核酸的分離純化以及鑒定保存

1、核酸的分離純化以及鑒定保存 核酸的結構與功能是分子水平生命活動的基礎； 內(nèi)源基因的突變、表達及調控的異常和外源致病基因的侵入是人類疾病發(fā)生、發(fā)展的根源。第五章 核酸的分離純化DNA、RNA是生物體中最重要的核酸分子，是分子生物學和分子診斷的研究對象。 DNA、RNA的分離純化是分子生物學研究及對疾病進行分子診斷的最基礎工作。第五章 核酸的分離純化核酸分離純化的原則一、 保持核酸一級結構的完整性二 、盡可能提高核酸制品的純度第五章 核酸的分離純化提取DNA總的原則1 保證核酸一級結構的完整性；2 其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類 分子的污染應降低到最低程度；3 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用

2、的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；4 其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。第一節(jié) 核酸分離純化的設計及原則第二節(jié) 基因組DNA的分離純化第三節(jié) 質粒DNA的提取與純化第四節(jié) RNA的分離純化第五章 核酸的分離純化第一節(jié) 核酸分離純化的設計及原則一、材料與方法的選擇二、技術路線的設計三、核酸的鑒定與保存第一節(jié) 核酸分離純化的設計及原則一、材料與方法的選擇（一） 材料與方法的選擇（二） 選擇原則 （一） 材料與方法的選擇 不同的研究目的對核酸的完整性、純度、產(chǎn)量及濃度可能有不同的要求需考慮制備核酸所需的時間與成本應選擇安全的試劑與制備方案 一、材料與方法的選擇 1、保持核酸堿基序列的完整性 2、盡

3、量清除其它分子的污染，保證核酸純度 3、保持核酸的完整性 應盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時間 盡量避免各種有害因素對核酸的破壞 （二） 選擇原則一、材料與方法的選擇二、技術路線的設計（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌（一）核酸的釋放 DNA和RNA均位于細胞內(nèi)（病毒除外），因此核酸分離與純化的第一步即是裂解細胞、釋放核酸。二、技術路線的設計表- 各種組織細胞破碎方法細胞破碎方法 應用 機械法1勻漿法機體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細菌、酵母 物理法1超聲法細胞混懸液2反復凍融法培養(yǎng)細胞3冷熱交替法細菌、病毒4低滲裂解紅細胞 化學法1有機溶劑細菌、酵母2去

4、垢劑組織、培養(yǎng)細胞3酶解法細菌、酵母核酸分子抽提的技術設計核酸的釋放： 破裂細胞 釋放核酸 機械法與非機械法（非機械法中溶胞法是應 用最廣泛的方法）核酸的分離與純化： 將含有核酸分子復雜復合物中，將核酸與其 他物質分離 非核酸的大分子污染物（蛋白質、多糖和脂 類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液 應該清除的雜質主要包括三部分 1、非核酸的大分子污染物：蛋白質、多糖及脂類 物質等 2、非需要的核酸分子：分離某一特定的核酸分子 時，其它的核酸分子皆為雜質 3、加入的有機溶劑和某些金屬離子（二）核酸的分離與純化二、技術路線的設計（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀是濃縮核酸的最常用的方法常用的鹽類有醋

5、酸鈉、醋酸鉀、醋酸銨、氯化鈉、氯化鉀及氯化鎂常用的有機溶劑則為乙醇、異丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的鹽，需用70%75%的乙醇洗滌去除二、技術路線的設計三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存（一）核酸的鑒定1、濃度鑒定2、純度鑒定3、完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存 紫外分光光度法：該法是基于核酸分子 中的堿基具有共軛雙鍵結構因而可以吸收 紫外線，其最大吸收波長為260nm。 1、濃度鑒定三、核酸的鑒定與保存 各種堿基的紫外吸收光譜三、核酸的鑒定與保存 熒光光度法：核酸的熒光染料溴化乙錠嵌 入堿基平面后，本身無熒光的核酸在UV激 發(fā)下發(fā)出紅色熒光，且熒光強度的積分與 溶

