分子量及?；w對酶促魔芋葡甘聚糖?；磻?yīng)的影響(共12頁)

1、 燕京理工學(xué)院藥物合成反應(yīng)論文分子量及?；w對酶促魔芋葡甘聚糖?；磻?yīng)(fnyng)的影響摘 要研究了在有機(jī)介質(zhì)叔丁醇中魔芋葡甘聚糖（KGM）的分子量及?；w對固定化脂肪酶NoVoZym435 催化KGM 乙?；磻?yīng)的影響. KGM 的分子量對酶促其酰化反應(yīng)的活性及產(chǎn)物取代度有顯著影響. 隨著KGM 分子量的增大，酶催化反應(yīng)的速率逐漸下降，產(chǎn)物的取代度逐漸減小. KGM 分子量對該反應(yīng)的影響與不同分子量KGM 的溶解度、體系粘度、空間位阻及顆粒形態(tài)等因素有關(guān). 以不同鏈長的脂肪酸乙烯酯為?；w時，隨著?；w中脂肪酸碳鏈的增長，酶促KGM ?；磻?yīng)速率逐漸下降，產(chǎn)物的取代度逐漸減小，且該

2、?；磻?yīng)具有高度(god)的區(qū)域選擇性，反應(yīng)均發(fā)生在C6- OH 上.關(guān)鍵詞：魔芋(my)葡甘聚糖 ?；磻?yīng) 區(qū)域選擇性 脂肪酶 分子量 酰基供體前 言魔芋葡甘聚糖（KGM）是一種來源于植物魔芋的天然多糖，由D- 葡萄糖和D- 甘露糖（按摩爾比約11. 6 ）通過!-1 ， 4- 吡喃糖苷鍵結(jié)合而成，在其主鏈甘露糖的C3 位置上往往存在著通過!-1 ，3糖苷鍵結(jié)合的支鏈結(jié)構(gòu)；天然KGM 分子(fnz)除含葡萄糖和甘露糖外，可能還有微量的乙?；嬖? !3. KGM 具有優(yōu)良的生物相容性、可生物降解性和獨(dú)特的理化性質(zhì). KGM 改性后因修飾基團(tuán)的性質(zhì)不同而具有不同的用途，可作為一種新型藥物4 ，

3、5、環(huán)境友好的表面活性劑6 或藥物載體7 等.糖酯可用化學(xué)方法合成，但傳統(tǒng)的化學(xué)合成常在高溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件苛刻，且反應(yīng)的區(qū)域選擇性較低8 !10. 此外，化學(xué)方法合成的糖酯顏色較深（深褐色），且常因含有一些有毒的化學(xué)物質(zhì)而難應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥工業(yè). 與化學(xué)方法相比，酶法合成不但簡單易行，環(huán)境友好，而且區(qū)域選擇性高9. 相對于小分子單糖而言，國內(nèi)外對多糖高分子化合物生物轉(zhuǎn)化的研究甚少. 我們曾對有機(jī)介質(zhì)中酶促KGM 乙?；磻?yīng)進(jìn)行過研究，并考察一些因素（如有機(jī)溶劑、反應(yīng)初始水活度、搖床轉(zhuǎn)速、溫度和酶濃度）對酶促酰化反應(yīng)的影響規(guī)律11. 隨著分子量的增大，高分子化合物的理化性質(zhì)與其單體

4、小分子化合物的差異(chy)逐漸加大，故以其為底物的生物催化反應(yīng)的特性也將呈現(xiàn)出明顯的差異. 另據(jù)報道，不同分子量的KGM 經(jīng)修飾后得到的產(chǎn)物具有不同的理化性質(zhì)和應(yīng)用價值4 -17. 因此，探討KGM分子量大小對酶促KGM 酰化反應(yīng)的影響規(guī)律(gul)具有重要的理論和實際意義. 迄今，有關(guān)這方面的研究國內(nèi)外尚未見有文獻(xiàn)報道.本文主要探討有機(jī)介質(zhì)叔丁醇中KGM 分子量及?；w對固定化脂肪酶NOVOZym 435 催化KGM?；磻?yīng)的影響. 其目的在于揭示底物分子量對酶促?；磻?yīng)的影響規(guī)律，豐富對酶反應(yīng)、酶識別(shbi)等酶學(xué)理論問題的認(rèn)識；并合成具有不同分子量、不同理化性質(zhì)和應(yīng)用范圍的KGM

