生物化學(xué)技術(shù)基本原理和應(yīng)用

1、生物化學(xué)技術(shù)基本原理和應(yīng)用第一編 概 述第二編 純化方法第三編 鑒定方法 第一編 概 述第一章 生命大分子物質(zhì)的制備第一章 生命大分子物質(zhì)的制備第一節(jié) 材料的選擇與處理第二節(jié) 確定測定方法第三節(jié) 細(xì)胞的破碎第四節(jié) 抽提第五節(jié) 濃縮第六節(jié) 純化方案的設(shè)計(jì)與評價(jià)第七節(jié) 有效成分純度和性質(zhì)的分析第八節(jié) 應(yīng)用實(shí)例第一節(jié) 材料的選擇與處理一、材料的選擇二、材料的處理一、材料的選擇有效成分：指欲純化的某種單一的生命 大分子物質(zhì)。 有效成分具有含量少和穩(wěn)定性差的特性。 材料選擇原則(1)含量多、穩(wěn)定性好； (2)來源豐富、保持新鮮； (3)工藝簡單、有利用價(jià)值。 二、材料的處理 1、動(dòng)物臟器： (1)冰凍：

2、短時(shí)間零下10冰庫或零下70 低溫冰箱（數(shù)月）貯存； (2)脫脂：人工剝離；有機(jī)溶劑；快冷快熱；脂肪分離器； (3)干燥：丙酮中脫水；沸水中蒸煮烘干。 2、植物組織：(1)葉片：水洗凈或在10小時(shí)內(nèi)置零下4 到零下30 冰箱貯藏備用;(2)種子：泡脹或粉碎。 3、微生物： (1)胞內(nèi)活性分子：離心法收集上清液，低溫下短時(shí)間貯存;(2)胞外活性分子：經(jīng)破細(xì)胞膜處理后提取，制成凍干粉。 第二節(jié) 確定測定方法一、目的和要求二、常用的測定方法一、目的和要求確定的方法簡單、靈敏、需時(shí)少、專一性二、常用的測定方法(1)吸收光譜法（absorption spectrophotometry) 直接測定法：將待

3、測物配制成一定濃度的溶液 移至分光光度計(jì)，讀取吸光度。 吸光度與待測物 濃度成正比。 例如：總蛋白含量的測定。 比色法（間接法）：將待測物與相關(guān)試劑或酶的 底物作用后，移至分光光度計(jì)，讀取吸光度。 例如： 酶活性的測定。 (2)熒光光譜法(fluo-spectrophotometry) 激發(fā)光激發(fā)待測物質(zhì)發(fā)射發(fā)射光，讀取 熒光強(qiáng)度。 熒光強(qiáng)度與待測物質(zhì)濃度成正 比。 熒光光譜法的精確性、重復(fù)性和靈敏 度比吸收光譜法好。 例如：乙醇中蒽的測定。 (3)濁度法 極稀的懸浮液采用此法，測定懸浮液在不被吸收的波長下表現(xiàn)的消光值。 有些反應(yīng)可放出質(zhì)子氫，可用PH計(jì)或NaOH滴定等方法追蹤變化計(jì)算出待測物

4、的含量。 細(xì)胞或動(dòng)物攝入待測物質(zhì)后，待測物質(zhì)攝入量與細(xì)胞或動(dòng)物的生理指標(biāo)變化有相關(guān)性，以此檢測待測物質(zhì)含量。 利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，并結(jié)合生物標(biāo)記，可對待測物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析。 用生物傳感器中的敏感膜與待測物質(zhì)反應(yīng)，可通過顯示器反映有效成分的含量。 第三節(jié) 細(xì)胞的破碎1.物理方法 2.化學(xué)處理 （1）研磨法：研缽，勻漿器（2）搗碎法：搗碎器（3）超聲波法：超聲儀（4）壓榨法:擠壓（5）凍融法：低溫冷凍迅速取出（1）脂溶性溶劑：丙酮；氯仿；甲苯（2）表面活性劑：十二烷甲基黃酸鈉；十 二烷基硫酸鈉3.生物方法 （1）溶脹（2）自溶（3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K第四節(jié) 抽提二.抽提有

5、效成分的影響因子 一、抽提的含義 用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒ǎ瑥脑现邪延行С煞址蛛x出來的過程。 用緩沖液，稀酸，稀堿或有機(jī)溶劑（丙酮，乙醇）等抽提，有時(shí)還可以用蒸餾水抽提。 值4.溫度：選擇合適的抽提溫度5.攪拌：溫和攪拌可增加溶解度 8.抽提液與抽提物的比例:1:5 值 對蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，選擇抽提液的PH值在偏離等電點(diǎn)。 有些蛋白質(zhì)或酶在極性大、離子強(qiáng)度大的溶液中穩(wěn)定，有些則相反加入蔗糖、甘油、DMSO降低溶液極性加入KCL、NaCL、NH4CL升高溶液離子強(qiáng)度 為防止酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸發(fā)生反應(yīng)，采取以下措施：(1)加入PMSF等酶抑制劑；(2)調(diào)節(jié)抽提液的極性、離子

6、強(qiáng)度和PH值。 一般蛋白質(zhì)或酶含有必需集團(tuán)巰基，若抽提液 中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會(huì)使巰基形成分子內(nèi)或分子間二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。 為此，常加入2-巰基乙醇、半胱氨酸還原劑。 植物組織和微生物細(xì)胞中含酚類物質(zhì)，在多酚氧化酶作用下，可變?yōu)橛猩孽愇镔|(zhì)。 加入苯基硫脲，可抑制這一反應(yīng)。 蛋白質(zhì)的巰基還能與源于緩沖液金屬離子鉛、鐵、銅作用，產(chǎn)生沉淀。 解決辦法： 無離子水配制緩沖液 加入1-3mM EDTA第五節(jié) 濃縮 抽提液中加入適量的中性鹽如硫酸氨或有機(jī)溶劑,使有效成分沉淀，離心除去不溶物，獲得上清透析或?qū)游鲋}。 干葡聚糖凝膠G25或吸水棒加入抽提液，兩者比例一比五，能縮小抽提液體積三倍

7、左右. 在空氣或氮?dú)鈮毫ο拢剐》肿游镔|(zhì)通過半透膜而大分子物質(zhì)留在膜內(nèi)的裝置。 四. 透析法（1）把裝透析液的透析袋埋在吸水力強(qiáng)的 聚乙二醇PEG或甘油中；（2）真空透析。 簡易減壓蒸餾裝置（降低沸點(diǎn)）. 六. 冰凍干燥法 冰凍的抽提液在真空狀態(tài)下，可由固體直接變?yōu)闅怏w。 第六節(jié) 純化方案的設(shè)計(jì)與評價(jià)一. 純化方案的設(shè)計(jì)純化的總原則：考慮抽提液中有效成分與雜質(zhì)的理化性質(zhì)差異，幾種方法組成一個(gè)科學(xué)合理的純化方案切忌：一種方法重復(fù)使用 考察比活力、純化倍數(shù)和收得率第二編 純化方法第二章 沉淀法第三章 吸附層析第四章 疏水層析第五章 離子交換層析第六章 凝膠過濾第七章 親和層析第八章 聚焦層析第九章

