腫瘤個體化治療基因檢測教程ppt課件(PPT 67頁)

1、腫瘤個體化治療基因檢測教程第1頁，共67頁。教程目錄第一章 病理常規(guī)操作第二章 樣本前處理（申請單填寫、標(biāo)本類型、標(biāo)本評估及登記等）第三章 樣本預(yù)處理（DNA、RNA提取及質(zhì)量評估）第四章 基因操作（測序、片段分析及Q-PCR）第五章 結(jié)果解讀及診斷報(bào)告出具第六章 資料匯總，資料庫建立第2頁，共67頁。第一章 病理常規(guī)操作1. 病理樣本的接收2. 組織固定3. 取材4. 包埋5. 組織石蠟切片6. HE染色第3頁，共67頁。1. 病理樣本的接收1首先核對病理申請單與標(biāo)本上的紅色號碼是否一致。2核查病理申請單上寫明的送檢標(biāo)本及數(shù)目是否與實(shí)際送檢標(biāo)本一致。3觀察送檢標(biāo)本的大小及固定液比例是否合適。

2、(1)穿刺活檢及纖支鏡所取的小標(biāo)本，4中性甲醛(10中性福爾馬林)固定組織的量應(yīng)在610倍。(2)對于較大的手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)及時切開固定；核對后將病理申請單和標(biāo)本編上病理標(biāo)本號。4將病人姓名、性別、年齡、病歷號、科別、臨床診斷、部位、標(biāo)本來源、標(biāo)本例數(shù)等逐項(xiàng)錄入電腦存儲。5作為病理資料不僅要做好計(jì)算機(jī)錄入工作，還須進(jìn)行文字登記，以便病理檔案長期保存。第4頁，共67頁。2. 組織固定臨床醫(yī)師切取標(biāo)本后，應(yīng)盡快將標(biāo)本置于盛有足夠量固定液的容器內(nèi)，盡量避免可能出現(xiàn)固定不及時或不充分導(dǎo)致標(biāo)本干涸或腐敗，無法進(jìn)行切片制作。添加的量應(yīng)610倍于標(biāo)本體積.第5頁，共67頁。3. 取材及其后期處理病理科病理醫(yī)

3、生取材核對標(biāo)本及其標(biāo)志與申請單是否一致。按照病理取材規(guī)范選取病變及正常組織。對送檢標(biāo)本進(jìn)行大體描述。取材后的標(biāo)本保存至少兩周。放入自動脫水機(jī)進(jìn)行水洗脫水透明浸蠟前處理。第6頁，共67頁。4.包埋先將熔化的石蠟傾入模具，再用加熱的鑷子夾取已經(jīng)浸蠟的組織塊，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蠟。注意標(biāo)本的編號和標(biāo)本要對準(zhǔn)，防止污染。為下一步切片準(zhǔn)備，提供介質(zhì)。第7頁，共67頁。5.切片刀片鋒利，組織塊預(yù)冷。切5-10um的連續(xù)組織切片，置于玻片上。撈片，烘干。第8頁，共67頁。6.HE染色蘇木素伊紅染色。蘇木素染細(xì)胞核（核酸），伊紅染細(xì)胞質(zhì)（蛋白），使組織細(xì)胞對比清晰，便于顯微鏡下觀察。主要流程

4、：二甲苯脫蠟梯度酒精脫二甲苯蘇木素染色分化、返藍(lán)伊紅梯度酒精、二甲苯封片。臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊 2004年第1版第9頁，共67頁。第二章 標(biāo)本前處理一、申請單填寫1、登記患者基本情況，包括姓名、性別、年齡、送檢單位、床位、門診號/住院號、送檢日期、取材部位、病理診斷、標(biāo)本病理號等2、患者簽署知情同意書，留下聯(lián)系方式3、患者病史及臨床情況第10頁，共67頁?；颊卟∈芳芭R床情況登記事項(xiàng)有無手術(shù)（穿刺標(biāo)本）手術(shù)時間 術(shù)前術(shù)后有無化療，化療方案及化療效果及毒副作用（相關(guān)血項(xiàng)指標(biāo)、胃腸反應(yīng)、皮膚反應(yīng)、神經(jīng)反應(yīng)等），治療的單位。癌癥有無轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)或者不能切除相關(guān)病史及家族史第11頁，共67頁。第12

