RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP應(yīng)用于乳品發(fā)酵中新陳代謝活性細菌的半定量分析百替生物講解學習

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP應(yīng)用于乳品發(fā)酵中新陳代謝活性細菌的半定量分析百替生物-RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP應(yīng)用于乳品發(fā)酵中新陳代謝活性細菌的半定量分析JorgeI.Sancheza,LiaRossettib,BeatrizMartneza,AnaRodrgueza,GiorgioGiraffab,*aInstitutodeProductosLacteosdeAsturias(IPLA-CSIC),ctra.Infiesto,s/n,33300Villaviciosa,Asturias,Spa

2、inbIstitutoSperimentaleLattieroCaseario,viaA.Lombardo11,26900Lodi,ItalyReceived2February2005;receivedinrevisedform21July2005;accepted28July2005Availableonline21September2005（楊明翻譯）摘要：一種包括RT-PCR擴增全部微生物群落的16SrRNA和T-RFLP的方法，對于在確定的乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌菌株培養(yǎng)中半定量的描述新陳代謝活性數(shù)量是最優(yōu)的，這是兩種在奶酪生產(chǎn)中被通常使用的嗜溫的乳酸菌種。選擇好的PCR引物高

3、效地擴增這兩個菌種的16SrRNA。用DdeI消化PCR產(chǎn)物生產(chǎn)每種菌種的不同的末端限制性酶切片段（T-RFs）。然而，由于嵌合分子的形成和來源于部分單鏈16SrRNA的擴增子的假T-RFs產(chǎn)生的額外的T-RFs在兩個菌種中都被觀察到了，盡管是很少量的。為了避免過量PCR產(chǎn)物對定量DNA產(chǎn)生的飽和效果導(dǎo)致的對總量的低估和盡量減少假片段的出現(xiàn)，20個PCR循環(huán)是最佳的。當應(yīng)用于混合乳品培養(yǎng)時，T-RFLP分析表現(xiàn)出很好的可重復(fù)性。用這種方法和結(jié)果研究包括乳酸乳球菌乳酸亞種菌株和檸檬明串珠菌菌株的兩種混合初始物的動力學，并和用純培養(yǎng)獲得的做對比。這些數(shù)據(jù)顯示了用T-RFLP進行半定量微生物數(shù)量分析

4、的適宜性。某些微小的差別可以用菌落計數(shù)不能被檢測到的新陳代謝活性細胞的出現(xiàn)來解釋。以RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP可以作為傳統(tǒng)方法之外的另外一種選擇，用于研究相對簡單的微生物（比如確定乳品起始物的培養(yǎng)物）生態(tài)系統(tǒng)的新陳代謝活性的群體動力學。關(guān)鍵詞：乳品初始物；RT-PCR；半定量；T-RFLP1前言幾種奶酪生產(chǎn)中常用的初始培養(yǎng)物通常包括成酸性的乳球菌，和一些通常屬于乳酸乳球菌乳酸亞種、二丁酮鏈球菌和明串珠菌屬某些種的利用檸檬酸鹽的菌株。這些培養(yǎng)菌對于器官感覺的特征的發(fā)展是非常重要的（Carcobaetal.,2000.）。確定的菌株的初始物已經(jīng)被奶酪制造商日益增多地采用，作為一種嘗試來解決與

5、未受控制的自然發(fā)酵相關(guān)的問題。這對于奶酪的質(zhì)量有積極的效果。因為整個發(fā)酵過程中菌株的平衡是一個關(guān)鍵點，所以需要監(jiān)控任何對細菌群落結(jié)構(gòu)的暫時影響，這些影響可能改變想得到的奶酪的特性的正確過程。（Giraffa,2004）培養(yǎng)作為一種評價食品中微生物群落多樣性和動力學的方法已經(jīng)有幾十年了。以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的方法被長期接受并獲得普遍成功，但是這些技術(shù)費時費力，而且在某些情況下不一定能提供微生物群落組成的可靠信息。未知的和不可培養(yǎng)的種的出現(xiàn)以及樣本的混合和稀釋步驟會對微生物的生存能力產(chǎn)生影響，能夠?qū)е聦Ξa(chǎn)品真實生態(tài)學組成的失真的觀察（Fleet，1999）。而且，在不利條件下，比如營養(yǎng)耗盡、低溫和其他壓力