6、液中核酸的含量呈正比。三、核酸的鑒定與保存EB與DNA的結合 紫外分光光度法：該法主要通過A260與A280 的比值來判定有無蛋白質的污染，比值升高與 降低均提示不純。在TE緩沖液中，純DNA的A260/A280為 純RNA的A260/A280比值為2、純度鑒定三、核酸的鑒定與保存1. DNA或RNA的定量OD260相當于50g/ml雙鏈DNA40g/ml單鏈DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品: OD260/OD280 RNA純品: OD260/OD280 三、核酸的鑒定與保存濃度鑒定紫外分光光度法：測定DNA在A260nm的光吸收值。 如計算DNA濃度 A

7、260稀釋倍數(shù)50 g/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于的核酸溶液。(A值等于1時，相當于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，20 g/ml單鏈寡核苷酸） 熒光光度法：用EB等熒光染料示蹤的核酸電 泳結果可判定核酸制品的純度。DNA分子較 RNA大得多，電泳遷移率低。三、核酸的鑒定與保存 熒光光度法 熒光染料溴化乙錠，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強度與核酸含量呈正比。 適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-5ng） 瓊脂糖凝膠電泳法： 以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結果可判定核酸制品的完整性?；蚪MDNA片段的分子量很大，在電場中泳動很慢，如果發(fā)生降解，電泳圖呈

8、拖尾狀。3、完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存DNA片段的降解三、核酸的鑒定與保存完整或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條帶熒光強度積分應呈特定的比值，沉降系數(shù)大的核酸區(qū)帶，電泳遷移低，熒光強度積分高；反之，分子量小，電泳遷移率高，熒光強度積分低。 三、核酸的鑒定與保存 一般而言，28S（23S）RNA的熒光強度約為18S（16S）RNA的2倍，否則提示有RNA的降解。若 在點樣孔附近有著色條帶，則說明存在DNA 的污染。三、核酸的鑒定與保存 總RNA電泳圖譜三、核酸的鑒定與保存 正常時，28S RNA的熒光強度約為18S RNA的2倍，否則提示RNA的降解（二）核酸的保存1、DNA的儲存2、RN

9、A的儲存三、核酸的鑒定與保存1、短期貯存： 4或-20存放于TE（tris和EDTA）緩沖液中。 TE緩沖液的PH與DNA 貯存有關，PH為8時，可減少DNA脫氨反應，PH低于時DNA容易變性。2、長期貯存： TE緩沖液中-70保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細菌和核酸的污染。三、核酸的鑒定與保存（二）核酸的保存_DNA的儲存2、RNA的儲存 RNA溶于的NaAc溶液或三蒸水中，-70保存。如用DEPC處理過的水溶解RNA或者在RNA溶液中加入RNasin或VRC，保存時間可延長。三、核酸的鑒定與保存第二節(jié) 真核基因組DNA的分離純化生物體組織細胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組 DNA粗

10、品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離 粗分離前處理離子交換層析純化有機溶劑抽提細胞裂解蛋白質變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法 哺乳動物基因組DNA分離純化的一般技術路線第二節(jié) 真核基因組DNA的分離純化第二節(jié) 真核基因組DNA的分離純化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法四、其它方法五、DNA片段的純化六、DNA片段的回收DNA酚抽提法示意圖 一、酚抽提法 一、酚抽提法該法于1976年由Stafford及其同事創(chuàng)立，現(xiàn)在使用的是改進的方法以含EDTA、SDS及RNase裂解緩沖液裂解細胞經(jīng)蛋白酶K處理后，用的Tris飽和酚抽提DNA，獲

