RNA功能及其研究進(jìn)展演示教學(xué)

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RNA功能及其研究進(jìn)展-RNA功能及其研究進(jìn)展摘要核糖核酸(RiboNucleicAcid簡稱RNA)由至少幾十個(gè)核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵連接而成的一類核酸,因含核糖而得名,簡稱RNA。RNA普遍存在于動(dòng)物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內(nèi)。RNA和蛋白質(zhì)生物合成有密切的關(guān)系。在RNA病毒和噬菌體內(nèi)，RNA是遺傳信息的載體。RNA一般是單鏈線形分子;也有雙鏈的如呼腸孤病毒RNA；環(huán)狀單鏈的如類病毒RNA；1983年還發(fā)現(xiàn)了有支鏈的RNA分子。RNA能夠充當(dāng)“信使”,傳遞DNA(脫氧核糖核酸)上的遺傳信息

2、,將其用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)合成。研究顯示,向生物體內(nèi)注入微小RNA片段,會(huì)干擾生物體本身的RNA“信使”功能,導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)無法合成,從而“關(guān)閉”特定基因?？茖W(xué)家認(rèn)為,采用RNA干擾技術(shù)直接從源頭上讓致病基因“沉默”,也許可以更有效地治療某些疾病。前言RNA指ribonucleicacid核糖核酸，核糖核苷酸聚合而成的沒有分支的長鏈。分子量比DNA小，但在大多數(shù)細(xì)胞中比DNA豐富。RNA主要有3類，即信使RNA（mRNA），核糖體RNA（rRNA）和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）。這3類RNA分子都是單鏈，但具有不同的分子量、結(jié)構(gòu)和功能。rRNA是核糖體的組成成分，由細(xì)胞核中的核仁合成，而mRNA、tRN

3、A在蛋白質(zhì)合成的不同階段分別執(zhí)行著不同功能。mRNA是以DNA的一條鏈為模板，以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實(shí)現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達(dá)，是遺傳信息傳遞過程中的橋梁。tRNA的功能是攜帶符合要求的氨基酸，以連接成肽鏈，再經(jīng)過加工形成蛋白質(zhì)。在RNA病毒中，RNA是遺傳物質(zhì)，植物病毒總是含RNA。近些年在植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些比病毒還小得多的浸染性致病因子，叫做類病毒。類病毒是不含蛋白質(zhì)的閉環(huán)單鏈RNA分子，此外，真核細(xì)胞中還有兩類RNA，即不均一核RNA（hnRNA）和小核RNA（snRNA）。hnRNA是mRNA的前體；snRNA參與hnRNA的剪接（一種加工過程）。RNA

4、干擾（RNAinterference,RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。簡單的說是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的HYPERLINK/view/201603.htmt_blank基因沉默現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。與其它基因沉默現(xiàn)象不同的是，在植物和HYPERLINK/view/107703.htmt_blank線蟲中，RNAi具有傳遞性，可在細(xì)胞之間傳播，此現(xiàn)象被稱作系統(tǒng)性RNA干擾(systemicRNAi)

5、。RNAi與轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencingandtransgenesilencing)在分子層次上被證實(shí)是同一種現(xiàn)象。RNA干擾是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式，是生物界古老而且進(jìn)化的高度保守的現(xiàn)象之一。RNAi是通過siRNA介導(dǎo)的特異性高效抑制基因表達(dá)途徑，由siRNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反應(yīng)特征，反應(yīng)中需要多種蛋白因子以及ATP參與。關(guān)鍵詞核糖核酸mRNAtRNArRNARNA干擾RNA種類及功能在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)主要有三種不同的RNA分子在基因的表達(dá)過程中起重要的作用。它們是信使RNA（messengerRN

6、A，mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tranferRNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA）。RNA含有四種基本堿基，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外還有幾十種稀有堿基。RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核糖核苷酸通過3，5磷酸二酯鍵相連而成的多聚核苷酸鏈。天然RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，一般并不像DNA那樣都是雙螺旋結(jié)構(gòu)，只有在許多區(qū)段可發(fā)生自身回折，使部分A-U、G-C堿基配對(duì)，從而形成短的不規(guī)則的螺旋區(qū)。不配對(duì)的堿基區(qū)膨出形成環(huán)，被排斥在雙螺旋之外。RNA中雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素，也主要是堿基的堆砌力，其次才是氫鍵。每一段雙螺旋區(qū)至少需要46對(duì)堿基對(duì)