6、，某些微生物能進入可生存的但不可培養(yǎng)（VNC）的狀態(tài)。VNC狀態(tài)的微生物仍然具有新陳代謝活性但是不能在通常支持它們生長的培養(yǎng)基上形成菌落，因此它們不能被傳統(tǒng)的方法發(fā)現(xiàn)。為了克服這些問題，免培養(yǎng)法比如變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、熒光原位雜交（FISH），或者以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)比如長度異質(zhì)PCR（LH-PCR）和末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）在過去幾年得到發(fā)展（GiraffaandNeviani,2001）。T-RFLP是一種分析不同細菌的16srRNA的差異，并提供微生物種群結(jié)構(gòu)信息的方法（Osbornetal.,2000）。

7、它是以限制性核酸內(nèi)切酶消化熒光末端標記的PCR產(chǎn)物為基礎(chǔ)的。單獨的末端限制性酶切片段（T-RFs）被電泳分開并由熒光信號亮度量化。依靠微生物群落的物種組成，獲得明顯的外形（T-RF圖案），一種代表一個物種的存在。一個相對定量的分布可以獲得，因為每個頂點的熒光密度是和混合物中每個物種的DNA量成比例的。然而，PCR的偏差可能對微生物群落真實組成的量化產(chǎn)生消極的影響（SuzukiandGiovannoni,1996;Suzukietal.,1998）。以DNA為基礎(chǔ)的方法的缺點是不能區(qū)分活的和死的生物體，因為溶解細胞中的DNA能夠在自然環(huán)境中存在很長時間（Bentsinketal.,2002;Wo

8、lffsetal.,2005）。因此，以DNA為基礎(chǔ)的PCR不能區(qū)分生活的、VNC和死細胞，這就限制了它用于監(jiān)控目的的使用（Sheridanetal.,1998）。在死細胞中RNA比DNA降解的快（VanderVlietetal.,1994），因此，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR（RT-PCR）可能是生存能力、新陳代謝活力和細胞完整性的一個好的指示器（Bentsinketal.,2002）。這項工作的目的是檢驗與RT-PCR相連系的T-RFLP監(jiān)控確定微生物種群（比如乳品確定菌株的初始物）的新陳代謝活性部分的群體動力學的能力。在這一點上，研究了整個發(fā)酵過程中兩種確定菌株的初始物的成分的演變。為了減少PCR的偏

9、差，這種方法被最優(yōu)化并且檢驗了它的可重復(fù)性。2材料與方法2.1細菌菌株和生長條件本研究中使用的細菌菌株包括從人工奶酪中分離的兩株檸檬明串珠菌菌株（IPLA621和IPLA1687）和一株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株（IPLA947）（Cuestae=qtal.,1996）。明串珠菌屬在MRS肉湯（Biokar,Beauvais,France）和乳球菌在M17（ScharlauChemie,Barcelona,Spain）中被常規(guī)地繁殖。2.2確定菌株初始物培養(yǎng)兩種確定菌株初始物培養(yǎng)物在10%（wt/vol）復(fù)配脫脂乳（RSM）中準備；培養(yǎng)物A包括乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA

10、621，培養(yǎng)物B包括乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA1687。前一夜的肉湯培養(yǎng)物在乳中1%被轉(zhuǎn)接，給與起始的種群比率，大約是31.3，分別為乳球菌和明串珠菌。培養(yǎng)物在30培養(yǎng)，并于0，3，6，9和24小時取樣。2.3微生物分析10倍稀釋法在四分之一濃度套環(huán)溶液被使用，在含有萬古霉素（30mgml-1）的MRS瓊脂和為明串珠菌準備的蔗糖（2%wt/vol）或者為乳球菌準備的加入環(huán)己米特的M17瓊脂中進行選擇性計數(shù)。平板在30培養(yǎng)48小時。2.4DNA提取在MRS或者M17培養(yǎng)基上生長的純培養(yǎng)物的DNA用如前文描述的基于chelex的程序進行提取。分離的DNA在使用前在-20