11、得DNA粗制品DNA樣品準備 常見的標本： 血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細胞等 生物組織： 最好新鮮組織，若不能馬上提取，應貯存 70或液氮主要試劑的作用： EDTA：1 二價金屬螯合劑，抑制核酸酶； 2 降低細胞膜的穩(wěn)定性SDS的作用：1 溶解膜蛋白和脂肪，從而是細胞膜破裂；溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸 釋放出來；3 對RNA、DNA酶有抑制作用；4 與蛋白質形成R-O-SO3 .R蛋白質復合物，使蛋白質變性。蛋白酶K：水解蛋白質的作用，消化DNA酶和細胞中的蛋白質。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可同時使用。酚可以使蛋白質變

12、性沉淀、抑制DNA酶活性。的Tris溶液可以似的抽提出的DNA進入水相，減少在蛋白質層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實驗中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？ 苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調節(jié)至中性。另外使用飽和酚減少酚吸收更多的DNA溶液，降低DNA的損失率。DNA的沉淀1.無水乙醇沉淀 沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負電荷，有助于分子之間的聚集。 無

13、水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋放熱量對DNA的損傷。2.異丙醇沉淀 除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子。DNA的濃縮1、固體聚乙二醇（PEG）濃縮：用透析袋外敷PEG至合適量。2、丁醇抽提濃縮：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不會。因此重復幾次可顯著減少DNA體積。 DNA的檢測溴乙錠染色 ：在254nm紫外光下檢測，如需回收最好在300nm紫外光下割膠，否則易使嘌呤斷鏈，在1cm寬帶上可檢到10ng DNA。 銀染法 ：Ag+與DNA形成復合物，在甲醛還原下可染成黑褐色，靈敏度高200倍，但不能回收

14、。二、甲酰胺解聚法1987年Kupiec等報道了甲酰胺解聚法，其中細胞裂解和蛋白質水解步驟同酚抽提法，但不進行酚的抽提。破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質與DNA的復合物，可以使蛋白質變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標本中制備高分子量的DNA樣品?？傻肈NA 200kb左右 三、玻棒纏繞法現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經(jīng)改進而來。DNA玻棒纏繞法示意圖 三、玻棒纏繞法四、其它方法 常用的一些分子診斷技術，并不需要高分子量的DNA樣品，因此步驟簡化、操作簡便的DNA快速提取法運用而生并廣泛使用

15、 1.異丙醇沉淀法:僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態(tài)） 2.玻璃珠吸附法五、 DNA片段的純化常用的純化方法包括有機溶劑抽提法與商品化的柱層析法（column chromatography）DNA柱層析法示意圖五、 DNA片段的純化六、 DNA片段的回收原則與要求: 1.提高片段的回收率； 2.清除回收的DNA樣品中的雜質。六、 DNA片段的回收（二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段（一） 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段1.二乙基氨基乙基-纖維素膜插片電泳法2.電泳洗脫法3.冷凍擠壓法4.低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法 （一） 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段六、 DN

16、A片段的回收電泳到DEAE-纖維素膜 ： DEAE是一種陰離子交換纖維素，可以吸附帶有負電荷的DNA分子。 在所需條帶前插入DEAT-纖維素膜，繼續(xù)電泳至條帶DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率較好，純度高。但不適用于分子量超過10kb和單鏈DNA。 透析袋電洗脫 ： 切下條帶的瓊脂糖凝膠，放透析袋內(nèi)，加緩沖液后繼續(xù)電泳，DNA出膠后進行抽提DNA回收。 低熔點瓊脂糖凝膠： 切下膠，加熱到65熔化膠，然后抽提回收DNA。 方法：有機溶劑提取法、玻璃珠洗脫法和瓊脂水解酶等。 玻璃珠洗脫法：將瓊脂糖凝膠溶于高濃度的碘化鈉溶液，然后加入玻璃珠結合DNA，經(jīng)分離、洗滌后，在