8、 高效液相色譜第十章 固定化的酶與微生物第二章 沉淀法第一節(jié) 基本原理與沉淀類型第二節(jié) 應(yīng)用實(shí)例第一節(jié) 基本原理與沉淀類型一、基本原理二、制備蛋白質(zhì)三、制備核酸一、基本原理 根據(jù)各種物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，改變?nèi)苜|(zhì)的性質(zhì)，致使抽提液有效成分溶解度變化。 二、制備蛋白質(zhì)1. 鹽析法2. 有機(jī)溶劑沉淀法3. 蛋白質(zhì)沉淀法4. 聚乙二醇沉淀法5. 選擇性沉淀法6. 結(jié)晶沉淀法1. 鹽析法(1) 鹽分級(jí)沉淀(2) 鹽析曲線制作(3) 鹽析的影響因子(4) 脫鹽(1)鹽分級(jí)沉淀 鹽的選擇：常選用硫酸銨 硫酸銨鹽析 A.固體法：逐步加入固體硫酸銨，當(dāng)加到一定 的飽和度時(shí)，蛋白質(zhì)便可沉淀出來。 B.飽和溶液法：逐步加

9、入預(yù)先調(diào)好pH值的飽和硫酸銨， 蛋白質(zhì)便可沉淀出來。 C.透析法：透析袋放入一定濃度的大體積溶液中，通過 透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，沉淀蛋白質(zhì) 。 (2)鹽析曲線制作 硫酸銨飽和度% VS 蛋白質(zhì)沉淀% (3)鹽析的影響因子 鹽析常數(shù) 鹽分級(jí)范圍的差異性 PH和鹽濃度 蛋白質(zhì)的純度和濃度 其它鹽析常數(shù) lgS=beta-Ks X M 其中，S表示蛋白質(zhì)的溶解度，M表示溶液中鹽的濃度。 鹽析常數(shù)Ks值大，意味著蛋白溶解度減低速度隨著鹽濃度增加而快速降低。 鹽分級(jí)范圍的差異性 當(dāng)分離兩種以上蛋白質(zhì)時(shí)，若每一種蛋 白質(zhì)的的Ks值都大，而且鹽析范圍差異明顯，則分離效果好。 蛋白質(zhì)的純度和濃度

10、 一般控制樣品液蛋白質(zhì)濃度在0.2%-2%為宜。 其它有時(shí)需在溶液中加1mM的EDTA鹽，除金屬離子硫酸銨沉淀時(shí)間控制好，一般在2h左右(4)脫鹽：凝膠過濾法和透析法 透析法注意事項(xiàng) 透析帶處理：用蒸餾水洗凈，檢查無漏洞 透析液選擇：一般為低離子強(qiáng)度中性緩沖液 掌握透析時(shí)間：攪拌，樣品液與透析液體積 比為1：10，3h. 2. 有機(jī)溶劑沉淀法基本原理：與鹽溶液一樣具有脫水作用；有機(jī)溶劑介電常數(shù)比水小，使溶劑極性減小注意事項(xiàng) (1)低溫下操作 防止有機(jī)溶劑的放熱使蛋白變性 (2)中性鹽作用 增加蛋白質(zhì)溶解度，防變性 (3)多價(jià)陽離子作用 結(jié)合蛋白質(zhì)，致其溶解度降低3. 蛋白質(zhì)沉淀法鹽沉淀法和有機(jī)

11、溶劑沉淀法可以沉淀很多蛋白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)沉淀法則僅對一類或一種蛋白質(zhì)起作用。 常用堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬離子。 4. 聚乙二醇沉淀法 聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。 5. 選擇性沉淀法 根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的熱點(diǎn)，用選擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有效成分的目的。 蛋白質(zhì)沉淀可分為晶體沉淀和無定形沉淀兩類 ，前者分子排列有規(guī)則，后者分子排列無規(guī)則在提純階段，當(dāng)某一蛋白質(zhì)濃度達(dá)到5%- 30%水平時(shí)，只要條件合適，就能產(chǎn)生一一定形狀的晶體三、制備核酸1.DNA/RNP復(fù)合物的

12、解聚1.DNA/RNP復(fù)合物的解聚 通常使DNA/RNP復(fù)合物有效解聚的辦法，主要是采用加入去污劑、有機(jī)溶劑和蛋白水解酶等試劑加以實(shí)現(xiàn)。 (1)去污劑:SDS、DOC、NP40、Triton X-100(2)有機(jī)溶劑:苯酚、氯仿（注意事項(xiàng)P34）(3)蛋白水解酶：溶菌酶、蛋白酶E/K(1)多糖(2)DNA與RNA的分離(1)多糖動(dòng)物材料分離多糖，處理前饑餓12h植物材料分離多糖，處理前暗室培養(yǎng)數(shù)天核酸分離液中多糖，使用選擇性沉淀劑(2)DNA與RNA的分離 鹽析：NaCL分離DNA和RNA 酶水解法：提取DNA時(shí)，可用RNase;反之，可 用DNase 在核酸溶液中加入某些有機(jī)溶劑和非離子型聚

13、合物等試劑時(shí)，核酸會(huì)被有效沉淀出來。 (1)有機(jī)溶劑：乙醇-鹽溶液、乙丙醇(2)聚乙二醇(3)CTAB第二節(jié) 應(yīng)用實(shí)例一、皮磷酸二酯酶的純化二、細(xì)菌染色體DNA的制備一、皮磷酸二酯酶的純化1.制備丙酮粉2.第一次硫酸銨分級(jí)3.第二次硫酸銨分級(jí)4.丙酮分級(jí)分離第三章 吸附層析 吸附層析又稱色層法或色譜法。 按流動(dòng)相分類，有液相層析和氣相層析；按固定相床的形式分類，柱層析、薄層層析、薄膜層析等。 按原理不同可分為： 第一節(jié) 吸附柱層析 第二節(jié) 薄層層析 第三節(jié) 聚酰胺薄層層系第一節(jié) 吸附柱層析一、常用術(shù)語二、基本原理三、吸附劑四、洗脫劑五、層析柱的制備與層析操作六、應(yīng)用與實(shí)例一、常用術(shù)語1.固定相

14、 2.流動(dòng)相 3.層析 4.操作容量 5.床體積（ Vt ） 6.洗脫體積（Ve）7.外水體積 （Vo） 8.內(nèi)水體積（Vi） 9.基質(zhì)體積 （Vg） 10.膨脹度11.分配系數(shù)和遷移率 固定相是由層析基質(zhì)組成的物質(zhì)，包括固體物質(zhì)（吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（固定在纖維素或硅膠上的溶液）。 這些物質(zhì)與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。 在層析過程中推動(dòng)固定相上的物質(zhì)向一定方向移動(dòng)的液體或氣體稱為流動(dòng)相。 又稱洗脫劑或洗滌劑，在薄層層析中稱展層劑。 以基質(zhì)為固定相，以液體或氣體為流動(dòng)相，有效成分和雜志在這兩個(gè)相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附或交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到分離。 在