11、溫度下保存。2.5從培養(yǎng)物中提取RNA用9mlEDTA（1%wt/vol,pH12）預(yù)處理從乳培養(yǎng)物得到的1ml樣品，使凝固的酪蛋白分散以利于細胞的分離。樣品在8000g離心5分鐘，然后用TEbuffer洗兩次。沉淀物在含有l(wèi)ysozime（20mgml-1）的100l的TES中重懸，然后37培養(yǎng)30分鐘。提取RNA使用Trizol公司的試劑（InvitrogenS.r.L.,Milano,Italy），按照廠家提供的說明書進行操作。沉淀物在50l用DEPC處理的水中重懸，污染DNA消化在5U的AmplificationGradeDNA酶I（SigmaAldrich,Milano,Italy）

12、在廠家給定的條件下。RNA的量和純度用260和280nm的光密度確定（Sambrooketal.,1989）。提取的RNA在使用前保存在-80。2.6引物選擇擴增16SrRNA可變區(qū)的A域的基因，使用熒光標記的正向引物63F（5V-6FAMCAGGCCTAACACATGCAAGTC-3V）（Marchesietal.,1998）和未標記的反向引物355R（5V-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3V）（Suzukietal.,1998）。.2.7RT-PCR使用GeneAmpEZrTthRNAPCR試劑盒（AppleraItalia,Monza,Italy），按照廠家的說明進行一步PCR。

13、反應(yīng)在終容量為25l的體系中進行，包括5l的5EZbuffer，3l的dNTP混合液（每種dNTP濃度10mM），2.5l的mMMn（OAc）2溶液，每種引物溶液1.25l（10M），1l的rTthDNA聚合酶（2.5Ul-1；AppleraItalia）和2.5l的RNA模板（稀釋到100ngl-1）。反應(yīng)在PerkinElmerthermalcycler（mod.9700;AppleraItalia）中進行，反應(yīng)條件為：60初始變性步驟于941min，接下來進行循環(huán)，循環(huán)數(shù)由樣品決定（10，20，30或者40）。循環(huán)條件為：9415s（變性），4930s（退火），7230s（延伸）。最后一

14、步727min。為了檢查RNA提取物中可能存在的DNA污染，按照上述方法使用RNA提取物作為模板進行對照反應(yīng)。2.8PCR擴增提取的DNA和對照PCR在終體積為20l的體系中進行，其中含有2l的10Goldbuffer（AppleraItalia），1.6l的dNTP混合液（每種dNTP濃度2.5mM），1.2l的MgCl2（25mM），每種引物的溶液1l（10M），0.1l的AmpliTaqGoldDNA聚合酶（AppleraItalia）和1l的DNA樣品（或者對照反應(yīng)的RNA）。反應(yīng)條件為，9510min；25個循環(huán)9540s，4945s，722min；最后一步727min。2.9限制性

15、核酸內(nèi)切酶的選擇乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌（GenBank的編號分別為AF111948andAB118036）的16srRNA基因序列，用SequenceNavigatorsoftware（version1.0.1,AppliedBiosystems,FosterCity,CA）進行排序。為了選擇限制酶，用一種核苷序列限制位點圖在線軟件Webcutter2.0（網(wǎng)絡(luò)地址為：HYPERLINK/cutter/cut2.html/cutter/cut2.html）進行分析。酶切反應(yīng)使用10U限制酶DdeI（NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA），在20l體系中進行

16、1.5h，按照廠家的建議的條件進行。2.10T-RFLP分析擴增產(chǎn)物的變性和電泳按照全面描述的方法進行（Lazzietal.,2004）。電泳結(jié)果在非變性條件下用ABIPrism310基因分析儀（AppliedBiosystems）進行分析，T-RFLP結(jié)果使用Genescan軟件（version3.1;AppliedBiosystems）進行分析。（葉彥波翻譯）3.結(jié)果檢查所選引物可行性以及PCR產(chǎn)物的大小的預(yù)試驗用提取于純培養(yǎng)物的DNA。從每個菌落利用引物擴增真細菌rDNA的A區(qū)域，PCR產(chǎn)物長3191bp，為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lazzietal.,2004），和長3181bp的檸檬明串