17、低鹽緩沖液中將DNA洗脫下。 瓊脂水解酶：將含DNA的凝膠進行消化，瓊脂糖水解成二糖，釋放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA （二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段 聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標準方法是壓碎與浸泡法。雖費時但操作簡單，是小片段DNA回收的較好方法。六、 DNA片段的回收至今尚無一種方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同時回收幾種DNA片段并有效清除凝膠中酶促反應抑制劑。六、 DNA片段的回收第三節(jié) 質粒DNA的提取與純化 質粒簡介質粒是細菌內(nèi)獨立于染色體并能自我復制的小環(huán)狀DNA分子 其大小范圍從lkb至200kb以上不等 已經(jīng)在形形色色的細菌類群中發(fā)現(xiàn)質粒

18、這些質粒都是獨立于細菌染色體之外進行復 制和遺傳的輔助性遺傳單位 質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介物，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，而質粒的分離與提取則是最常用、最基本的實驗技術 質粒特性1. 分子相對小 2. 含有高效的自主復制成分 3. 不相容性4. 轉移性5. 選擇的標記6. 限制性內(nèi)切酶單一切口常用質粒載體pBR322 pBR322是一種使用最廣泛的質粒，全長為4363bp，由3種野生型質粒成分組成，ampr基因來自pRSF2124，tetr來自pSCl01，復制起始點來自pM9。核苷酸的序次號，以EcoRI序列GAATTC的第一個T為第一個核苷酸。

19、 pUC系統(tǒng) 如pUCl8和pUCI9，由pBR322的ampr基因和復制子，以及大腸桿菌部分1acZ基因和一個多種限制性內(nèi)切酶單一位點的接頭構成，全長2 666bp，pUCl8和pUCl9所含多位點接頭的方向正好相反。 質粒DNA的提取和純化 1細菌的培養(yǎng) 先分離單個菌落，接種到含少量適當抗生素的培養(yǎng)基中擴增，隨著細菌的生長，質粒DNA也在自主復制。 對于松弛型質粒，由于它的復制在一定程度上不受到宿主細胞的控制，故在細菌對數(shù)生長后期，加入氯霉素抑制宿主蛋白質的合成和染色體DNA的復制。質粒DNA的復制不受影響而大量擴增。 使用氯霉素的主要目的，是在不減低質粒產(chǎn)量的前提下，減少細菌的培養(yǎng)體積和

20、細菌的數(shù)量 有時質粒在細菌中的擴增狀況很差，常是由于質粒攜帶外源基因或質粒分子量過大所致。2細菌的收集與裂解細胞生長過程中，排出大量代謝產(chǎn)物，為了提高質粒DNA的純度，離心棄上清，細菌沉淀最好用STE或生理鹽水懸浮，漂洗l-2次，離心管壁上的液體也應該仔細去除干凈 細胞的裂解方法很多，如去污劑法，沸水熱裂法、堿變性法，有機溶劑法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根據(jù)質粒性質、宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合后加以選擇。 質粒DNA的小量制備 2-5ml 質粒DNA的大量制備 500ml 堿裂解法 方法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法 質粒DNA提取方法的選擇 常用的

21、煮沸法，堿法,SDS法均可獲得較滿意效果至于有人采用堿法提取小量細菌培養(yǎng)物的質粒， 用煮沸法或SDS法進行質粒DNA的大量分離， 只是各個實驗室的習慣問題.選擇哪種方法制備質粒DNA，應考慮以下因素： 1菌株類型 2質粒的大小 3細菌染色體DNA變性條件強弱的控制 4細菌的培養(yǎng)與收集第三節(jié) 質粒DNA的提取與純化二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其它方法一、 堿裂解法五、質粒DNA的純化一、堿裂解法在NaOH存在的強堿性（）條件下，用SDS破壞細胞壁和裂解細胞，并使細胞的蛋白質與DNA發(fā)生變性，釋放出質粒DNA。一、堿裂解法細胞被裂解后，細胞壁、膜的碎片、變性的蛋白質和染色體DNA形成大的復合