15、特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。 數(shù)值大，結(jié)合力強(qiáng)；數(shù)值小，結(jié)合力弱。 膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（ Vt ）： Vt= Vo +Vi+ Vg 某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大時(shí)的流動(dòng)相體積。 外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和。 內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和。 基質(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積。 Vo 、Vi、Vg都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變化的。 每克溶脹基質(zhì)所具有的床體積。 一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大。 分配系數(shù)：一組分在固定相與流動(dòng)相中含量的比值（K）

16、。 遷移率：一組分在相同時(shí)間內(nèi)，在固定相移動(dòng)的距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比。 K值大，說明該組分與固定相結(jié)合力大，遷移率小；反之則結(jié)合力小，遷移率大。 二、基本原理 在吸附層析法中，使用的固定相基質(zhì)是顆粒狀的吸附劑。 在吸附劑的表面存在著許多隨機(jī)分布的吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過范德瓦爾力和靜電引力與蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子結(jié)合。 結(jié)合力大小與生物分子結(jié)構(gòu)和和吸附劑的性質(zhì)有密切關(guān)系。 三、吸附劑1.吸附劑的選擇2.吸附劑的性質(zhì)應(yīng)具備：表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低。 極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。 但是為了解吸附，對于極性大的分離物，應(yīng)選擇極性小的吸

17、附劑。 使用前預(yù)處理：過篩除去大顆粒，懸浮除去細(xì)小顆粒，酸、堿浸泡，接著沸水煮，清水洗，末了用有機(jī)溶劑處理。 羥基磷灰石和硅膠吸附劑的性質(zhì)。 羥基磷灰石（HA）：吸附容量高，穩(wěn)定性好，主要用于制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、和其他生命物質(zhì)。 HA為干粉，使用前先在蒸餾水中浸泡。 HA懸浮液需要用旋渦振蕩器混合。 忌用檸檬酸緩沖液和的緩沖液。 細(xì)顆粒操作容量比粗的大，分辨率也比粗的好，但用細(xì)顆粒層析時(shí)，宜采用直徑較大的柱子。 性質(zhì) A.含水量 B.粒度活化活性測定四、洗脫劑符合條件：純度較高；穩(wěn)定性好；能較完全洗脫下所分離的成分粘度?。灰缀退枰某煞址珠_。 五、層析柱的制備與層析操作1.層析

18、柱2.吸附劑的用量3.裝柱和平衡4.上樣和洗脫5.吸附劑的再生 一般柱的直徑與長度之比為1：10-1：40。 采用極細(xì)顆粒吸附劑裝柱時(shí)，宜用比例大的層析柱，反之采用比例小的層析柱。 這樣有利于節(jié)省時(shí)間和提高分辨率。 操作容量高時(shí)，吸附劑用量少。 一般吸附劑用量為被分離樣品的30-50倍。 若樣品成分難分開，應(yīng)加大吸附劑用量。 裝柱方法有干裝法和濕裝法。 干裝法不宜將氣泡排盡。 濕裝法先加適量溶劑到柱內(nèi)，排走空氣，然后把浸泡好的吸附劑攪勻，隨即將此懸浮液連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3時(shí)打開柱下端開口，讓溶劑慢慢流出，使柱上端懸浮液徐徐下降至需要的高度。 平衡液流至固定相表面時(shí)，

19、關(guān)閉下端螺旋夾；加樣后，打開螺旋夾；樣品液向固定相移動(dòng)；樣品液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；用洗滌液沖洗柱壁后，打開螺旋夾；洗滌液流至固定相表面時(shí)，關(guān)閉下端螺旋夾；在柱上加緩沖液，并與儲(chǔ)液瓶連通，打開螺旋夾后進(jìn)行洗滌。 用過的吸附劑經(jīng)過適當(dāng)處理恢復(fù)其原有性能。 六、應(yīng)用與實(shí)例1.應(yīng)用2.實(shí)例（1）純化生命物質(zhì)（2）分離蛋白質(zhì)的亞基（3）濃縮溶液（1）用HA層析柱分離胞質(zhì)型多角體病毒雙鏈RNA（2）用硅膠層析柱分離純化紅曲色素（3）用硅膠層析柱分離銀杏黃酮類物質(zhì)第二節(jié) 薄層層析 薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法。 優(yōu)點(diǎn)： 1.展層時(shí)間短 2.設(shè)

20、備簡單、操作方便，既適用于分析，也適用于制備 3.溫度變化和溶劑飽和程度對Rf值影響較小 4.可使用腐蝕性顯色劑 5.靈敏度高 主要應(yīng)用于鑒定小分子物質(zhì)和制備少量物品，有時(shí)也用于鑒定某些大分子物質(zhì)的純度。 一 主要操作過程 二、應(yīng)用實(shí)例一、主要操作過程1.薄板制備2.點(diǎn)樣3.展層4.顯色玻板制板：a.玻棒涂布法 b.有機(jī)玻璃尺涂布法c.半機(jī)械涂布法 活化活性測定點(diǎn)樣量不宜太多，否則會(huì)降低Rf值；原點(diǎn)直徑要小于2mm；薄層板在空氣中放置時(shí)間要盡量短。 把點(diǎn)好樣的薄層板放入預(yù)先飽和的展層裝置中，讓點(diǎn)樣一端浸入展層劑中，其深度約為，切忌樣品點(diǎn)浸入展層劑中。 當(dāng)展層劑上升到離玻璃板的另一端時(shí)，停止展層

21、，取出玻璃板并立即畫出展層劑的前緣，迅速吹干。 注意：選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿?使用適當(dāng)?shù)恼箤友b置。 薄層可采用噴霧顯色，展層譜可在紫外光下檢測。 二、應(yīng)用實(shí)例1.用薄層法純化和鑒定淀粉中單半乳糖苷甘油二酯和雙半乳糖苷甘油二酯；2.用薄層法檢測環(huán)境中殘留的有機(jī)磷藥物。 第三節(jié) 聚酰胺薄層層析一、基本原理二、應(yīng)用實(shí)例一、基本原理 聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。 氫鍵的強(qiáng)弱決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。 層析時(shí)，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。 因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x物在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的連續(xù)過程，就能達(dá)到分離的

22、目的。 二、應(yīng)用實(shí)例1.用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜層析鑒定肽N末端；2.用DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。 第四章 疏水層析 基本原理：疏水層析也稱疏水作用層析，它是根據(jù)有效成分和固定相之間相互作用的疏水力差異性大小，進(jìn)而設(shè)法將有效成分分離出來。 第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 操作與應(yīng)用第一節(jié) 基本原理一、疏水作用二、吸附劑一、疏水作用結(jié)合作用：1.蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁2.令蛋白質(zhì)變形，暴露其疏水性殘基3.疏水層析的特性所致二、吸附劑 疏水層析過程中，所使用的固定相一般是由基質(zhì)和配體兩部分構(gòu)成。 1.親水性吸附劑：基質(zhì)主要是交聯(lián)瓊脂糖， 配體是苯基或辛基化合物。 2.非親水性吸附劑