17、珠菌（數(shù)據(jù)未顯示）。因為兩者PCR產(chǎn)物的大小差異很小，以致無法精確辨別這些種，樣品用DdeI消化產(chǎn)生一種特殊的標記了的T-RF。依照在線的限制分析，當以DdeI（圖1）消化的時候，每個種有一個獨特的式樣。實驗數(shù)據(jù)通過silico分析被確認，乳酸乳球菌表現(xiàn)為一個2591bp的峰，檸檬明串珠菌的為1411bp（數(shù)據(jù)未顯示）。這些數(shù)據(jù)證明了引物以及挑選的限制酶可以用來確認兩個種的能力。相同的消化也用于T-RFLP分析擴增的rRNA。圖1.在線限制分析確認的乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌的DdeI的限制位點，乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌的PCR產(chǎn)物以引物63F和355R擴增。3.1來自牛奶培養(yǎng)物

18、的RNA提取和RT-PCR從牛奶培養(yǎng)物被提取RNA，RT-PCR用于檢測提取方法和RT-PCR的適合條件。對于第一種嘗試，擴增反應(yīng)設(shè)置了40個循環(huán)。一條大約319bp的帶在所有樣品中都可以看到（圖2A，上膠板），確認預(yù)期片段的擴增。負對照缺少擴增帶確認了沒有DNA污染發(fā)生。（圖2A，下膠板）。RT-PCR的產(chǎn)物利用DdeI酶切消化并利用毛細管電泳分離產(chǎn)生的片斷。單獨的乳酸乳球菌牛奶培養(yǎng)物的RT-PCR產(chǎn)物酶切電泳圖在圖2B中顯示。次級峰（2791，2871，2991和3191bp）連同2591bp的預(yù)期峰同樣被發(fā)現(xiàn)，盡管濃度相對較低。這些額外的峰對應(yīng)的是額外的擴增子，因為當同樣的樣品不經(jīng)消化跑

19、毛細管電泳時也被觀察到（見圖2C）。在這種情況下，除了3191bp片斷外，對應(yīng)于3391，3591，3791和3971bp片段的另外的峰也被發(fā)現(xiàn)。這些非預(yù)期的產(chǎn)物可能是由于非特異性的引物退火或者是由PCR時基因組中16SrRNA的不同拷貝的重結(jié)合造成的，不同的產(chǎn)物恰好可以反映16SrRNA的序列特異性（WangandWang，1997）。DdeI酶切消化在所有片段的3端產(chǎn)生了一個60bp（事實上是28和32bp的二個片斷，因為限制位點在287bp）的非標記片斷（圖2D），顯示序列特異性更靠近5端。缺失這一個60bp片斷可以解釋產(chǎn)物消化后觀察到的五個峰中四個的出現(xiàn)，也就是2591（主要產(chǎn)物），2

20、791，2991和3191bp。對應(yīng)于3971bp的峰在被消化的樣品中沒有出現(xiàn)，或許因為在消化期間的稀釋使它的濃度太低未被發(fā)現(xiàn)。被消化的樣品（圖2B）中的2871bp的峰與假終端限制片斷的形成相關(guān)（假的T-RFs）。這些假片斷在PCR期間因為部分單鏈16SrRNA模板的形成被起始，可能是由于模板的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聚合酶停止。因為限制型內(nèi)切酶需要雙鏈DNA，因此終點的限制位點不具有功能（Egert和Friedrich.2003）。在我們的情況，總DNA中的一些在第一個限制位點不被DdeI酶切產(chǎn)生一個259bp的片斷，而是在第二個位點酶切因此產(chǎn)生一個2871bp的假T-RF（見圖1）。相似的結(jié)果在檸