7、才能保持穩(wěn)定。在不同的RNA中，雙螺旋區(qū)所占比例不同。細(xì)胞內(nèi)有三類主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。在大多數(shù)細(xì)胞中RNA的含量比DNA多58倍。mRNA生物的遺傳信息主要貯存于DNA的堿基序列中，但DNA并不直接決定蛋白質(zhì)的合成。而在真核細(xì)胞中，DNA主要貯存于細(xì)胞核中的染色體上，而蛋白質(zhì)的合成場(chǎng)所存在于細(xì)胞質(zhì)中的核糖體上，因此需要有一種中介物質(zhì)，才能把DNA上控制蛋白質(zhì)合成的遺傳信息傳遞給核糖體?，F(xiàn)已證明，這種中介物質(zhì)是一種特殊的RNA。這種RNA起著傳遞遺傳信息的作用，因而稱為信使RNA(messengerRNA，mRNA)。mRNA的功能就是把DNA上的遺傳信息精確無誤地

8、轉(zhuǎn)錄下來，然后再由mRNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，完成基因表達(dá)過程中的遺傳信息傳遞過程。在真核生物中，轉(zhuǎn)錄形成的前體RNA中含有大量非編碼序列，大約只有25%序列經(jīng)加工成為mRNA，最后翻譯為蛋白質(zhì)。因?yàn)檫@種未經(jīng)加工的前體mRNA(pre-mRNA)在分子大小上差別很大，所以通常稱為不均一核RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）。tRNA如果說mRNA是合成蛋白質(zhì)的藍(lán)圖，則核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。但是，合成蛋白質(zhì)的原材料20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，必須用一種特殊的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transferRNA，tRNA）把氨基酸搬

9、運(yùn)到核糖體上，tRNA能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準(zhǔn)確地將它攜帶的氨基酸連結(jié)起來形成多肽鏈。每種氨基酸可與1-4種tRNA相結(jié)合，現(xiàn)在已知的tRNA的種類在40種以上。tRNA是分子最小的RNA，其分子量平均約為27000（25000-30000），由70到90個(gè)核苷酸組成。而且具有稀有堿基的特點(diǎn)，稀有堿基除假尿嘧啶核苷與次黃嘌呤核苷外，主要是甲基化了的嘌呤和嘧啶。這類稀有堿基一般是在轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)過特殊的修飾而成的。1969年以來，研究了來自各種不同生物，:如酵母、大腸桿菌、小麥、鼠等十幾種tRNA的結(jié)構(gòu)，證明它們的堿基序列都能折疊成三葉草形二級(jí)結(jié)構(gòu)，而且都具有如下的共性：5末端具有G（大部分）

10、或C。3末端都以ACC的順序終結(jié)。有一個(gè)富有鳥嘌呤的環(huán)。有一個(gè)反密碼子環(huán)，在這一環(huán)的頂端有三個(gè)暴露的堿基，稱為反密碼子（anticodon）.反密碼子可以與mRNA鏈上互補(bǔ)的密碼子配對(duì)。有一個(gè)胸腺嘧啶環(huán)。rRNA核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)是組成核糖體的主要成分。核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。在大腸桿菌中，rRNA量占細(xì)胞總RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA僅占3-5%。rRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，形成核糖體（ribosome），如果把rRNA從核糖體上除掉，核糖體的結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生塌陷。原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。S為

11、沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient），當(dāng)用超速離心測(cè)定一個(gè)粒子的沉淀速度時(shí)，此速度與粒子的大小直徑成比例。5S含有120個(gè)核苷酸，16S含有1540個(gè)核苷酸，而23S含有2900個(gè)核苷酸。而真核生物有4種rRNA，它們分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S，分別具有大約120、160、1900和4700個(gè)核苷酸。rRNA是單鏈，它包含不等量的A與U、G與C，但是有廣泛的雙鏈區(qū)域。在雙鏈區(qū)，堿基因氫鍵相連，表現(xiàn)為發(fā)夾式螺旋。rRNA在蛋白質(zhì)合成中的功能尚未完全明了。但16S的rRNA3端有一段核苷酸序列與mRNA的前導(dǎo)序列是互補(bǔ)的，這可能有助于mRNA與核糖體的結(jié)合