23、：基質(zhì)有硅膠和樹脂，配體為苯基、辛基和烷基等。 第二節(jié) 操作與應(yīng)用一、層析柱的制備二、加樣與洗脫三、應(yīng)用實(shí)例一、層析柱的制備1.層析柱規(guī)格：h:d3；2.固定相：苯基-Sepharose CL-4B吸附劑適合分離純化與芳香族化合物具有親和力的物質(zhì)，而辛基- Sepharose CL-4B則適用于分離純化親脂性較強(qiáng)的物質(zhì)；3.裝柱。 二、加樣與洗脫 加樣前，在樣品溶液中加適量鹽類，混勻，放置片刻即可上柱。 當(dāng)把樣品溶液徐徐加入固定相后，先用平衡緩沖液洗滌，再用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗滌，同時(shí)用部分收集器分段收集洗脫下來的溶液，并對其進(jìn)行檢測。 三、應(yīng)用實(shí)例1.純化雞胗鈣調(diào)蛋白2.純化苯丙氨酸裂解

24、酶第五章 離子交換層析 離子交換層析是常用的層析方法一，它是在以離子交換劑為固定相，以液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。 第一節(jié) 基本原理 第二節(jié) 離子交換劑的分類及性質(zhì) 第三節(jié) 離子交換劑與緩沖液的選擇 第四節(jié) 操作 第五節(jié) 應(yīng)用第一節(jié) 基本原理（圖）離子交換劑是由基質(zhì)、電荷集團(tuán)和反離子構(gòu)成的，它與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或者借助離子交換劑上電荷集團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。 反應(yīng)通式：離子交換劑與各種水合離子的結(jié)合力是與離子的電荷量成正比，與水合離子半徑平方成反比。 RA+BRB+A各種陰陽離子結(jié)合力大小的排列順序： 一價(jià)陽離子：Li+Na+K+Rb+

25、Cs+ 二價(jià)陽離子：Mg2+Ca2+Sr2+Ba2+ 一價(jià)陰離子：F-Cl-Br-I-不同價(jià)陽離子：Na+Ca2+Al3+Ti4+上述排列只適用于稀溶液中；對于呈兩性離子 的蛋白質(zhì)、酶類、多肽和核苷酸等物質(zhì)與離子 交換劑的結(jié)合力，主要取決于它們的物理化學(xué) 性質(zhì)和在特定pH條件下呈現(xiàn)的離子狀態(tài)。 第二節(jié) 離子交換劑的分類及性質(zhì) 常用的離子交換劑應(yīng)滿足下列要求：有高度的不溶性；有疏松的多空結(jié)構(gòu)和巨大的表面積，使交換離子能在交換劑中進(jìn)行自由擴(kuò)散和交換；有較多的交換集團(tuán)；有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。 一、分類二、性質(zhì)一、分類1.疏水性離子交換劑：疏水性離子交換劑中的基質(zhì)是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的樹脂

26、物質(zhì)。 分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。 主要應(yīng)用于分離無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質(zhì)。 2.親水性離子交換劑：它是一類天然的或人工合成的、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)。 常用的有纖維素、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)葡聚糖和交聯(lián)瓊脂糖等。 陽離子交換劑電荷集團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。 根據(jù)電荷集團(tuán)的強(qiáng)弱，又可將其分為強(qiáng)酸型（即帶磺酸基）、中強(qiáng)酸型（即帶磷酸集團(tuán)和亞磷酸集團(tuán)）、弱酸型（即帶羧基和酚基）。 陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺集團(tuán)后構(gòu)成的。 （1）當(dāng)引入季胺和叔胺集團(tuán)時(shí)，分別為強(qiáng)陰性和中強(qiáng)陰性離子交換劑， （2）當(dāng)引入仲胺和伯胺集團(tuán)時(shí)，為弱陰性離子交換劑。 二、性質(zhì)1

27、.顏色與形狀2.交聯(lián)度3.吸水量或膨脹度4.交換容量5.穩(wěn)定性6.比重7.流速 離子交換劑在水溶液中吸水量或膨脹度與基質(zhì)和電荷集團(tuán)的性質(zhì)，以及溶液的pH和離子強(qiáng)度密切相關(guān)。 交換容量是指離子交換劑與溶液中離子或離子化合物進(jìn)行交換的能力。 一般用總交換容量和有效交換容量表示。 影響交換容量因素：篩孔、離子強(qiáng)度、pH值。 第三節(jié) 離子交換劑與緩沖液的選擇一、離子交換劑的選擇二、緩沖液的選擇三、加樣量的確定一、離子交換劑的選擇1.陰、陽離子交換劑的選擇2.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇3.不同離子交換劑的選擇4.不同基質(zhì)離子交換劑的選擇如果被分離物質(zhì)帶正電，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如果被分離物帶負(fù)電，則應(yīng)選擇陰

28、離子交換劑；如果被分離物質(zhì)為兩性離子，一般根據(jù)其在穩(wěn)定 pH范圍內(nèi)所帶電荷來選擇交換劑。 一般強(qiáng)離子交換劑使用pH范圍較廣，而弱離子交換劑適用范圍較窄，分離生物樣品常采用弱離子交換劑。 為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。 強(qiáng)陽性和強(qiáng)陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型。 弱酸性和堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。 二、緩沖液和洗脫液的選擇選用的緩沖液的pH值一般比有效成分的值高一個(gè)單位或低一個(gè)單位，離子強(qiáng)度為時(shí)，就能很快把有效成分與雜質(zhì)分開。 選用的洗脫液，其離子強(qiáng)度和pH值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來，一般離子強(qiáng)度要比起始緩沖液高，pH值隨著離子交換劑性質(zhì)變化而變化

29、。 三、加樣量的測定 在10支盛離子交換劑的試管中，先用相同緩沖液進(jìn)行充分洗滌、平衡，然后按總交換容量的百分?jǐn)?shù)，分別加入不同量的樣品液，吸取畢，取上清液測定待分離物的含量，并繪制相應(yīng)圖譜。 第四節(jié) 操作一、離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型二、分離物質(zhì)的交換三、物質(zhì)的洗脫與收集四、標(biāo)準(zhǔn)操作一、離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型 常規(guī)的處理步驟：（1）加過量的水懸浮除去細(xì)顆粒（2）然后改用酸堿浸泡，以便除去雜質(zhì)并 使其帶上需要的反離子。 （3）酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。 再生：使用過的離子交換劑，可采用一定的方法令其恢復(fù)原來的性狀。 轉(zhuǎn)型：離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過程。

30、 陽離子交換劑轉(zhuǎn)型： A.欲使其轉(zhuǎn)成鈉型時(shí)，用NaOH處理； B.欲使其轉(zhuǎn)成氫型，則要用HCl處理； C.欲使其帶銨離子，則需要用NH4OH或NH4Cl處理。 二、分離物質(zhì)的交換 使用離子交換劑的方法有兩種： A.一種是柱層析法，即將離子交換劑裝入層析柱內(nèi)，讓溶液連續(xù)通過，該法交換效率高，應(yīng)用范圍廣； B.另一種是分批法，即將離子交換劑加入盛溶液的容器內(nèi)緩慢地不斷攪拌，該法設(shè)備簡單，易操作。 三、物質(zhì)的洗脫和收集在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。 梯度溶液按組成來分，一般有兩種： 一是增加離子強(qiáng)度的梯度溶液； 二是改變pH值的梯度溶液。