21、檬明串珠菌中也獲得，呈現(xiàn)出1601，1791和2871bp的三個次級非預(yù)期峰（數(shù)據(jù)未顯示）。3.2.RT-PCR和T-RFLP的條件最佳化PCR循環(huán)數(shù)對于檢測DNA的影響在牛奶的乳酸乳球菌純培養(yǎng)物上被評估。當設(shè)置10個循環(huán)時，最初的2591bp的T-RF是被發(fā)現(xiàn)的唯一峰。循環(huán)數(shù)的逐漸增加導(dǎo)致另外的峰出現(xiàn)。2871bp的假T-RF在20個循環(huán)之后被觀察到，而在30個循環(huán)之后由于錯配起始的其他次級峰也被觀察到（數(shù)據(jù)未顯示）。盡管使用10個循環(huán)可以把次級峰的減到最低，但由于相對產(chǎn)生的主峰的面積太小，種群數(shù)目的微小變化可能會導(dǎo)致信號的完全消失，這使得這樣的條件不可行。因此，20個循環(huán)對于進一步的分析是

22、最好的選擇（表1）。圖3顯示了對應(yīng)于從牛奶培養(yǎng)的乳酸乳球菌IPLA947純培養(yǎng)物的主要RT-PCR產(chǎn)物（3191bp）的峰區(qū)域，以及其相應(yīng)的DdeI消化后獲得的主要的T-RF（2591bp）?？梢杂^察到未消化的DNA的峰面積在超過20個循環(huán)后并沒有增加。然而，被消化的DNA（由于限制性內(nèi)切酶切，與未消化的DNA相比被稀釋4倍）的峰面積在PCR循環(huán)的數(shù)量從20個循環(huán)到30個循環(huán)的過程中增加了。這暗示PCR產(chǎn)物過量下所引起的一種DNA定量的飽和效果。為了要避免系統(tǒng)的飽和，這種飽和可能會造成一些種群成員的低估，一個120,000個單位的峰面積被設(shè)為準確測量的上限。圖2.（A）上面的膠板:從牛奶培養(yǎng)物

23、提取的RNA擴增40個循環(huán)后的RT-PCR產(chǎn)物。2到7泳道：單個培養(yǎng)物（2,3:IPLA947；4,5:IPLA621;6,7:IPLA1687）。8到11泳道：混合培養(yǎng)物（8,9:IPLA947和IPLA621；10,11：IPLA947和IPLA1687）。12泳道：PCR對照。1和13泳道：分子量DNA標記1kb以及DNA梯度標記（意大利生命技術(shù)公司，米蘭，意大利）。下面的膠板：對照PCR確定沒有DNA污染。（B和C）單個牛奶培養(yǎng)物培養(yǎng)的乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947中提取的總RNART-PCR（40個循環(huán)）DNA片斷DdeI消化后（B）或未消化的（C）的圖。（D）錯配分子次級T-RF

24、s的形成。擴增產(chǎn)生主要的產(chǎn)物（319bp）和一些另外的片斷（339，359，379和397bp）。DdeI消化在所有擴增產(chǎn)物中都釋放一個未標記的60bp片斷，和259（主要的消化擴增子），279，299，319和337bp大小的T-RF。以287bp的DdeI限制位點未顯示。表1使用不同RT-PCR循環(huán)數(shù)的乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947的16srRNA擴增子的限制片斷ND:未發(fā)現(xiàn)。a：主要的T-RF。b：錯配分子消化產(chǎn)生的片斷。c：假的T-RF。表2以RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLPa的重復(fù)性a：每個峰面積通過同一樣品的三次獨立分析確定，包含一個乳酸乳球菌和檸檬明串珠菌菌株，在RSM中30培

25、養(yǎng)9h后測定。獨立分析包括RNA提取，RT-PCR（20個循環(huán)），內(nèi)切酶消化和毛細管電泳。b：檸檬明串珠菌的T-RF。c：乳酸乳球菌乳酸亞種的T-RF。d：假的T-RF。圖3.用螢光強度顯示DNA定量的飽和效果。數(shù)據(jù)表示用DdeI（259bp）消化的或未消化（319bp）在10，20或30個PCR循環(huán)后RT-PCR擴增子主要片段的峰面積。消化樣品的濃度是未消化的四分之一，這是因為消化步驟的稀釋。3.3T-RFLP的重復(fù)性為了測試T-RFLP分析的重復(fù)性，培養(yǎng)物A作為樣品，包括乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA621，發(fā)酵后9h取出，分別用于三個獨立的分析包括RNA提取，RT