5、頁，共67頁。第13頁，共67頁。送檢標(biāo)本種類：外周全血；胸腹水；痰；尿新鮮(冰凍)標(biāo)本；內(nèi)鏡活檢標(biāo)本；手術(shù)標(biāo)本蠟塊或切片新鮮標(biāo)本用10%中性福爾馬林固定或用RNAlater浸泡20分鐘以上（常溫可保存10天）外借病理蠟塊，常規(guī)病理大小即可常規(guī)石蠟切片（10張白片），5-10um，常溫送檢送檢標(biāo)本要求：第14頁，共67頁。樣本評估血：保存溫度、時間，是否凝固胸腹水、尿及痰：涂片HE染色觀察結(jié)果是否有癌細(xì)胞蠟塊或白片：組織保存時間、福爾馬林固定時間、組織大小、有無癌細(xì)胞第15頁，共67頁。將申請單登記入冊登記基因檢測申請?zhí)?、姓名、送檢單位、病理號、檢測項(xiàng)目第16頁，共67頁。腫瘤個體化治療基因檢

6、測項(xiàng)目檢測項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測內(nèi)容樣本類型EGFR突變外顯子18, 19, 21, (CA)n非小細(xì)胞肺癌、食道癌、頭頸腫瘤等預(yù)測吉非替尼（易瑞沙）、厄羅替尼（特羅凱）石蠟白片或胸水300mL外顯子20(T790M)K-ras突變密碼子12,13,61腸癌、肺癌、胃癌、甲狀腺癌預(yù)測西妥昔單抗（愛比妥）、帕尼單抗（維克替比）療效，甲狀腺癌輔助診斷石蠟白片BRAF突變V600EC-kit突變外顯子9,11,17胃腸間質(zhì)瘤、肉瘤預(yù)測伊馬替尼（格列衛(wèi)）療效石蠟白片PDGF突變外顯子14、18第17頁，共67頁。腫瘤個體化治療基因檢測項(xiàng)目檢測項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測內(nèi)容樣本類型JAK-2 突變外顯子 12，14真性

7、紅細(xì)胞增多癥，原發(fā)性骨髓纖維化、原發(fā)性血小板增多癥輔助臨床診斷2mL抗凝血或骨髓活檢預(yù)測化療和干擾素療效ABL突變酪氨酸激酶區(qū)點(diǎn)突變髓細(xì)胞白血病預(yù)測伊馬替尼（格列衛(wèi)）療效2mL抗凝血或骨髓活檢Her-2/CEP17FISH乳腺癌、胃癌乳頭狀癌診斷石蠟白片預(yù)測曲妥珠單抗（赫賽汀）療效VEGF/-actinVEGFR/-actinmRNA表達(dá)量腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、腎癌預(yù)測貝伐單抗（阿瓦斯?。┋熜灠灼?2mL抗凝血第18頁，共67頁。腫瘤個體化治療基因檢測項(xiàng)目檢測項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測內(nèi)容樣本類型ERCC1/-actinmRNA表達(dá)量肺癌、胃癌、腸癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌、膽囊癌預(yù)測鉑

