基因生物工程第六節(jié)重組體的篩選與鑒定原則

1、基因生物工程第六節(jié)重組體的篩選與鑒定原則轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽(yáng)性克隆子或期望克隆子選擇(selection) ：通過(guò)外來(lái)附加壓力（或因素）的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類(lèi)型的一種方法。篩選(screening)：通過(guò)特定的方法，例如核酸雜交以及免疫測(cè)定，從被分析的細(xì)胞群體或基因文庫(kù)中，鑒定出真正是所需重組DNA分子的特定克隆過(guò)程由于被篩選的大量的菌落和噬菌斑當(dāng)中，僅有很少的比例含有期望的重組DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特異的篩選方法。外源DNA載體DNA重組分子原核細(xì)胞真核細(xì)胞擴(kuò)

2、增或表達(dá)表達(dá)連接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)電穿孔或顯微注射受體細(xì)胞 DNA的體外重組獲得轉(zhuǎn)化子仍然是多種類(lèi)型的DNA分子1 連接產(chǎn)物中既有載體和一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)目的基因的連接；2 也有載體自連；3 還有目的DNA分子自連；4 更多的是未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片段一、遺傳檢測(cè)法 報(bào)告基因篩選、 抗性標(biāo)志插入失活篩選、 半乳糖苷酶藍(lán)白斑篩選、 插入基因遺傳性狀篩選、二、分子檢測(cè)法 PCR擴(kuò)增檢測(cè) 分子雜交檢測(cè)三、物理檢測(cè)法 DNA電泳檢測(cè) 限制酶酶切分析法四、免疫化學(xué)檢測(cè)法五、核酸序列分析平板篩選重組子的篩選與鑒定一、遺傳學(xué)檢測(cè)法1 根據(jù)載體表型特征篩選重組子分子的直接選擇法A 抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法B

3、-半乳糖苷酶顯色法2 根據(jù)插入序列的表型特征選擇重組子的直接選擇法轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主所具有的突變體發(fā)生體內(nèi)抑制或者互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表性特征。 AmprA.插入失活篩選: 在質(zhì)粒固有的功能基因內(nèi)插入目的基因，則該基因不能表達(dá)有功能的蛋白質(zhì)。原理： 例1 在Tetr中插入目的基因（1）四環(huán)素：抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。（2）氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔?）環(huán)絲氨酸：殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。 pBR322抗菌素標(biāo)記選擇原理如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可

4、用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來(lái)；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基環(huán)絲氨酸輔助篩選氨芐青霉素抗性插入失活選擇過(guò)程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。pUC18/19B. lacZ與藍(lán)白斑篩選 例2 在Lac Z中插入目的基因-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色1. 原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。 受體菌基因組中有

5、突變的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）?？梢员籌PTG（誘導(dǎo)物）誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。假陽(yáng)性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒(méi)有中止密碼；（不破壞肽）。2. 選擇過(guò)程通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：無(wú)質(zhì)粒的受體菌-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無(wú)抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌斑生長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物互補(bǔ)，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑帶外源D

6、NA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長(zhǎng)利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。（1）原理：2、 根據(jù)插入基因的遺傳表型篩選彌補(bǔ)缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對(duì)三甲氧芐二氨嘧啶(三甲氧芐氨嘧啶（TMP,抑制二氫葉酸還原酶，干擾二氫葉酸的合成，使細(xì)菌或球蟲(chóng)的核酸合成受阻 )有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆

7、才能生長(zhǎng)例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。增加新性狀利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。1.直接電泳檢測(cè)法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。DNA電泳檢測(cè)法 分子量Marker載體重組克隆三、物理檢測(cè)法根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子 原理：有外源DNA片段插入載體后的重組DNA與載體DNA之間的大小差異?；痉椒ǎ禾崛∞D(zhuǎn)化子的DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳遷移慢的帶是重組DNA的帶。 此法是對(duì)重組子進(jìn)行分析鑒定的最基本、最簡(jiǎn)單的方法，只適用于重組子的初步鑒定。2.酶切電泳篩選法原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)

8、粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長(zhǎng)度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。ABA或B篩選過(guò)程二、分子檢測(cè)法PCR擴(kuò)增檢測(cè)分子雜交檢測(cè)PCR擴(kuò)增檢測(cè)法1. 原理PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。2. 過(guò)程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片斷作PCR引物。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是否與外源基因一致。例 PCR檢測(cè) PCR檢測(cè)外源基因的原理是根據(jù)被轉(zhuǎn)移的外源基因（目的基因或選擇標(biāo)記基因）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外源基因的片段。如果擴(kuò)增出的片段與設(shè)計(jì)的一對(duì)引物之間的實(shí)際片

9、段在長(zhǎng)度上相吻合，說(shuō)明基因已轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)應(yīng)設(shè)兩個(gè)對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照即質(zhì)粒DNA和陰性對(duì)照即非轉(zhuǎn)基因材料的DNA。PCR擴(kuò)增結(jié)果只能初步確定轉(zhuǎn)基因材料的真實(shí)性，并不能完全確信。容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，通常需要進(jìn)一步用Southern雜交才能證實(shí)。DNA序列分析鑒定 具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。 雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列且已標(biāo)記的DNA或RNA,稱探針。 雜交有固一液相雜交和液相雜交。 核酸分子雜交的基本原理：核酸分子雜交技術(shù)變性復(fù)性 DNA-DNA雜交雙鏈分子四、原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或

