(整理)酶工程實(shí)驗(yàn)3

1、精品文檔實(shí)驗(yàn)一過氧化氫酶米氏常數(shù)的測定一、目的了解米氏常數(shù)的意義，測定過氧化氫酶的米氏常數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理h2o2被過氧化氫酶分解出h2o和02，未分解的h2o2用kmno4在酸性環(huán)境中滴定，根據(jù)反應(yīng)前后H2O2的濃度差可求出反應(yīng)速度。H2O22H2O+0212KMNO4+5H2O+3H2SO42MnSO4+5O2+8H2O本實(shí)驗(yàn)以馬鈴薯提供過氧化氫酶，以1/v1/S作圖求Km三、實(shí)驗(yàn)器材錐形瓶100150ml(X6)O吸管1.0ml(X2)、0.5ml(X2)、2.0ml(X2)、5ml(X2)、10.0ml(X1)。溫度計(jì)(0100C)。微量滴定管5ml(X1)。容量瓶1000ml(X1)。

2、四、實(shí)驗(yàn)試劑1、0.02mol/L磷酸緩沖液(Ph70)取磷酸二氫鉀0.68g,加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1ml,用水稀釋至100ml,即得。2、酶液：稱取馬鈴薯5g,加上述緩沖液10ml,勻漿，過濾。3、0.02mol/LKMnO4:稱取KMnO4(AR)32g,加蒸餾水1000ml，煮沸15min，2d后過濾，棕色瓶保存。4、0.004mol/LKMnO4:準(zhǔn)確稱取恒重草酸鈉02g，加250ml冷沸水及10ml濃硫酸，攪拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微紅色，水浴，加熱至65C，繼續(xù)滴定至溶液微紅色并30s不褪，算出KMnO4的準(zhǔn)確濃度稀釋成0.004mol/L即可。

3、5、0.05mol/LH2O2：取30%H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度（約0.2mol/L）,用標(biāo)準(zhǔn)KMnO4（0.004mol/L）標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度，稀釋成0.05mol/L（標(biāo)定前稀釋4倍，取2.0ml,加25%H2SO42.0ml,用0.004mol/LKMnO4滴定至微紅色）。6、25%H2SO4五、操作取錐形瓶6只，按下表順序加入試劑：表一過氧化氫酶米氏常數(shù)的測定試劑管號0123450.05mol/LH2O2/ml01.001.251.672.55.00蒸餾水/ml9.58.508.257.837.04.50酶液/ml0.50.50.50.50.50.5先加好

4、0.05mol/LH2O2及蒸餾水，加酶液后立即混合，依次記錄各瓶的起始反應(yīng)時間。各瓶時間達(dá)5min時立即加2.0ml25%硫酸終止反應(yīng)，充分混勻。用0.004mol/LKMnO4滴定各瓶中剩余的電02至微紅色，記錄消耗的KMnO4體積。六、計(jì)算分別求出各瓶的底物濃度S和反應(yīng)速度V。S=c1V1/10C1V1C2V式中S：底物物質(zhì)的量濃度（mol/L）；5：H2O2物質(zhì)的量濃度（mol/L）；V：H2O2體積（ml）；10：反應(yīng)的總體積（ml）；U:反應(yīng)速度（mmol/min）；c:KMnO4物質(zhì)的量濃度（mol/L）；24V2：KMnO4體積（ml）；以1/u對1/S作圖求出Km。實(shí)驗(yàn)二酶促

5、反應(yīng)中初速度時間范圍測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私饷复俜磻?yīng)中初速度時間范圍測定的基本原理；掌握酶促反應(yīng)中初速度時間范圍的測定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理酸性磷酸酯酶(acidphosphatase,EC3.1.3.2)廣泛分布于動植物體中，尤其是植物的種子、動物肝臟和人體的前列腺中。它對生物體內(nèi)核苷酸、磷蛋白和磷脂的代謝起著重要作用。酸性磷酸酯酶能專一性水解磷酸單酯鍵。以人工合成的對硝基苯磷酸酯(4-nitrophenylphosphate,NPP)作底物，水解產(chǎn)生對硝基苯酚和磷酸。在堿性溶液中，對硝基酚的鹽離子于405nm處光吸收強(qiáng)烈，而底物沒有這種特性。利用產(chǎn)物的這種特性，可以定量的測定產(chǎn)物的生成量，從而求得