22、物當pH調至中性，質粒DNA重新恢復天然的超螺旋在高鹽條件下沉淀，經(jīng)離心分離，質粒DNA保留在上清液中一、堿裂解法堿裂解法示意圖二、煮沸裂解法將細菌懸浮于含TritonX-100和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細胞壁，再用沸水浴裂解細胞，并使宿主細胞的蛋白質與DNA變性。二、煮沸裂解法質粒DNA因結構緊密不會解鏈，當溫度下降后，可重新恢復其天然超螺旋結構。通過離心去除變性的蛋白質和染色體DNA, 然后回收上清液中的質粒DNA。煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取小質粒。對于會釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌三、SDS裂解法將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶

23、和EDTA處理以破壞細胞壁，再用SDS裂解去壁細胞，從而溫和地釋放質粒到等滲液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質粒DNA。三、SDS裂解法由于條件溫和，該法特別適用于大質粒DNA（15kb）的提取。但有一部分質粒DNA會與細胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。四、其它方法（二）牙簽少量制備法(一) 小量一步提取法四、其它方法(一) 小量一步提取法 直接將酚/氯仿與細菌培養(yǎng)物混合，然后離心去除大部分蛋白質和染色體DNA，最后從上清液中回收質粒DNA。本法簡單快捷、成本低，提取的質?？捎糜谙拗菩詢?nèi)切酶圖譜分析。四、其它方法（二）牙簽少量制備法 用牙簽直接挑取生長在瓊脂平板上的細菌菌落制備質粒D

24、NA。 由于制備的質粒DNA有較多污染，不能用于分子克隆中的酶學反應，但可用于質粒的鑒定。五、質粒DNA的純化.CsCl-EB法.聚乙二醇沉淀法.柱層析法 質粒從細菌中分離出來以后，為滿足有些實驗的要求還應進一步純化。CsCl溴乙錠平衡超速離心法是純化質粒的可靠經(jīng)典方法。 但是由于此法費用昂貴及流程長，近年來，發(fā)展了幾種不同的方法取代了超離法。如離子交換層析法或排阻層析法，分級聚乙二醇沉淀法等，也可獲得較好質量的質粒DNA。 轉基因動物，真核細胞轉染及DNA外切酶酶切缺失等實驗，對閉合環(huán)狀雙鏈DNA的要求較高，一般還是用超速離心法純化質粒。 對于DNA片段酶切回收，內(nèi)切酶圖譜分析、細菌轉化、亞

25、克隆及探針放射性標記等實驗，直接用小量或中量提取的DNA樣品，并不需要超速離心純化，一般可滿足實驗要求。EBCsCl密度梯度離心法EB插入相鄰的堿基之間，降低了DNA的浮力密度，但超螺旋的DNA結合EB浮力密度降低較小，僅有3。CsCl可以用丁醇抽提，透析除去。純度可達100%。五、質粒DNA的純化 超速離心將介質CsCl形成一連續(xù)的密度梯度，在過量EB存在下，蛋白質的密度最小位于最上層；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中間，由于不同結構的DNA與EB結合度不一致，因此密度下降不一致，故將線性、開環(huán)、閉環(huán)的DNA區(qū)分開簡述溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心純化質粒DNA的原理？1 氯化銫是一種重金

26、屬，在高速離心后信成一定的濃度梯度2 溶液中不同的大分子在離心時，根據(jù)自身的分子的浮力密度形成不同的致密帶，蛋白質密度低位于上層，RNA位于最下層。3 EB存在時，由于EB可以插入到DNA雙螺旋分子中，使得DNA部分解旋，浮力密度下降，而超螺旋的質粒DNA，EB不能插入少，故可將不同結構的DNA分子分離。EBCsCl密度梯度離心法示意圖五、質粒DNA的純化五、質粒DNA的純化第四節(jié) 真核細胞RNA的分離純化每個細胞的RNA量約為10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA一、關于RNase酶RNA易