26、-PCR，內(nèi)切限制酶切和毛細管電泳分析。表2顯示了檸檬明串珠菌（1411bp）和乳酸乳球菌（2591bp）的T-RFs的峰面積，以及假的T-RF（2871bp）的峰面積。所有峰三個樣品之間的標準差在7%以下。同樣地，峰面積與乳酸乳球菌以檸檬明串珠菌的T-RF之間的比的標準差為4.1%，指示在單一樣品里兩個菌株相對定量的重復(fù)性很好。（陳忠良）3.4應(yīng)用T-RFLP監(jiān)測初始培養(yǎng)物的群體動力學為了測定T-RFLP監(jiān)測群體動力學的能力，在牛奶培養(yǎng)物中培養(yǎng)的樣品同時利用菌落計數(shù)以及發(fā)酵過程中的T-RFLP的分析，然后對結(jié)果進行比較?；灠瑑煞N確定的菌落的起始物，乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌。圖4顯

27、示發(fā)酵中兩培養(yǎng)物的進化。培養(yǎng)物A中兩者表現(xiàn)為相似的行為，9h到達靜止期?？膳囵B(yǎng)細胞數(shù)直到潛伏期結(jié)束保持不變。在培養(yǎng)物B中，可以在9h之后觀察到檸檬明串珠菌IPLA1687的可培養(yǎng)細胞數(shù)的減少，可能是被酸和/或其他的壓力條件引起。乳酸乳球菌IPLA947的生長看起來并沒有因IPLA621或IPLA1687的出現(xiàn)而改變。平行的，RT-PCR擴增片段的T-RFLP分析也被進行。相應(yīng)每個菌株T-RF的峰面積被測量，為了對新陳代謝活性群體進行半定量分析，它們之間的比率也被計算出來。在培養(yǎng)物A中，T-RFLP分析與發(fā)酵時期菌落計數(shù)相比菌落IPLA947和IPLA621的相對比例的波動更大。然而，IPLA9

28、47（75.3%和75.1%）和IPLA621（24.7%和24.9%）T-RFLP和菌落計數(shù)的平均菌體總數(shù)，分別地，在發(fā)酵的最初9h是相似的。24h后兩種技術(shù)的差異則會相當明顯。通過定量T-RFLP計算得來的IPLA947的比例比通過菌落計數(shù)得來的數(shù)據(jù)大。這表明部分細胞仍具有新陳代謝活力，但是處于VNC狀態(tài)，因此，不能通過接菌發(fā)現(xiàn)。另一方面，培養(yǎng)物B的群體動力學用兩種技術(shù)顯示出相似的結(jié)果（圖5B，5D）。IPLA947的相對總數(shù)隨著發(fā)酵過程逐漸增加，特別是6h以后當IPLA1687的可培養(yǎng)總數(shù)明顯的減少時。兩個技術(shù)之間的最大不同在24h再次被發(fā)現(xiàn)。如上討論，VNC細胞的出現(xiàn),在IPLA168

29、7的情形下，可以解釋經(jīng)由以RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP觀察得來的較高比例。圖4.培養(yǎng)物A中（乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA621）以及培養(yǎng)物B（乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA1687）中RSM30培養(yǎng)的嗜溫乳酪起始培養(yǎng)物通過菌落計數(shù)測得的生長。圖5.乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌在培養(yǎng)物A（A）和培養(yǎng)物B（B）中不同培養(yǎng)時期的半定量分析。相對的可培養(yǎng)總數(shù)通過菌落計數(shù)計算，每個菌落的結(jié)果被表示成總cfuml1的百分比。相對的新陳代謝活性群體（可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的）通過RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP分析，結(jié)果表示為TRF峰面積占所有峰面積的百