31、對于增加離子強(qiáng)度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強(qiáng)度絕大部分是增加的。 改變pH值的梯度溶液則不然，如果使用的是陽離子交換劑， pH值應(yīng)從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑， pH值應(yīng)從高到底遞減。 當(dāng)被分離物質(zhì)之間的選擇系數(shù)相差較小時(shí)，洗脫液的離子強(qiáng)度或酸堿度的變化速率小，這樣有利于分辨率的提高。 第五節(jié) 應(yīng)用一、制備、純化生命物質(zhì)二、測定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一、制備、純化生命物質(zhì)1.用強(qiáng)陽離子交換樹脂732分離4中核苷酸2.用離子交換法從胰酶水解的腸粘膜中提取肝素鈉3.用DEAE-纖維素22層析法純化鄰苯二酚-2，3-雙加氧酶4.用SP sephros HP分離生物堿第六章 凝

32、膠過濾特點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好和樣品回收率高。 應(yīng)用：分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等，還可用于測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，樣品的濃縮和脫鹽等。 第一節(jié) 凝膠的分類及性質(zhì)第二節(jié) 基本原理第三節(jié) 操作第四節(jié) 應(yīng)用第一節(jié) 凝膠的分類及性質(zhì)一、葡聚糖凝膠二、瓊脂糖凝膠三、聚丙烯酰胺凝膠四、Sephacryl五、Superdex一、葡聚糖凝膠1.理化性質(zhì)2.穩(wěn)定性 3.吸附性外觀為白色珠狀顆粒，親水性好。 型號(hào)不同，交聯(lián)度不同，篩孔的大小和分級(jí)范圍也有明顯的差異，其性質(zhì)也不一樣。 一般以G型葡聚糖凝膠作為固定相，以水溶液作為流動(dòng)相，對水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的方法稱葡聚糖凝膠過濾層析。

33、 以LH型葡聚糖凝膠為固定劑，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，對脂溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠滲透層析。 在水、鹽、堿、弱酸和有機(jī)溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，在強(qiáng)酸或氧化劑溶液中易變性，保存時(shí)應(yīng)加防腐劑 。 葡聚糖凝膠含有羧基集團(tuán)，該集團(tuán)能與份禮物中電荷集團(tuán)發(fā)生吸附作用，一般用NaCl的緩沖液消除影響。 二、瓊脂糖凝膠 瓊脂糖的商品名稱因廠家不同而不同：瑞典稱Sepharose；美國稱Bio-gelA；英國稱Segavac；丹麥稱Gelarose；我國的和瑞典相同，除Segavac外，其它都以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售。 瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好。 三、聚丙烯酰胺凝膠 商品名為Bio

34、-gel，一般制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式出售，保存時(shí)避強(qiáng)酸強(qiáng)堿和高溫。 四、Sephacryl 屬于硬性凝膠，具有一定大小的篩孔和羧基集團(tuán)。 一般用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至大的病毒顆粒。 五、Superdex Superdex是由高交聯(lián)度多空瓊脂糖與葡聚糖共價(jià)結(jié)合而成的。 該凝膠具有良好的分子篩特性和物理、化學(xué)穩(wěn)定性。 第二節(jié) 基本原理 （圖）凝膠過濾又叫分子篩層析，凝膠具有網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，小分子 物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻在外部，當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同分子質(zhì)量篩分開了。 任何一種被分離的化合物在凝膠層析柱被排阻的范圍均在0-100%之

35、間，其被排阻的程度可用分配系數(shù)Kav表示。 Kav=（Ve-Vo）/(Vt-Vo)Vt:總體積；Vo：外水體積；Ve：洗脫體積，某一成分從柱頂達(dá)到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時(shí)流動(dòng)相體積.Kav值差異性大，分離效果好； 差異性小，分離效果差。 Kav值既是判斷分離效果的參數(shù)，又是測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的重要依據(jù)。 洗脫體積Ve的判定：1.溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者，不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)，而 被排阻在外水體積的溶液中， Ve剛好等于Vo。 2.溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者，能自由進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔內(nèi)， Ve=Vt。 3.溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限之間者，則有一部分能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，則Ve

36、是在Vo和Vt之間。 測定外水體積的物質(zhì)常選用藍(lán)色葡聚糖2000，測定內(nèi)水體積的物質(zhì)常選用硫酸銨、N-乙酸酪氨酸乙酯，或者其他與凝膠無吸附力的小分子物質(zhì)。 第三節(jié) 操作一、凝膠的選擇和處理二、凝膠柱的制備三、加樣與洗脫四、凝膠柱的再生與保存一、凝膠的選擇和處理1.凝膠的選擇2.凝膠用量的計(jì)算3.凝膠的處理 （1）型號(hào) 型號(hào)不一樣，篩分范圍也不一樣。 SephadexG型一般使用于分離蛋白質(zhì)。 在除去蛋白質(zhì)溶液中的鹽類時(shí)，可選用凝膠SephadexG-25。 （2）粒度 細(xì)顆粒凝膠之間空間小，裝柱易均一，因此分離效果好。 但由于細(xì)顆粒凝膠流速慢，故宜采用大直徑層析柱；而粗顆粒凝膠流速快，宜采用小

37、直徑層析柱。 干凝膠用量（g）=r2h/膨脹度 加水充分溶脹，傾斜法除去懸浮顆粒，堿溶液中浸泡半小時(shí)，以抽濾法除去懸浮顆粒，用蒸餾水洗至中性。 排氣方法除去顆?？障吨械臍馀?。 二、凝膠柱的制備1.柱的選擇2.裝柱3.凝膠柱的鑒定 一般理想的層析柱的直徑與長度之比是1：25-1：100。 同第三章吸附柱層析的裝柱方法。 新裝的凝膠柱用適當(dāng)緩沖液平衡后，將帶色的藍(lán)色葡聚糖-2000、或者紅色葡聚糖、細(xì)胞色素C、血紅蛋白等物質(zhì)配成2mg/ml的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。 若均勻下降，則表明柱中凝膠是均勻的，沒有裂縫或氣泡。 三、加樣與洗脫1.加樣2.洗脫加樣量與測定方法和層析柱大小有關(guān)。 如測

38、定樣品含量的方法靈敏或床體積小時(shí)，加樣量可少。 否則反之。 分離效果與加樣體積、被分離樣品在層析柱中的洗脫體積或分配系數(shù)，以及凝膠床的體積有關(guān)，此外，樣品的黏度也影響層析的分辨率。 所有的洗脫液均以能容解被洗脫物質(zhì)和不使其變性或失活為原則。 除特殊情況外，一般都以單一緩沖液或者鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)也用蒸餾水。 洗脫時(shí)流速要嚴(yán)格控制，否則收集的每一部分洗脫體積就不恒定，理想的分配系數(shù)就難以測定。 一般而言，洗脫流速慢，分離效果就好，但是太慢也會(huì)因擴(kuò)散加劇而影響分離效果。 四、凝膠柱的再生及保存1.再生2.保存 再生方法： （1）先用水反復(fù)進(jìn)行逆向沖洗再用緩沖液進(jìn)行平衡。 （2）把凝膠倒出，用低