6、酶的活力單位。即通過測定單位時間內(nèi)405nm處光吸收值的變化來確定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶的一個活力單位是指在酶反應(yīng)的最適條件下，每分鐘生成mol產(chǎn)物所需的酶量。要進(jìn)行酶活力測定，首先要確定酶反應(yīng)時間。而酶的反應(yīng)時間應(yīng)該在初速度時間范圍內(nèi)選擇?？梢酝ㄟ^進(jìn)程曲線的制作來求出酶的初速度時間范圍。進(jìn)程曲線的制作是指在酶反應(yīng)的最適條件下，采用每隔一定時間測定產(chǎn)物生成量，以酶反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成。從進(jìn)程曲線可知，在曲線起始的一段時間內(nèi)為直線，其斜率代表初速度。隨著反應(yīng)時間的延長，曲線趨于平坦，斜率變小，反應(yīng)速度下降。要真實(shí)反映出酶活力大小，就應(yīng)在初速度時間內(nèi)測定。三、實(shí)驗(yàn)

7、試劑與器材試劑(1)酸性磷酸酯酶原液(從綠豆芽中提取)(2)酸性磷酸酯酶液(通過原酶液稀釋得到)取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0檸檬酸鹽緩沖液稀釋，使進(jìn)程曲線中第11號管吸光度A40在0.60.7之間。405（3）1.2mmol/L對硝基苯磷酸酯精確稱取NPP0.4454g，加緩沖液定容至100mL。（4）0.3mol/LNaOH溶液2器材恒溫水浴槽，可見分光光度計(jì)，試管，刻度吸管，離心機(jī)。四、操作步驟酸性磷酸酯酶原酶液的制備稱取一定重量的綠豆，浸泡24h,在2530C溫箱中培養(yǎng)57d。長出的豆芽取其頸部，依次用自來水和重蒸水沖洗干凈，置濾紙上吸干水分，稱30g放入研缽中勻漿，加0.

8、2mol/L乙酸鹽緩沖液4mL，置4C冰箱中6h以上。然后用雙層紗布擠壓過濾，濾液6000r/min離心15min,上清液置透析袋用蒸餾水充分透析，間隔換水10次，透析24h以上。將透析后酶液稀釋至最終體積與豆芽質(zhì)量（g）相等，以6000r/min離心30min，所得上清液即為原酶液，置冰箱待用。酶促反應(yīng)取試管12支，按表1.1編號，0號為空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支試管，各加入稀釋好的酶液7mL，在酶反應(yīng)前底物與酶都放入35C恒溫水浴槽中預(yù)熱2min。然后向111號管內(nèi)各加入1.0mL預(yù)熱的酶液。立即搖勻并開始計(jì)時。按時間間隔為3min、5min、7min、10m

9、in、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min進(jìn)行反應(yīng)。待反應(yīng)進(jìn)行到上述各相應(yīng)時間時，加入3.0mL0.3mol/LNaOH終止反應(yīng)。冷卻后以0號管作空白（0號管加入1.0mLNPP后保溫25min，然后加入3.0mL0.3mol/LNaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度計(jì)上測定各管A值。405數(shù)據(jù)處理以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制進(jìn)程曲線。由進(jìn)程曲線中直線部405分求出酸性磷酸酯酶反應(yīng)初速度的時間范圍。表1.1制作酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線時各物質(zhì)加入量試管號12345678910110NPP(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.0