30、分數(shù)。只有峰對應(yīng)1411bp大小的TRF（檸檬明串珠菌）和2591bp（乳酸乳球菌乳酸亞種）被考慮。（劉暢翻譯）4.討論大部份關(guān)于應(yīng)用T-RFLP監(jiān)測微生物群體的研究都集中于對環(huán)境樣品的定量分析，但只有很少的關(guān)于這項技術(shù)的定量可行性的工作被出版（Trothaetal.,2002;Lueders和Friedrich，2003）。所有的作者都贊同T-RFLP應(yīng)用于定量分析具有限制性，因為它受制于所有分子的方法不利因素。當處理那些微生物多樣性很高并且具有多樣的細胞裂解抗性（因此提取的核酸有差異）的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)時，這些問題變得更明顯，基因組大小或G+C含量也能導(dǎo)致差異的擴大（Suzuki和Giova

31、nnoni,1996;Wintzingerodeetal.,1997;Suzukietal.,1998;Marshetal.,2000）。現(xiàn)階段的工作中，我們挑選了二個相對接近的種組成一個簡單的模型，因此由模板的差別擴增所引起的差異和復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)比較起來被減到最少。盡管模型簡單，非預(yù)期產(chǎn)物在silico限制分析中以額外的峰的出現(xiàn)被顯示出來，可能是16SrRNA序列特異性引起的PCR假象（Clementetal.,1998），和對應(yīng)于假的TRFs峰一樣。即使是分析單一培養(yǎng)物，這些現(xiàn)象也可被觀察到。這些結(jié)果顯示一些問題，當處理復(fù)雜的成分未知的樣品時，通常造成對微生物群體的種群數(shù)量的過高估計，因為

32、許多這樣的峰可能錯誤地被指定給不存在的微生物。在目前的情形，因為培養(yǎng)物的微生物成分完全被定義，人們可以區(qū)分什么是“真的”和“假的”TRFs，這使得T-RFLP應(yīng)用于這類分析成為可能。因為T-RFLP的分析以PCR擴增為基礎(chǔ)，它便被這項技術(shù)的固有缺陷所限制。在所有能影響T-RFLP的因素之中，PCR循環(huán)數(shù)在退火過程中最重要，同樣還有錯配分子造成的假象以及假的TRFs（Suzuki和Giovannoni,1996;Wang和Wang,1997;Wintzingerodeetal.,1997;Egert和Friedrich,2003;Suzukietal.,1998）。所有的作者都贊同通過減少循環(huán)數(shù)

33、將這些影響減到最小。考慮到這些，低循環(huán)數(shù)的PCR可以清楚地減少了這些干擾峰。另外地，T-RFLP的分析需要有一個好的重復(fù)性。T-RFLP分析和依賴培養(yǎng)的方法對混合培養(yǎng)物中的群體比例比較分析表現(xiàn)出相似的結(jié)果。在發(fā)酵末期兩種方法之間觀察的相對群體總數(shù)的一些不同可以用可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的細胞（但是仍然具有新陳代謝活性）的存在所解釋，不可培養(yǎng)的細胞只能通過T-RFLP分析和總rRNA的RT-PCR發(fā)現(xiàn)。這種方法當有些成員用傳統(tǒng)方法監(jiān)測不出來時非常有用，同時，當有來自非可見細胞DNA存在的情況下利用傳統(tǒng)PCR擴增可能造成區(qū)域總數(shù)的高估，這種方法可以避免這種情況。（Wolffsetal.,2005）。考慮

34、到T-RFLP應(yīng)用于復(fù)雜微生物的群體定量分析的局限性，這一工作證明它可以作為一種更快的以及長效的，可作為傳統(tǒng)方法備選的研究相對簡單微生物生態(tài)系統(tǒng)的新陳代謝活性群體動力學的方法，同樣也適用于商業(yè)的起始培養(yǎng)物。致謝這一工作由西班牙MinisteriodeCienciayTecnolog資助（AGL2000-1611C03-02工程）。JorgeIgnacioSanchez是MinisteriodeCienciayTecnologia的FPI博士獎學金的接受者。參考文獻1Bentsink,L.,Leone,G.O.M.,vanBeckhoven,J.R.C.M.,vanSchijndel,H.B.,

