直接觀察到細(xì)胞在材料外表貼附的情況，一旦材料中有毒性物質(zhì)釋放時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和增殖狀態(tài)會(huì)立即發(fā)生變化，為材料的細(xì)胞相容性提供最直觀的證據(jù)，其評價(jià)結(jié)果客觀、敏感和有效。本研究結(jié)果顯示：骨髓基質(zhì)細(xì)胞能嚴(yán)密附著于植入材料外表，貼附生長，并有突起向材料的連通微孔內(nèi)伸展，增殖狀態(tài)良好，結(jié)果證實(shí)該材料具有優(yōu)良的細(xì)胞親和性，這可能與材料的構(gòu)造有關(guān)。由于植入材料具有泡沫多孔狀構(gòu)造，具有大小適宜的孔徑、較高