10、1.01.01.01.0稀釋酶液(mL)1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0反應(yīng)時間(min)3571012152025304050250.3MNa0H(mL)3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0五、實(shí)驗(yàn)報告繪出酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算酸性磷酸酯酶反應(yīng)初速度的時間范圍。實(shí)驗(yàn)三酵母蔗糖酶的部分純化與酶活測定一、目的：了解酶的純化方法。二、原理：酵母中含有豐富的蔗糖酶(EC.321.26),本實(shí)驗(yàn)以酵母為原料，通過破碎細(xì)胞方式得到粗酶，并用熱變性法除雜蛋白純化。(請參考相關(guān)教材)三、試劑與儀器1、試劑與材料：干酵母

11、石英砂1mol/L醋酸溶液2mol/L氫氧化鈉溶液醋酸緩沖液(pH4.6)5%蔗糖溶液DNS(3,5-二硝基水楊酸)試劑2、儀器：電子天平、離心機(jī)、分光光度計(jì)、水浴鍋、電爐、研缽、試管、三角瓶、量筒移液管。四、操作方法1、破碎細(xì)胞取2g干酵母于研缽中，加入2g石英砂，加30ml去離子水，研磨15min，放入冰箱冷凍室(-20C)冰凍約20min(研磨液面上剛出現(xiàn)冰結(jié)為宜)。取出冷凍酵母，再研磨5min后，在5000r/min條件下離心12min，小心取出上清液(組分一)并量出體積V,分別取0.5ml上清液到試管A、B中，余者倒入三角瓶。2、純化把三角瓶中的上清液用1mol/L醋酸溶液調(diào)pH5.

12、0（試紙）。然后迅速放入到55的水浴中，保溫30min。之后在冰浴中迅速冷卻。在5000r/min條件下離心12min。取出上清液（組分二）并量出體積V2，分別取0.5ml上清液到試管C、D中。3、酶反應(yīng)取四支試管，分別按順序加入反應(yīng)物：試管編號酶液氫氧化鈉溶液醋酸緩沖液蔗糖溶液A（對照管）0.5ml1ml1ml1mlB0.5ml2ml1mlC（對照管）0.5ml1ml1ml1mlD0.5ml2ml1ml試管中反應(yīng)物在55C水浴中反應(yīng)5min（秒表計(jì)時）后，B、D管立即各加入1ml氫氧化鈉溶液（2mol/L）終止反應(yīng)，A、C管中各加入1ml蒸餾水。4、酶催化產(chǎn)物檢測取5支試管，分別加入反應(yīng)物：

13、試管編號反應(yīng)液DNS試齊U10.5mlA0.5ml20.5mlB0.5ml30.5mlC0.5ml40.5mlD0.5ml5（空白）0.5ml蒸餾水0.5ml試管中反應(yīng)物在沸水浴中反應(yīng)5min，然后冷卻。加入4ml蒸餾水。將各試管搖勻，用空白管溶液（5號管）調(diào)零點(diǎn)，測定它們的吸光度值A(chǔ)540。五、結(jié)果計(jì)算1、酶活力單位的定義：本實(shí)驗(yàn)中，蔗糖酶的活力單位指在55C條件下，每1min催化底物轉(zhuǎn)化為1mg還原糖的酶量。2、酶活計(jì)算：粗酶的計(jì)算酶活（組分一）：(B-A)x5x5ABSABS454.5x-0.5純化后酶的計(jì)算酶活（組分二）：(D-C)x5x5ABSABS454.5x-0.53、總酶活的計(jì)

14、算：（V總酶活1（組分一，粗酶）：計(jì)算酶活X稀釋倍數(shù)厶10.5丿（V總酶活2（組分二，純化后酶）：計(jì)算酶活X稀釋倍數(shù)厶10.5丿4、酶活回收率的計(jì)算：酶活回收率=總酶活2總酶活1x100%附：還原糖和總糖的測定3,5-二硝基水楊酸比色法還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。還原