35、vanGemen,B.,vanderWolf,J.M.,2002.AmplificationofRNAbyNASBAallowsdirectdetectionofviablecellsofRalstoniasolanacearuminpotato.J.Appl.Microbiol.93,647655.2Carcoba,R.,Delgado,T.,Rodrguez,A.,2000.Comparativeperformanceofamixedstrainstarterincowsmilk,ewesmilkandmixturesofthesemilks.Eur.FoodRes.Technol.211

36、,141146.3Clement,B.G.,Kehl,L.E.,DeBord,K.L.,Kitts,C.L.,1998.Terminalrestrictionfragmentpatterns(TRFPs),arapid,PCR-basedmethodforthecomparisonofcomplexbacterialcommunities.J.Microbiol.Methods31,135142.4Cuesta,P.,Fernandez-Garca,E.,GonzalezdeLlano,D.,Montilla,A.,Rodrguez,A.,1996.Evolutionofthemicrobio

37、logicalandbiochemicalcharacteristicsofAfuegalPitucheeseduringripening.J.DairySci.79,16931698.5Egert,M.,Friedrich,M.W.,2003.Formationofpseudo-terminalrestrictionfragments,aPCR-relatedbiasaffectingterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofmicrobialcommunitystructure.Appl.Environ.Microbiol

38、.69,25552562.6Fleet,G.H.,1999.Microorganismsinfoodecosystems.Int.J.FoodMicrobiol.50,101117.Giraffa,G.,2004.Studyingthedynamicsofmicrobialpopulationsduringfoodfermentation.FEMSMicrobiol.Rev.28,251260.7Giraffa,G.,Neviani,E.,2001.DNA-based,culture-independentstrategiesforevaluatingmicrobialcommunitiesi

39、nfood-associatedecosystems.Int.J.FoodMicrobiol.67,1934.8Giraffa,G.,Lazzi,C.,Gatti,M.,Rossetti,L.,Mora,D.,Neviani,E.,2003.MoleculartypingofLactobacillusdelbrueckiiofdairyoriginbyPCR-RFLPofproteincodinggenes.Int.J.FoodMicrobiol.82,163172.9Lazzi,C.,Rossetti,L.,Zago,M.,Neviani,E.,Giraffa,G.,2004.Evaluat

40、ionofbacterialcommunitiesbelongingtonaturalwheystartersforGranaPadanocheesebylengthheterogeneity-PCR.J.Appl.Microbiol.96,481490.10Lueders,T.,Friedrich,M.W.,2003.EvaluationofPCRamplificationbiasbyterminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofsmall-subunitrRNAandmcrAgenesbyusingdefinedtemplat

41、emixturesofmethanogenicpureculturesandsoilDNAextracts.Appl.Environ.Microbiol.69,320326.11Marchesi,J.R.,Sato,T.,Weightman,A.J.,Martin,T.A.,Fry,J.C.,Hiom,S.H.,Wade,W.G.,1998.Designandevaluationofusefulbacterium-specificPCRprimersthatamplifygenescodingforbacterial16SrRNA.Appl.Environ.Microbiol.64,79579

42、9.12Marsh,T.L.,Saxman,P.,Cole,J.,Tiedje,J.,2000.Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisprogram,awebbasedresearchtoolformicrobialcommunityanalysis.Appl.Environ.Microbiol.66,36163620.13Osborn,A.M.,Moore,E.R.B.,Timmis,K.N.,2000.Anevaluationofterminal-restrictionfragmentlengthpolymorphism(

43、T-RFLP)analysisforthestudyofmicrobialcommunitystructureanddynamics.Environ.Microbiol.2,3950.14Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,1989.2nded.,Molecularcloning:alaboratorymanual,vol.3.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.Sheridan,G.E.C.,Masters,C.I.,Shalcross,J.A.,Mackey,B.M.,1998.DetectionofmRN