39、濃度的酸或堿按其預(yù)處理方法進(jìn)行，處理后重新裝柱即可再行使用。 短時(shí)間保存，需進(jìn)行反復(fù)洗滌以除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，并加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?；長時(shí)間保存，需將凝膠從柱中取出，進(jìn)行洗滌、脫水和干燥。 第四節(jié) 應(yīng)用一、脫鹽和濃縮二、分離生命物質(zhì)三、去熱源物質(zhì)四、測定分子質(zhì)量五、其他一、脫鹽和濃縮 利用鹽類小分子物質(zhì)可以進(jìn)入凝膠篩孔中，而大分子物質(zhì)則被排阻在其外的原理，可應(yīng)用凝膠層析法除去蛋白質(zhì)等溶液中的鹽類，從而使其與鹽類分開，一般用于這些操作的是細(xì)顆粒葡聚糖凝膠G-25。 二、分離生命物質(zhì) 對于某些理化性質(zhì)相似而分子質(zhì)量不同，或者是聚合體不等的混合溶液，采用凝膠過濾法就很容易分離。 目前在多糖、多肽、蛋白質(zhì)、

40、酶、激素和核酸等物質(zhì)的分離提純及制備工作中，已廣泛采用凝膠過濾法進(jìn)行。 三、去熱源物質(zhì) 所謂熱源物質(zhì)可能是糖蛋白一類大分子物質(zhì)。 一般在制備水解蛋白、核苷酸和酶注射液時(shí)，采用凝膠過濾法除去熱源物質(zhì)效果好。 四、測定分子質(zhì)量 由于加入凝膠柱的物質(zhì)分子質(zhì)量不同，故洗脫體積也不同。 將已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行過濾層析。 根據(jù)洗脫體積求出Kav值，Kav值與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量之間又存在線性關(guān)系 Kav=b-clgM，因此可以繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 例如：用葡聚糖凝膠柱色譜法測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。 用葡聚糖凝膠柱色譜法測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制： Kav or Ve = b-c

41、lgMA, 據(jù)Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)，記錄Vt和Vo藍(lán)色葡聚糖2000洗脫體積=Vo；重鉻酸鉀洗脫體積=VtB，加入已知M值的蛋白混合液，記錄Ve值， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程。 2.未知樣品分子量測定記錄樣品Ve值，計(jì)算出M值。 局限性： 洗脫液在pH6-8的范圍內(nèi)效果較好，而在極端pH時(shí)，會(huì)引起偏差。 一般球狀蛋白質(zhì)的軸比雖有差異，但lgM與Kav值的線性關(guān)系依然維持。 而纖維蛋白質(zhì)軸比大，不能運(yùn)用以上公式。 糖蛋白中糖的比例大于5%時(shí)，測得的分子質(zhì)量偏大。 變性劑和鹽酸胍存在時(shí)，只要在同樣的條件下測出標(biāo)準(zhǔn)曲線，依然遵守上述公式。 第七章 親和層析第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 操作

42、第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例第一節(jié) 基本原理（圖) 欲分離的大分子物質(zhì)S和相應(yīng)的專一物質(zhì)L以次級(jí)鍵結(jié)合，能生成一種可解離的絡(luò)合物L(fēng)-S，其中的L又能與活化的基質(zhì)M以共價(jià)鍵首先結(jié)合，而形成M-L-S復(fù)合物。 根據(jù)L-S之間能可逆地結(jié)合與解離的原理發(fā)展起來的層析方法稱為親和層析法。 原理：親和層析是把具有識(shí)別能力的配體L以共價(jià)鍵的方式固化到含有活化集團(tuán)的基質(zhì)M上，制成親和吸附劑M-L，而固化后的配體仍然保持束縛特異物質(zhì)的能力。 因此當(dāng)把固相載體裝入小層析柱后，讓欲分離的樣品液通過該柱時(shí)，樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等吸附到固相載體上，而

43、無親和力或非特異性吸附的物質(zhì)則被起始緩沖液洗滌出來，并形成了第一個(gè)層析峰，然后改變起始緩沖液的pH值、或增加離子強(qiáng)度、或加入抑制劑等，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來，并形成第二個(gè)層析峰。 第二節(jié) 操作一、基質(zhì)的選擇二、配體的選擇三、親和吸附劑的制備四、特異性吸附五、分離大分子物質(zhì)六、親和層析柱的再生一、基質(zhì)的選擇要求：1.極低的非特異吸附性2.高度的親水性3.較好的理化穩(wěn)定性4.大量的化學(xué)集團(tuán)能被有效的活化，且易于配體結(jié)合5.適當(dāng)?shù)亩嗫仔?，?shí)踐中用得較多的是聚丙烯酰胺凝膠、多孔性玻璃珠和瓊脂糖珠，目前應(yīng)用最多的是瓊脂糖珠。 二、配體的選擇 配體的選擇要耐心細(xì)致，可選擇的配體有抑制劑、效應(yīng)物、

44、酶的輔助因子、類似底物、抗體和其他物質(zhì)。 滿足條件： 1.與純化的物質(zhì)有較強(qiáng)親和力； 2.具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的集團(tuán)。 三、親和吸附劑的制備 把配體偶聯(lián)到基質(zhì)上的方法有物理的和化學(xué)的兩類。 前者如包埋法和吸附法等，后者如偶聯(lián)法和交聯(lián)法。 溴化氰偶聯(lián)法主要包括活化、偶聯(lián)、除去未結(jié)合的配體和配體結(jié)合量的測定等步驟。 四、特異性吸附 樣品中有效成分在親和吸附劑上的吸附量，除了與它們之間的親和力有密切關(guān)系外，還與樣品的pH值和離子強(qiáng)度有關(guān)系。 五、分離大分子物質(zhì) 洗脫專一吸附大分子物質(zhì)的條件，要使復(fù)合物完全分離，其具體做法可根據(jù)親和力決定： 親和力比較小時(shí)，可以連續(xù)用大體積平衡緩沖液洗脫，得到遲緩的大分

45、子物質(zhì)峰； 親和力一般時(shí)，主要靠改變緩沖液的性質(zhì)，使復(fù)合物之間的親和力下降到足以分離的程度； 親和力強(qiáng)時(shí)，可用與配體競爭的溶液或用蛋白質(zhì)變性劑洗脫。 A.競爭性洗脫劑：這類洗脫劑的優(yōu)點(diǎn)是專一性強(qiáng)，并能洗脫出和配體特異結(jié)合的大分子物質(zhì)。 B.蛋白質(zhì)變性條件：如用鹽酸胍、尿素等變性試劑配制的溶液洗脫下的蛋白質(zhì)等生命大分子物質(zhì)，需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚矸娇苫謴?fù)活性。 六、親和層析柱的再生 當(dāng)洗脫結(jié)束后，應(yīng)連續(xù)用大量的洗脫液或高濃度的鹽溶液徹底洗滌柱子，接著再用平衡緩沖液使層析柱重新平衡。 經(jīng)過這樣處理的柱子可再次上樣，進(jìn)行第二次層析。 第三節(jié) 提高吸附劑的操作容量 方法1.在配體和基質(zhì)間引入“手臂”；2.