5、 ?；a(chǎn)物.1 實驗(shyn)部分1.1 酶及主要(zhyo)試劑NOVOZym 435（10 Umg ）購自丹麥NOVOZymes公司(n s)，固定化于大孔丙烯酸樹脂；天然KGM 樣品（MW=980 000 ）由海南多環(huán)保健品有限公司北海分公司贈送. 不同分子量的KGM 樣品由酶法降解制得12. KGM 樣品使用前充分研磨，過120 目篩，備用. 乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和硬脂酸乙烯酯購自Aldrich 公司，純度均為99 % 以上. 其他試劑均為市售分析純試劑.1.2 酶促KGM?；磻?yīng)在25 ml 帶塞的三角瓶中分別加入0. 4 g（含2. 5 mmOl 糖單

6、元）的KGM，0. 24 g 的NOVOZym435 ，7. 5 mmOl 脂肪酸乙烯酯和10 ml 叔丁醇（初始水活度0. 75 ），置于水浴恒溫振蕩器中（50 C，150!200 rmi n ）反應(yīng)一定時間. 反應(yīng)體系初始水活度（aW）的控制及產(chǎn)物分離參見文獻(xiàn)11 . 反應(yīng)體系粘度采用美國BrOOkfield 公司DV-I 型旋轉(zhuǎn)式粘度計測定. KGM ?；a(chǎn)物的取代度（DS）用皂化法測定11. 根據(jù)下式分別計算KGM ?；a(chǎn)物的酯化率（C）和產(chǎn)物的取代度（DS）C=（Va -Vb）N（HCI ）M（RCO- ）/1000msDS= 162C/M（RCO- ）-（M（RCO- ）-1 ）C

7、式中，Va為滴定空白樣品所消耗的HCl 溶液的體積（ml ），Vb為滴定被測樣品所消耗的HCl 溶液的體積（ml ），N（HCl ）為HCl 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mOlL），M（RCO- ）為?；w中?；鵕CO- 的摩爾質(zhì)量（gmOl ），ms為被測樣品的質(zhì)量（g）.每個樣品同時做3 個平行試樣，取平均值為測定結(jié)果. 用該法測定的平均誤差小于1 % .產(chǎn)物的收率Y 和反應(yīng)初始速率V0分別由下式計算：Y= 162m（est ）/m（KGM）（162 + 42DS）V0 = DSt式中，m（est ）為實際分離得到的KGM 脂肪酸酯的量（g ），m（KGM）為加入的底物量（g ），DS 為酶促反應(yīng)初始

8、階段產(chǎn)物的取代度，t為反應(yīng)時間（h）.酶促KGM ?；磻?yīng)的區(qū)域選擇性主要根據(jù)?；昂驥GM 主鏈上葡萄糖或甘露糖殘基碳原子化學(xué)位移的變化來判斷. 將5 !10 mg 底物或產(chǎn)物溶于0. 5 ml 的六氘代二甲基亞砜（DMSO- d6）中，裝入樣品管，以四甲基硅烷為標(biāo)準(zhǔn)物，用德國Bruker 公司DRX-400 型核磁共振儀測定樣品的13C NMR 譜.2 結(jié)果(ji gu)于討論2.1 分子量對酶促KGM乙?；磻?yīng)(fnyng)的影響KGM 是一種高分子聚合物，不同分子量的KGM具有不同的顆粒結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài). 這種差異影響其在溶劑中的溶解性能、運(yùn)動行為及高分子溶液的流體力學(xué)(li t l x