15、糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。實(shí)驗(yàn)四蔗糖酶包埋及固定化酶活測定一、目的：了解凝膠包埋法及固定化酶活測定方法。二、原理：海藻酸鈉在遇到Ca2+時成膠，從而把酶包埋在其中。（請參考相關(guān)教材）三、試劑與儀器1、試劑與材料（8）干酵母（9）海藻酸鈉(10)無水氯化鈣(11)5%蔗糖溶液(12)DNS（3,5-二硝基水楊酸）試劑2、儀器：電子天平、分光光度計(jì)、水浴鍋、電爐

16、、燒杯、玻棒、量筒、試管、量筒、移液管、注射器（帶7號針頭）、紗布。四、操作方法4、配A液取0.75g海藻酸鈉溶在25ml蒸餾水中，沸水?。ㄎ鹩秒姞t直接加熱）充分溶脹。自然冷卻。5、配B液取1g干酵母溶在25ml蒸餾水中（室溫），攪勻。6、配C液A液冷卻后，將B液倒入其中，攪勻。4、配CaCl2液取2.2g無水CaCl2溶于200ml蒸餾水中。5、制備膠珠用注射器（7號針頭）將C液滴入CaCl2溶液，滴時不斷攪拌溶液。靜置20min,固化膠珠。紗布過濾得到膠珠，用蒸餾水清洗膠珠，稱取濕膠珠質(zhì)量（W1）,并記錄。6、催化取1g濕膠珠置于燒杯中，加入20ml5%蔗糖溶液，37C反應(yīng)10min,取出

17、反應(yīng)液，與膠珠分離，反應(yīng)終止。7、酶催化產(chǎn)物檢測將反應(yīng)液定容至20ml，取0.5ml稀釋至5ml，得D液。取2支試管，分別加入反應(yīng)物：試管編號反應(yīng)液DNS試齊U10.5mlD0.5ml2（空白）0.5ml蒸餾水0.5ml試管中反應(yīng)物在沸水浴中反應(yīng)5min，然后冷卻。加入4ml蒸餾水。將各試管搖勻，用空白管溶液調(diào)零點(diǎn)，測定它們的吸光度值A(chǔ)540。五、結(jié)果計(jì)算5、酶活力單位的定義：本實(shí)驗(yàn)中，蔗糖酶的活力單位指在37C條件下，每1min催化得到1mg還原糖所需酶量。Ax一x55404520 xx-100.50.56、酶活計(jì)算：1g固化酶酶活：六、思考題1、海藻酸鈣包埋法中鈣起什么作用？與豆腐制作中C

18、a2+的作用有何關(guān)系？2、除了凝膠包埋法，還有哪些包埋方法？其原理是什么？實(shí)驗(yàn)五尼龍固定化木瓜蛋白酶一、目的：了解共價交聯(lián)法固定酶的原理和步驟二、原理尼龍是聚酰胺物質(zhì)，經(jīng)HCl水解后暴露出游離NH2，NH2與戊二醛反應(yīng)，尼龍即成活化載體，可與酶表面NH2反應(yīng)，把酶連在尼龍上。三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1、材料尼龍布(86或66),140目，剪成3cmX3cm2、儀器恒溫水浴鍋(2)紫外分光光度計(jì)(3)冰箱3、試劑18.6%CaCl2溶液(2)甲醇溶液(3)3.65mol/LHCl溶液0.2mol/L硼酸緩沖液(pH值8.5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸緩沖液配制，pH值8.5O.lmo

19、l/L磷酸緩沖液(pH值7.8)(7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液(8)0.5mol/LNaCl溶液(9)O.lmol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)激活劑：用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制。10%三氯乙酸(TCA)溶液。四、操作步驟1、固定化酶的制備(1)每組取5塊尼龍布洗凈、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，輕輕攪拌5min以上至尼龍發(fā)粘。取出后用水洗滌，用濾紙吸干。將尼龍布用3.65mol/LHCI溶液在室