46、增加配體取代的程度；3.配體與基質(zhì)以最少的鍵連接；4.基質(zhì)多孔性的影響；5.樣品的濃度、pH值、離子強(qiáng)度以及上樣的速度等因子對其影響也不可忽視。 第四節(jié) 應(yīng)用實(shí)例一、純化大分子物質(zhì)二、研究酶的結(jié)構(gòu)和功能三、實(shí)例一、純化大分子物質(zhì)1.抗體、抗原及其結(jié)合物2.糖蛋白3.含巰基蛋白4.核酸5.其他 用于純化抗體、抗原及其結(jié)合物的配體主要有抗原、抗體和金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）等物質(zhì)。 利用SPA-Sepharose CL-4B 固相載體可以分離IgG、抗原和免疫復(fù)合物。 還可以利用結(jié)合的IgG的SPA-Sepharose CL-4B吸附劑還可分離特異性的抗原。 目前用于純化糖蛋白的配體主要是凝集

47、素，不同的凝集素結(jié)合糖蛋白的類型不同。 用活化的巰基Sepharose 4B或巰基丙酰-Sepharose 6B和Hg-Sepharose4B吸附劑可以分離含巰基的蛋白質(zhì)、酶、肽以及汞化或巰基化的核苷酸。 用Poly-Sepharose吸附劑可以分離mRNA；用Poly-Sepharose4B吸附劑可以分離很多物質(zhì)，如束縛mRNA的蛋白質(zhì)、束縛Poly的RNA等；用Lysine-Sepharose4B吸附劑還可以分離rRNA、雙鏈DNA和血纖維蛋白溶酶原等；另外，用固相免疫親和法還可以從核糖體分離mRNA。 第八章 聚焦層析第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 操作第三節(jié) 應(yīng)用第一節(jié) 基本原理一、多緩沖劑和

48、多緩沖交換劑二、聚焦層析原理一、多緩沖劑和多緩沖交換劑1.多緩沖劑2.多緩沖交換劑多緩沖劑是由一系列精選的物質(zhì)構(gòu)成的。 它在一定范圍pH值條件小具有相似的、較強(qiáng)的緩沖能力；它與普通的緩沖劑不一樣。 瑞典Pharmacia公司出售的多緩沖劑有polybuffer96和polybuffer74兩種。 這兩種多緩沖劑分別在pH6-9和pH4-7范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的緩沖的能力，如將它們混合在一起，則較強(qiáng)緩沖能力的pH范圍為4-9。 瑞典Pharmacia公司出售的多緩沖交換劑PBE94和PBE118是以Sepharose6B為基質(zhì)，通過化學(xué)方法把帶有多種電荷集團(tuán)的配體與其偶聯(lián)而成的。 PBE94和PBE1

49、18的操作容量與pH值密切相關(guān)，PBE94適用于pH4-9的范圍內(nèi)的聚焦層析，PBE118則適用于pH8-11范圍內(nèi)的聚焦層析。 二、聚焦層析原理 聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成、蛋白質(zhì)的行為和聚焦效應(yīng)三個(gè)方面來闡述。 在離子交換層析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實(shí)現(xiàn)的。 當(dāng)使用陰離子交換劑進(jìn)行層析時(shí)，制備pH值由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是：在梯度儀的混合室中裝高pH值溶液，而在另一室裝低pH值極限溶液，然后打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續(xù)不斷地流過柱體。 這時(shí)從柱的上部到下部溶液的pH值是由低到高變化的。 蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點(diǎn)和層析柱中的pH值，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)至

50、環(huán)境pH值高于其pI值時(shí)，蛋白質(zhì)由正電荷變?yōu)樨?fù)電荷，并與陰離子交換劑結(jié)合。 由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境pH值再次低于pI值時(shí)，這時(shí)它又帶正電荷，并從交換劑解析下來。 隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復(fù)進(jìn)行，于是，各種蛋白質(zhì)就按各自的等電點(diǎn)大小被洗脫下來，從而達(dá)到分離目的。 蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)。 如果一種蛋白質(zhì)是加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，它將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處。 從此位置開始，其蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到PhpI時(shí)被洗出。 第二節(jié) 操作一、多緩沖劑的選擇二、多緩沖交換劑用量的確定三、多

51、緩沖交換劑的處理四、樣品的準(zhǔn)備五、上樣和洗脫六、樣品中多緩沖劑的去除一、多緩沖劑的選擇 多緩沖劑的選擇是根據(jù)聚焦層析的pH梯度范圍決定的，而pH梯度范圍又受被分離樣品的等電點(diǎn)與組分復(fù)雜程度，以及層析的分辨率等因子控制的。 二、多緩沖交換劑用量的確定 聚焦層析中所需的多緩沖交換劑之用量取決于分離樣品的用量。 一般20-30ml床體積已足夠分離1-200mg蛋白/pH單位，然而準(zhǔn)確的用量還須根據(jù)試驗(yàn)分辨率來確定。 三、多緩沖交換劑的處理 裝柱前，多緩沖交換劑須用起始緩沖液平衡，其用量為床體積的10-15倍。 四、樣品的準(zhǔn)備 上樣量取決于每個(gè)區(qū)帶中蛋白質(zhì)的量。 通常每10mL床體積可以加100mg左

52、右的樣品。 由于這種層析法有聚焦效應(yīng)，所以樣品的濃度可以低些。 五、上樣和洗脫 上樣前，一般先在床頂部小心鋪一層1-2cm厚的SephadexG-25，這樣可確保樣品均勻，平展地置于床面上。 加樣前，須先加倍床體積的洗脫液滲入柱內(nèi)。 上樣后，用洗脫緩沖液淋洗，pH梯度自動(dòng)形成，pH梯度的斜率是由多緩沖劑洗脫液濃度決定的。 濃度高， pH梯度斜率陡，洗脫峰窄；濃度低， pH梯度斜率平緩，洗脫峰寬。 六、樣品中多緩沖劑的去除 方法： 在分離樣品中加入固體硫酸銨，使蛋白 質(zhì)沉淀，通過離心使樣品與多緩沖劑分開； 將分離樣品通過SephadexG-25柱，可把分子質(zhì)量大于5000Da的蛋白質(zhì)與多緩沖劑分

53、開； 將分離的樣品通過親和層析和疏水層析柱，即可把蛋白質(zhì)樣品與多緩沖劑分開。 第三節(jié) 應(yīng)用一、分離模型蛋白質(zhì)二、分離復(fù)雜的物質(zhì)三、鑒定某些酶的性質(zhì)第九章 高效液相色譜 高效液相色譜（HPLC）又稱高速或高壓液相色譜，它不僅適用于很多不宜揮發(fā)、難熱分解物質(zhì)的定性定量分析，而且也適用于這些物質(zhì)的制備與分離。 近年來出現(xiàn)了幾種與HPLC相近的快速蛋白液相色譜、低壓液相色譜和中壓液相色譜。 第一節(jié) 基本原理第二節(jié) 反相高效液相色譜第三節(jié) 應(yīng)用第一節(jié) 基本原理(圖） HPLC按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜和高效聚焦液相色譜