9、u)性質(zhì)（如擴(kuò)散、粘度等）.本文采用脂肪酸乙烯酯為酰基供體進(jìn)行酶促不同分子量的KGM 的?；磻?yīng).表1 為叔丁醇介質(zhì)中的酶促KGM 乙酰化反應(yīng). 可以看出，KGM 分子量對酶促乙?；磻?yīng)影響顯著. 隨著KGM 分子量的減小，反應(yīng)初始速率和產(chǎn)物的DS 逐漸增大. 但是，總體來看，KGM 分子量為980 000 -306 000 時，酶促其乙?；磻?yīng)的活性甚低，反應(yīng)初始速率及產(chǎn)物的DS 均較小；KGM分子量為269 000 -176 000 時，酶促其乙?；磻?yīng)表現(xiàn)出一定的活性；KGM 分子量為127 000-77 000 時，酶促其乙?；磻?yīng)的活性較高，反應(yīng)初始速率及產(chǎn)物DS 均明顯增大；KGM

10、 分子量為61 000-10 800 時，酶促其乙?；磻?yīng)呈現(xiàn)出頗高的活性，且底物分子量對反應(yīng)初始速率及產(chǎn)物DS的影響較小.表一 叔丁醇介質(zhì)中的酶促KGM乙?；磻?yīng)對于(duy)酶促KGM 酰化反應(yīng)，底物在介質(zhì)中的溶解度是一個非常重要的影響因素. 隨著KGM 分子量的增大，其在叔丁醇中的溶解度呈降低趨勢.KGM分子量為980 000 -306 000 時，其在叔丁醇中的溶解度較小；KGM 分子量為127 000 -77 000時，其在叔丁醇中的溶解度明顯(mngxin)增大.反應(yīng)體系的粘度對于酶促KGM ?；磻?yīng)也是一個(y )非常重要的影響因素. 高分子化合物的分子量對體系的粘度有著顯著的影

11、響. 由表1 可以看出，KGM分子量為980 000 -306 000 時，雖然其在介質(zhì)叔丁醇中的溶解度較低，但體系的粘度較大；KGM 分子量為127 000 -77 000 時，底物的溶解度較高，但體系的粘度較小. 這主要是由不同分子量KGM 本身結(jié)構(gòu)特性所決定的.由表1 還可以看出，隨著振蕩速率的提高，酶促KGM 乙酰化反應(yīng)初始速率均逐漸加快. 底物KGM分子量較大時，酶促其乙酰化反應(yīng)明顯加快；底物KGM分子量較小（61 000 -10 800 ）時，振蕩速率對酶促反應(yīng)的加速作用不甚明顯. 這說明在KGM 分子量較大時傳質(zhì)阻力較大，需要較強(qiáng)烈的振蕩才能基本消除擴(kuò)散限制.對于酶促KGM ?；?/p>

12、反應(yīng)，KGM 的顆粒形態(tài)也是一個非常重要的影響因素. 圖1 為不同分子量的KGM 的掃描電鏡照片. 可以看出，3 種不同分子量的KGM 顆粒結(jié)構(gòu)差別較大. 隨著KGM 分子量的減小，KGM 顆粒的平均粒徑逐漸減小. 放大1 500 倍時，可以明顯發(fā)現(xiàn)這3 種不同分子量的KGM 單顆粒的差別：圖1（a/ ）中的KGM 顆粒表面密實、平滑，只有少量的隆起和較淺的刻痕；圖1（b/ ）中的KGM 顆粒呈多孔不規(guī)則狀，有大量突起，其結(jié)構(gòu)明顯比較疏松；圖1（c/ ）中的KGM 則呈絮狀，其結(jié)構(gòu)更為疏松. 放大10 000 倍時可以更加清楚地看到，隨著KGM 分子量的減小，表面變得粗糙、多孔，結(jié)構(gòu)更疏松.

13、表面粗糙、多孔，有利于底物與酶的充分接觸，增大碰撞幾率，提高反應(yīng)速率；結(jié)構(gòu)疏松，有利于底物在溶劑中的分散和溶解，并降低擴(kuò)散阻力. 另一方面，小分子量的KGM 作為底物時，進(jìn)入酶活性中心的空間位阻較小.2.2 酰基供體對酶促KGM?；磻?yīng)(fnyng)的影響酰基供體脂肪酸碳鏈的長度亦影響酶促KGM?；磻?yīng)(fnyng). 一方面，隨著脂肪酸乙烯酯碳鏈的加長，其疏水性增強(qiáng)，與酶活性中心的親和力增大，有利于酶促?；磻?yīng). 另一方面，脂肪酸乙烯酯碳鏈加長，空間位阻增大，不利于酶- 底物中間物的形成. 為了揭示?；w結(jié)構(gòu)對酶促KGM 酰化反應(yīng)的影響規(guī)律，合成具有不同理化性質(zhì)和用途的KGM 酰化產(chǎn)物，對