12、。snRNA除了上述三種主要的RNA外，細(xì)胞內(nèi)還有小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)。它是真核生物轉(zhuǎn)錄后加工過程中RNA剪接體（spilceosome）的主要成分。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有五種snRNA，其長度在哺乳動(dòng)物中約為100-215個(gè)核苷酸。snRNA一直存在于細(xì)胞核中，與40種左右的核內(nèi)蛋白質(zhì)共同組成RNA剪接體，在RNA轉(zhuǎn)錄后加工中起重要作用。另外，還有端體酶RNA(telomeraseRNA)，它與染色體末端的復(fù)制有關(guān)；以及反義RNA(antisenseRNA)，它參與基因表達(dá)的調(diào)控。有的RNA分子還具有生物催化作用。上述各種RNA分子均為轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，mRNA最后翻譯為蛋

13、白質(zhì)，而rRNA、tRNA及snRNA等并不攜帶翻譯為蛋白質(zhì)的信息，其終產(chǎn)物就是RNA。RNA研究進(jìn)展RNA干擾（RNAi）RNAi的定義目前對(duì)HYPERLINK/view/35842.htmt_blankRNAi(RNAinterference)的定義有很多種，不同的資料對(duì)其定義的側(cè)重點(diǎn)也不盡相同，如果將RNAi看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義：RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。RNAi是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因

14、導(dǎo)入或病毒入侵后，細(xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為：RNAi是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA和反義RNA),從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的mRNA降解成21nt23nt的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型

15、缺失,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilence,PTGS)。簡單地可以說，RNAi就是指由RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象。RNA干擾研究最近由于RNA干擾（RNAinterference，RNAi）的發(fā)現(xiàn)使反義領(lǐng)域的研究增多。這種自然發(fā)生的現(xiàn)象最早是在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的，是序列特異性地使轉(zhuǎn)錄后的基因沉默的有力機(jī)制。由于最近兩年在RNAi領(lǐng)域取得的進(jìn)步，已經(jīng)有許多這方面的綜述發(fā)表。RNA干擾是由長的雙鏈RNA分子發(fā)動(dòng)的，該分子可以被Dicerenzyme加工成長度為21-23個(gè)核苷酸的RNA。RNAseIII蛋白被認(rèn)為是作為一個(gè)二聚體發(fā)揮作用，它對(duì)雙鏈RN

16、A的兩個(gè)鏈都進(jìn)行切割，酶切的產(chǎn)物3末端互相重疊。然后這種小的干擾RNA分子（smallinterferingRNAs，siRNAs）摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC），引導(dǎo)核酸酶降解靶RNA。這種保守的生化機(jī)制可用于研究多種模式生物的基因功能，但是它在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用受到阻礙，因?yàn)殚L的雙鏈RNA分子會(huì)引起干擾素應(yīng)答。因此Tuschi及其同事表明長度為21nt的siRNA可以特異性的抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)是一個(gè)革命性的突破。這個(gè)發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大量利用RNAi技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究，因?yàn)榕c傳統(tǒng)的反義技術(shù)比，RNAi的性能明顯較高。有趣

17、的是，除了短雙鏈RNA，短發(fā)夾RNA（shorthairpinRNA，shRNA），比如莖環(huán)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過加工后也可以變成siRNA，從而產(chǎn)生RNA干擾。這使得構(gòu)建表達(dá)干擾RNA的載體，從而使哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)長期沉默成為可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，在正常情況下，該啟動(dòng)子是控制小核RNA（smallnuclearRNA，snRNA）U6（6、7、9、10）或者RNaseP的組分H1RNA（11）轉(zhuǎn)錄的。另外一種辦法是兩段短RNA分子分別用U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出來（6、12、13）。載體介導(dǎo)的siRNA表達(dá)使對(duì)功能缺失（loss-of-function）表型進(jìn)行長期分析

18、成為可能。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)，兩個(gè)月后仍可觀察到沉默現(xiàn)象。另外一種延長siRNA抑制基因表達(dá)時(shí)間的方法是對(duì)化學(xué)合成的RNA進(jìn)行核苷酸修飾。盡管未經(jīng)修飾的短雙鏈RNA在細(xì)胞培養(yǎng)物或者體內(nèi)的穩(wěn)定性出乎意料的高，然而有些情況下，需要對(duì)siRNA的穩(wěn)定性進(jìn)行進(jìn)一步提高。因此，可以在兩條鏈的末端都引入經(jīng)過修飾的核苷。一個(gè)5端為兩個(gè)2-O-甲基RNA、3端為4個(gè)甲基化核苷的siRNA與序列相同但是未經(jīng)修飾的siRNA比活性相同，但是在細(xì)胞培養(yǎng)物中引起的基因沉默現(xiàn)象的時(shí)間延長。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入體積較大的烯丙基將導(dǎo)致siRNA活性下降。RNA干擾在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的第一個(gè)研究是