54、等。 原理與相對應(yīng)的普通液相層析相似，不同處：靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好； 2.樣品液和流動(dòng)液在進(jìn)入色譜柱前，必須超濾處理，這樣可提高色譜柱的使用壽命。 高效液相色譜部件一、進(jìn)樣系統(tǒng)二、輸液系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)四、檢測系統(tǒng)五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一、進(jìn)樣系統(tǒng) 一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣閥完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定控制的。 這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。 二、輸液系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。 三、分離系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。 色譜柱是核心部分，其大小是根據(jù)使用目的、樣品數(shù)量及其復(fù)雜程度決定的。 四、檢測系統(tǒng) 高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折

55、光檢測器和熒光檢測器三種。 五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確展開。 第二節(jié) 反相高效液相色譜 反相高效液相色譜（RP-HPLC）是用于純化和制備肽類、生物堿、皂苷等化合物的一種方法。 在分離天然化合物時(shí)，所使用的HPLC中，約95%是C18反相硅膠HPLC， RP-HPLC與普通HPLC相比，前者僅僅是流動(dòng)相的極性比固定相的大，因此通常把流動(dòng)相的極性大于固定相的色譜稱為反相色譜。 一、固定相、流動(dòng)相和色譜柱二、分離純化糖基化白蛋白肽片段一、固定相、流動(dòng)相和色譜柱1.固定相2.流動(dòng)相3.色譜柱 （1）基質(zhì)：目前用作RP

56、-HPLC的基質(zhì)首選是硅膠，其次是聚乙烯苯化合物，而硅膠基質(zhì)又可分為薄殼型和全多空微粒兩類。 （2）衍生物：在RP-HPLC中的固定相，往往借助鍵合方式，將不同長度的碳鏈烷基化合物，苯基或多芳香烴類化合物結(jié)合到全多孔微粒硅膠表面構(gòu)成的。 使用較多的為C18烷基鍵合硅膠和大孔樹脂。 在RP-HPLC中，流動(dòng)相為非緩沖的水和有機(jī)溶劑混合溶液。 流動(dòng)相系統(tǒng)常以0.1%三氟乙酸為含水劑，以乙腈、醇類為有機(jī)溶劑。 正常情況下，疏水性弱的物質(zhì)先被洗下來，疏水性強(qiáng)的后被洗下來。 一般依據(jù)薄層色譜或反向薄層色譜的展層劑組合作為HPLC選擇流動(dòng)相的參考，但是薄層色譜中，硅膠表面積是柱色譜的兩倍，所以應(yīng)把的流動(dòng)相

57、作為HPLC的選擇對象。 如果將分析型HPLC條件直接用于制備型時(shí)，所使用的壓力應(yīng)是分析型的1/3。 色譜柱體積的大小是根據(jù)分離物數(shù)量及其有效成分與雜質(zhì)之間理化性質(zhì)差異性確定的。 第三節(jié) 應(yīng)用 應(yīng)用：分析樣品的性質(zhì)與含量、測定酶活力和蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以及分離純化蛋白質(zhì)、核酸和天然活性物質(zhì)等。 一、定性定量分析 二、測定酶活性 三、測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量 四、分離核酸和蛋白質(zhì)一、定性定量分析 利用高效液相色譜對各種物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的依據(jù)是，色譜峰的位置及峰面積的大小。 也就是說，在同一色譜柱中，不同物質(zhì)產(chǎn)生的色譜峰位置不一樣；同一物質(zhì)的不同濃度產(chǎn)生的色譜峰面積大小也不一樣。

58、因此，根據(jù)色譜峰的位置或某一色譜峰高度的增加就可確定未知樣品中被檢測物質(zhì)組分。 二、 測定酶活性 酶活性的測定一般是根據(jù)底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來確定的，利用HPLC測定測定酶活性的大小可以做到準(zhǔn)確、快速、靈敏。 第三篇 鑒定方法第十一章 標(biāo)記第十四章 生物芯片第十五章 聚合酶鏈反應(yīng)第十六章 細(xì)胞凋亡第十八章 電泳第十九章 免疫分析第二十章 氣相色譜第十一章 標(biāo)記標(biāo)記是指以共價(jià)鍵方式將放射性元素或非放射性物質(zhì)結(jié)合到某些生命物質(zhì)上的過程。 第一節(jié) 核酸標(biāo)記第二節(jié) 蛋白質(zhì)標(biāo)記第一節(jié) 核酸標(biāo)記一、標(biāo)記物的制備及類型二、非核酸標(biāo)記三、核素標(biāo)記四、標(biāo)記物純化五、探針的鑒定六、應(yīng)用實(shí)例一、標(biāo)記物的制備及

59、類型 目前許多實(shí)驗(yàn)室采用的標(biāo)記方法的選擇取決于檢測探針的手段、靈敏度以及模板的來源。 標(biāo)記物的類型主要包括非核素標(biāo)記和核素標(biāo)記。 二、非核素標(biāo)記 非核素標(biāo)記都很容易滲入到DNA或RNA中制成核酸探針。 非核素示蹤物主要有地高辛、生物素和熒光素。 （1）雙鏈DNA探針標(biāo)記（2）單鏈DNA探針標(biāo)記（3）PCR合成DNA探針（4）寡核苷酸探針的制備（5）RNA探針的制備隨機(jī)引物引導(dǎo)法切口平移法 隨機(jī)引物介導(dǎo)制備DNA探針時(shí)，需要隨機(jī)引物、單鏈DNA模板、DNA聚合酶、Dig-11-dUTP和dNTP的混合物及試劑等。 原理：是當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時(shí)，大腸桿菌DNA聚合酶I可把核苷酸殘基加到

60、切口處的3羥基端。 由于該酶具有5-3外切核酸酶活性，所以它可從切口的5端除去核苷酸。 5端除去與3加入核苷酸同時(shí)進(jìn)行，導(dǎo)致切口沿著DNA模板鏈移動(dòng)。 制備單鏈DNA探針的模板是特定核酸序列互補(bǔ)雙鏈中的一條，它與傳統(tǒng)雙鏈DNA探針相比，不存在互補(bǔ)雙鏈，因此避免了DNA雙鏈在重新復(fù)性時(shí)形成無效雜交體。 方法：合成可克隆于噬菌?；騇13噬菌體載體上的DNA模板，合成與其序列互補(bǔ)的探針。 將克隆于特定載體上靶序列轉(zhuǎn)錄成RNA探針。 在PCR循環(huán)過程中，TagDNA聚合酶可將DIG-11-dUTP滲入DNA鏈中，用此法制備的DIG探針靈敏度高、數(shù)量大。 用DIG-11-ddUTP制備寡核苷酸探針時(shí)，有