27、被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中。RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵RNase分子結構中的二硫鍵使其生物學活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復。Rnase不需要二價陽離子激活去除RNase的污染及強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關鍵。必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。內(nèi)源性RNA酶外源性RNA酶主要來源： 被污染的緩沖液 細菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶， 必須丟棄。 自動移液裝置實驗室采取避免RNA酶污染的措施設置專門RNA移液裝置小份保存緩沖液設置專門的RNA電泳裝置準備溶液

28、或緩沖液時，使用無RNA酶的器皿、 DEPC處理水等分離RNA過程中使用RNA酶抑制劑 變性劑選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強烈的胍類變性劑）使用蛋白酶K 使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉二、RNA酶抑制劑和變性劑胍類變性劑：胍鹽是破壞蛋白質三維結構的離液劑。蛋白質變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍和鹽酸胍，使蛋白質轉換成隨機卷曲狀態(tài)。鹽酸胍抑制RNA酶作用強，變性作用較異硫氰酸胍弱。異硫氰酸胍自身可形成氫鍵，在還原劑存在下斷裂氫鍵。聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對RNA的降解。RNA酶抑制劑（1）DEP

29、C（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。 OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制備：0.1%DEPC在37C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C處理1h或室溫下過夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過程中不使用DEPC。（2）RNA酶的蛋白抑制劑許多RNA酶可以與該類蛋白質結合形成非共價復合物從而是RNA酶失活。RNA酶蛋白抑制劑與靶蛋白的親和力大。商品化的RNA酶蛋白抑制劑的名稱各異（如RNAsin等）。3.還原劑加

30、入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。第四節(jié) 真核細胞RNA的分離純化二、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法三、商品化的單相裂解試劑法分RNA四、mRNA的分離純化一、RNA制備的條件與環(huán)境一、RNA制備的條件與環(huán)境RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中。RNase分子結構中的二硫鍵使其生物學活性非常穩(wěn)定，去除變性劑后，RNase的活性又可恢復。一、RNA制備的條件與環(huán)境去除RNase的污染及強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關鍵。必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地

31、滅活胞內(nèi)RNase的活性。 選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強烈的胍類變性劑）使用蛋白酶K 使用陰離子去污劑如SDS、十二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉一、RNA制備的條件與環(huán)境聯(lián)合使用RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大地防止內(nèi)源性RNase對RNA的降解。加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活。一、RNA制備的條件與環(huán)境二、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法首先以含異硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細胞。然后在的條件下，酚/氯仿抽提細胞裂解溶液。最后通過異丙醇沉淀與75%的乙醇

32、洗滌而獲得總RNA。二、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法本法具有簡便、快速、經(jīng)濟、高效及提取的RNA質量高等優(yōu)點，能在3小時內(nèi)迅速處理多個標本。總RNA產(chǎn)量取決于標本的起始量，每mg組織大約能制備47g總RNA，每106個細胞大約為410g。 三、商品化的單相裂解試劑法分RNA本法是異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改進方案。以異硫氰酸胍-酚的單相裂解液裂解細胞，再加入氯仿后形成兩相。三、商品化的單相裂解試劑法分RNA變性的DNA與蛋白質介于兩相的交界面，可使用乙醇和異丙醇分級沉淀出來。保留于上層水相的RNA，通過異丙醇沉淀與75%乙醇洗滌而制備。三、商品化的單相裂解試劑法分RNA目前，該法已成為實驗

33、室最常用的總RNA提取法，其產(chǎn)量及質量與前法相當。四、mRNA的分離純化除血紅蛋白及組蛋白的mRNA外，絕大多數(shù)mRNA在其3末端帶有長短不同的poly（A）尾巴。利用堿基配對原則，通過oligo（dT）-纖維素或poly（U）-瓊脂糖凝膠的親和層析，可以很容易地從總RNA制品中分離純化mRNA。1. oligo（dT）-纖維素柱層析法2. oligo（dT）-纖維素柱離心法3. oligo（dT）-纖維素液相結合離心法4. 磁性球珠分離法四、mRNA的分離純化5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+總RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成雜交體 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5鏈親和素標記的磁珠+Streptavidin- 磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-