19、利用快速注射大量生理溶液的方法將一個(gè)編碼shRNA的質(zhì)粒注入老鼠的尾靜脈。在大多數(shù)器官中，報(bào)道基因（編碼于共轉(zhuǎn)染質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)基因小鼠上）的表達(dá)可以被有效地抑制。另外，F(xiàn)as基因被作為肝損傷治療相關(guān)的內(nèi)源靶標(biāo)進(jìn)行了RNA干擾實(shí)驗(yàn)。注射siRNA之后，小鼠肝細(xì)胞中的FasmRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保護(hù)小鼠免遭由注射競(jìng)爭性Fas特異抗體引起的爆發(fā)性肝炎，82%用siRNA處理的小鼠活過了10天觀察期，而所有的對(duì)照小鼠在3天之內(nèi)死亡。上述研究中采用的高壓導(dǎo)入技術(shù)是一種粗暴的方法，不適于治療用。因此，標(biāo)準(zhǔn)的基因治療所采用的方法被用于RNA干擾。一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒載體被用于導(dǎo)入siRN

20、A，以抑制人類胰腺腫瘤細(xì)胞中的癌基因K-ras等位基因。負(fù)調(diào)控癌細(xì)胞中K-ras基因的表達(dá)使得它們?cè)谧⑷霟o胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成腫瘤的能力。這項(xiàng)研究還表明siRNA的高度特異性，因?yàn)橹挥邪┗騅-ras被沉默，而與之只有1個(gè)堿基對(duì)差異的野生型等位基因并沒有被沉默。另外，當(dāng)在紋狀區(qū)注射表達(dá)siRNA的腺病毒之后，轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中GFP基因的表達(dá)可以被抑制。葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通過在小鼠尾靜脈注射重組腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV啟動(dòng)子和最小的polyA尾的RNA聚合酶II表達(dá)元件被用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，為設(shè)計(jì)組織特異性或者可誘導(dǎo)的siRNA載體打開了大門。

21、總的來說，siRNA的第一個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行，其他有重要意義的基因有望于很快作為靶標(biāo)開展研究。至今為止的研究沒有觀察到任何應(yīng)用siRNA引起的毒性作用，但是在治療人類疾病的臨床試驗(yàn)開始之前仍需小心，以排除長期使用RNA干擾引起的嚴(yán)重副作用。因?yàn)橛胹iRNA使基因表達(dá)沉默與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相似，研究者將從十多年來反義技術(shù)研究的教訓(xùn)中獲益，比如需要使用合適的對(duì)照以證明基因表達(dá)的敲除是特異性的，以及對(duì)免疫系統(tǒng)可能引起的意外影響進(jìn)行詳細(xì)分析。miRNA技術(shù)miRNAs定義miRNAmicroRNAs（miRNAs）是一種小的，類似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，miRNA通過和靶基因mRN

22、A堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在植物、動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，miRNAs組織特異性和時(shí)序性，決定組織和細(xì)胞的功能特異性，表明miRNAs在細(xì)胞生長和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。miRNA原理miRNA基因通常是在核內(nèi)由RNA聚合酶II(polII)轉(zhuǎn)錄的，最初產(chǎn)物為大的具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子Pasha的作用下被處理成70個(gè)核苷酸組成的pre-miRNA。RANGTP和export

23、in5將pre-miRNA輸送到細(xì)胞質(zhì)中。隨后，另一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切產(chǎn)生約為22個(gè)核苷酸長度的miRNA:miRNA雙鏈。這種雙鏈很快被引導(dǎo)進(jìn)入沉默復(fù)合體(RISC)復(fù)合體中，其中一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復(fù)合體中。成熟的miRNA結(jié)合到與其互補(bǔ)的mRNA的位點(diǎn)通過堿基配對(duì)調(diào)控基因表達(dá)。與靶mRNA不完全互補(bǔ)的miRNA在蛋白質(zhì)翻譯水平上抑制其表達(dá)（哺乳動(dòng)物中比較普遍）。然而，最近也有證據(jù)表明，這些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性。使用這種機(jī)制的miRNA結(jié)合位點(diǎn)通常在mRNA的3端非翻譯區(qū)。如果miRNA與靶位點(diǎn)完全互補(bǔ)（或者幾乎完全互補(bǔ)），那么這些miRNA的結(jié)合往往引起靶mRNA的降解(在植物中比較常見)。通過這種機(jī)制作用的miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過一個(gè)miRNA來調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過幾個(gè)miRNAs的組合來精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。miRNAs研究目前只有一小部分miRNAs生物學(xué)功能得到闡明。這些miRNA