20、溫下水解45min,用水洗至pH值中性(pH試紙檢測)。將尼龍布用5%戊二醛溶液在室溫下浸泡偶聯(lián)20min。取出尼龍布，用O.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.8)洗滌3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室溫下固定30min。從酶液中取出尼龍布，用0.5mol/LNaCl溶液(用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即為尼龍固定化酶。2、酶活力測定0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活劑+1ml酪蛋白液0.2ml木瓜蛋白酶+1.8ml激活劑+2ml10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液固定化酶一張(剪碎)+2.0ml激活劑+1ml酪蛋白

21、液取三支試管按上述加入反應(yīng)液，37C反應(yīng)15min，A、C+2ml10%三氯乙酸。三支試管過濾上清液到另三支試管中，以B管作空白，測試管A、C吸光值(280nm，紫外)五、結(jié)果計(jì)算1.酶活定義：每15min增加0.001個消光值所需酶量為1個酶活單位。2.酶活回收=固定化酶活x5溶液酶活x5/0.2x100%六、注意事項(xiàng)尼龍布的處理是本實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，既要讓其充分地活化，又不能使其破碎固定化酶溶液濃度最好為0.51mg/mL，對每塊尼龍布用量不宜超過0.8mL。酶活性測定的反應(yīng)時間一定要準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)六、產(chǎn)淀粉酶菌株的快速篩選一、目的學(xué)習(xí)和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和篩選方法。二、原理產(chǎn)淀粉酶的

22、菌株能分泌淀粉酶到菌落周圍的培養(yǎng)基中，從而水解培養(yǎng)基中的淀粉，由于使用的是經(jīng)活性染料標(biāo)記的帶顏色的淀粉（本實(shí)驗(yàn)為RBV-淀粉，呈鮮艷的紫紅色），當(dāng)其被淀粉酶作用后便形成可溶，且較易擴(kuò)散的小分水解物，從而在該菌落周圍形成顏色較淺的透明圈。而透明圈直徑與菌落直徑之比則可反應(yīng)菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、簡單易行等優(yōu)點(diǎn)。圖1產(chǎn)淀粉酶菌落形成的透明圈三、材料、試劑和儀器1、菌的來源取不同地點(diǎn)的表層土壤2、試劑：RBV-Starch(Sigma),NaNO3,K2HPO4,MgSO4,KCl,2mol/LNaOH無菌水和瓊脂粉等。3、器皿250mL三角瓶兩個、9.0cm培養(yǎng)皿若干、涂布棒、20

23、0卩L移液槍、200卩L槍頭若干、牙簽若干、指形管若干、10mL具塞刻度試管四支、滴管四支、取樣器和塑料直尺等。4、儀器設(shè)備高壓消毒鍋、恒溫通氣式培養(yǎng)箱、搖床、離心機(jī)、電子天平等。四、實(shí)驗(yàn)操作步驟1、器皿的消毒：培養(yǎng)皿、槍頭、牙簽、指形管、塞刻度試管、滴管四支等用四層報紙包好，在121C下滅菌20min，取出備用。2、培養(yǎng)基的配制與滅菌培養(yǎng)基的組成為：RBV-淀粉(1.2%,w/v),NaNO3(0.2%,w/v),K2HPO4(0.2%,w/v),MgSO47H2O(0.1%,w/v),KC1(0.1%,w/v),瓊脂(2%,w/v),調(diào)PH至6.0左右。在三角瓶中，121C滅菌20min，將滅菌后的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，每皿大約15mL，靜置凝固備用。(倒平板之前務(wù)必將培養(yǎng)基搖晃均勻，以避免標(biāo)記的RBV-淀粉在培養(yǎng)基中分布不均勻，影響菌落的觀察。)3、土樣的采集及稀釋于校園等不同地點(diǎn)采集土壤樣品；取樣時，用取樣器向下打取1cm左右深度的土樣，將從各個地點(diǎn)取得的土樣混合；取樣點(diǎn)最好選擇有機(jī)質(zhì)豐富的地方。4、富集稱取5.0g混合土樣和0.5g的淀粉混合，并加入適量的蒸餾水使其濕潤，置于培養(yǎng)皿中富集培養(yǎng)24h。5、菌種的初篩稱取1.0g步驟4所得