14、比研究了酶促KGM 與一系列脂肪酸乙烯酯的?；磻?yīng). 表2 為?；w對酶促KGM ?；磻?yīng)的影響. 可以看出，隨著?；糠值闹舅崽兼湹脑鲩L，NoVoZym435 催化KGM ?；磻?yīng)速率逐漸減慢，產(chǎn)物的DS 逐漸減小. 可見，隨著酰基供體分子的增大，其空間位阻對該反應(yīng)的影響起主導(dǎo)作用. Pedersen 等14 對NoVoZym 435 催化二糖（蔗糖和麥芽糖）合成糖酯的研究(ynji)表明，隨著?；w脂肪酸碳鏈的增長（C4 -C12 ），酶促反應(yīng)速率急劇下降；他們認(rèn)為?；w碳原子數(shù)增加，空間位阻逐漸增大，是造成酶促反應(yīng)速率減慢的主要因素.表二 ?；w對酶促KGM?；磻?yīng)的影響Tab

15、le 2 Effect of acyl donors on li pase-catalyZed acylationof KGM（MW=77 000 ）Reaction conditions ：m（KGM）= 0. 4 g ，n（RCO2CHI CH2）= 7. 5 mmol ，m（NoVoZym435 ）=0. 24 g ，V（t- BUOH）=l0ml ，aW=0. 75 ，f=l50 rmi n ，!=50 C，t=48 h .2.3 酶促KGM?；磻?yīng)(fnyng)的區(qū)域選擇性與化學(xué)方法相比，酶法的突出優(yōu)點是其區(qū)域選擇性高. 以特定位點修飾的多糖衍生物作為藥物(yow)或進(jìn)行分析，可確定

16、有機(jī)介質(zhì)叔丁醇中酶促酰化反應(yīng)的區(qū)域選擇性. 表3 為KGM 和?；腒GM 中碳原子的化學(xué)位移. 底物KGM 中葡萄糖殘基或甘露糖殘基各碳原子的歸屬根據(jù)文獻(xiàn)16 確定.表3 KGM和?；腒GM中碳原子的化學(xué)(huxu)位移由表3 可以看出，乙?；腒GM 在化學(xué)位移21. 4 和172. 6 !170. 4 處出現(xiàn)兩個新峰，分別被歸屬為乙酰基的H3C- 和C=O 中的碳原子. 這進(jìn)一步證明了酰化反應(yīng)的發(fā)生. 根據(jù)大量的碳譜數(shù)據(jù)(shj)建立的?；磻?yīng)前后碳原子化學(xué)位移的變化規(guī)律是：發(fā)生?；磻?yīng)的碳原子的化學(xué)位移向低場移動；受70. 9 . 綜上所述，酶促KGM 乙酰化反應(yīng)發(fā)生在C6-OH上.

17、 當(dāng)以其他脂肪酸乙烯(y x)酯為酰基供體時，酶促KGM 酰化反應(yīng)的區(qū)域選擇性與乙?；磻?yīng)相同.結(jié) 論研究(ynji)了在有機(jī)介質(zhì)叔丁醇中分子量及?；w對固定化脂肪酶Novozym435 催化KGM 乙?；磻?yīng)的影響. KGM 的分子量對酶促其?；磻?yīng)有顯著的影響. 隨著KGM 分子量的減小，酶促其酰化反應(yīng)的活性逐漸升高. 以不同鏈長的脂肪酸乙烯酯為?；w時，隨著?；w中脂肪酸碳鏈的增長，酶促KGM ?；磻?yīng)速率逐漸減慢，產(chǎn)物的取代度逐漸減小. 核磁共振分析表明，有機(jī)介質(zhì)叔丁醇中酶促KGM ?；磻?yīng)具有高度的區(qū)域選擇性，反應(yīng)發(fā)生在C6- OH上.參考文獻(xiàn)1 Kato K，Matsuda

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