10、組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 雜交探針（Probe)的概念: 一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。（1）菌落印記原位雜交篩選特點(diǎn)：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。此技術(shù)由Southern 1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。 用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。（2)Southern blottingPaper TowelsSouthern Blottin

11、gtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無(wú)水乙醇離心帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 印跡雜交的技術(shù)流程白瓷盤(pán)玻璃板濾紙凝膠尼龍膜濾紙吸水紙玻璃板重物吸水紙轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜的幾種方式(3)Northern blotting用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。利用抗體作為“探針”來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：(1).放射性

12、抗體檢測(cè)法五.免疫化學(xué)檢測(cè)法 1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。蛋白蛋白“雜交”待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗2. 放射性抗體檢測(cè)法過(guò)程(2). Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測(cè)法質(zhì)?；駻插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測(cè)融合蛋白 既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物。固相支持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體

13、發(fā)光，底片曝光(3).免疫沉淀檢測(cè)法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周?chē)鷷r(shí)，就會(huì)與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。1. 原理抗原抗體凝集反應(yīng)。檢測(cè)分泌型產(chǎn)物。2. 方法對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。(4).酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondary antibody）： 與一抗的特異性結(jié)合。酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物

14、轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無(wú)色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶2. ELISA檢測(cè)的一般步驟固定樣品:將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。一抗結(jié)合：加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體?？椎滓豢辜尤攵?，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、脲酶等）。二抗結(jié)合：二抗顯色反應(yīng)：加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。比色：在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀

15、）上比色，打印出結(jié)果。的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonal antibody）臨床檢驗(yàn)常用的單抗(5).免疫印跡（western blotting）法在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶。1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS）： 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。 SDS: 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在電場(chǎng)的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動(dòng)

16、，移動(dòng)的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L(zhǎng)短），從而把不同分子量的肽鏈分開(kāi)。電泳buffer電泳buffer蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測(cè)樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位, 等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為61023道爾頓）凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：靈敏度底、只能檢出g/帶，但可褪色回收。硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色直接染色2）Western blotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。 Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場(chǎng)的

17、作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白Western裝置 Blotting原理與ELISA相同。待測(cè)蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過(guò)氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測(cè)蛋白底片曝光辣根過(guò)氧化物酶：HRPO先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合；洗去未結(jié)合的一抗；用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）；清洗掉未結(jié)合的二抗；用HRPO的底物浸泡膜；暗室里曝光，沖洗膠片。 Blotting過(guò)程結(jié)果多克隆抗體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)果六、轉(zhuǎn)譯篩選法 1.無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng):能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。 借助無(wú)細(xì)胞

18、翻譯系統(tǒng)，通過(guò)表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。2.轉(zhuǎn)譯篩選mRNA無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的甲硫氨酸翻譯35S標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？3.雜交抑制轉(zhuǎn)譯法原理：mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯2. 過(guò)程4.雜交釋放轉(zhuǎn)譯法原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對(duì)應(yīng)

19、的mRNA，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。過(guò)程硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標(biāo)記的氨基酸專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)檢測(cè)能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。待測(cè)蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記待測(cè)蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)相互作用篩選法一般克隆與篩選策略七、幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細(xì)胞核苷酸的

20、合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）1.哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK選擇原理四氫葉酸的必要性DHFR氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類(lèi)似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMPdATPTTPdCTP氨甲喋啉抑制抑制胸苷酸激酶的補(bǔ)救作用TK+細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成TTP，存活。Ttk次黃嘌呤的補(bǔ)救作用細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCT

21、P。dUMPdATPTTPdCTP次黃嘌呤補(bǔ)救氨甲喋啉抑制抑制 HAT培養(yǎng)基：Tk- 細(xì)胞株。TK基因。 宿主細(xì)胞 載體標(biāo)記（2）TK選擇過(guò)程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉(zhuǎn)入TK基因的細(xì)胞才能生存。真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1） 選擇原理二氫葉酸還原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸DHFR+細(xì)胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無(wú)胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中

22、生存不需要補(bǔ)救！DHFR 細(xì)胞DHFR- 細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。需要補(bǔ)救！不能在無(wú)胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。 胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救dUMPdCTPTTPdATP次黃嘌呤補(bǔ)救胸苷補(bǔ)救無(wú)四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時(shí)，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救:DHFR-細(xì)胞株（不能在無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)）。 宿主細(xì)胞（2）選擇過(guò)程透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補(bǔ)救。 無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救！ 氨甲喋呤“加壓” 添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補(bǔ)救作用，可提高選擇。DHFR+基因。 載體標(biāo)記只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細(xì)胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，但不影響真核生物。新霉素抗性基因（neor）（1）選擇原理 新霉素（neomycin）新霉素的類(lèi)似物，是一種 氨基糖苷，對(duì)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞都有毒性。 G418（geneticin） 新霉素抗性基因-neor細(xì)菌的新霉素抗性基