8、類療效石蠟白片+2mL抗凝血預(yù)測鉑類療效BRCA1 /-actinmRNA表達(dá)量紫杉醇類和長春堿類藥物療效RRM1/-actinmRNA表達(dá)量肺癌、胰腺癌、膽管癌預(yù)測吉西他濱療效石蠟白片+2mL抗凝血TS/-actinmRNA表達(dá)量胃癌、腸癌、肺癌、乳腺癌、預(yù)測氟尿嘧啶類藥物療效石蠟白片+2mL抗凝血肺癌預(yù)測培美曲塞療效第19頁，共67頁。腫瘤個體化治療基因檢測項(xiàng)目檢測項(xiàng)目涉及腫瘤預(yù)測內(nèi)容樣本類型TOP-A/CEP17FISH/mRNA表達(dá)量乳腺癌預(yù)測蒽環(huán)類藥物療效石蠟白片+2mL抗凝血預(yù)測蒽環(huán)類藥物毒性UGT1A1啟動子區(qū)多態(tài)性腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌預(yù)測伊立替康毒性第20頁，共67頁。第2

9、1頁，共67頁。石蠟白片前處理1.烤片（90-95，0.5小時）2.脫蠟（過夜，最后一缸換新二甲苯）3.HE染色4.鏡下區(qū)分選擇腫瘤組織4.刮片5.消化腫瘤組織（200lTL+20lOB酶，552-3h消化時間視具體情況定）第三章 基因檢測前處理第22頁，共67頁。HE染色結(jié)果第23頁，共67頁。第24頁，共67頁。DNA的提取1.血DNA的提取2.石蠟組織DNA的提取第25頁，共67頁。血液DNA提取250l抗凝血加入250l Buffer BL和25l OB酶，70孵育15分鐘。加入260l無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉(zhuǎn)入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。將收集柱置一新收集管上，加

10、入500l HB solution，12000rpm離心2分鐘。加入700l wash Buffer，12000rpm離心2分鐘?？账﹄x心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50l 70預(yù)熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質(zhì)量（或用分光光度計(jì)定量并記錄）。Omega Blood DNA kit protocol第26頁，共67頁。石蠟DNA提取在消化充分的組織中加入220l BUffer BL，震蕩混合，于70孵育。加入220l無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉(zhuǎn)入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。將收

11、集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm離心2分鐘。加入700l wash Buffer，12000rpm離心2分鐘?？账﹄x心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50l70預(yù)熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質(zhì)量（或用分光光度計(jì)定量并記錄）。Omega Tissuse DNA kit protocol第27頁，共67頁。電泳圖第28頁，共67頁。RNA的提取1.石蠟組織RNA的提取2.血RNA的提取 （化療后需1200微升血白細(xì)胞太少）第29頁，共67頁。1.石蠟組織RN

12、A的提取RNAlater樣本處理另注加入250lbufferPKD和10l的蛋白酶K,渦旋混勻后，55C孵育2-3h，80C15min。然后加入500l的bufferRBC，充分混勻。將溶液轉(zhuǎn)入gDNA Eliminator spin柱內(nèi)，10000g離心30s，吸取收集管內(nèi)液體至新的離心管，重復(fù)操作直至溶液都過濾收集柱。在溶液內(nèi)加入1200l無水乙醇，混勻，將溶液轉(zhuǎn)入RNeasy MinElute spin柱內(nèi)，10000g離心15s，棄收集管內(nèi)液體。加入500l buffer RPE，10000g離心15min，棄收集管內(nèi)液體。加入500l buffer RPE,10000g離心2min。

13、小心將柱取出，放入一新的收集管內(nèi)，最大速度離心5min（將柱蓋打開）將柱放入1.5ml收集管內(nèi)，加入40-60l無Rnase酶水，蓋上蓋子，室溫放置2min，最大速度離心1min洗脫RNA.Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol第30頁，共67頁。2.血RNA的提取300l全血+1500l 1 buffer ERL （150l 10 ERL+1350l H2O）混勻。同時做3管。冰上孵育10min，至半透明。450g 4，10min，棄上清。600l 1 buffer ERL混勻，洗滌細(xì)胞。洗滌后合并3管液體。450g 4，10min，棄上清。600l TRK裂

14、解液+12l -巰基乙醇吹打混勻（可以暫時-70凍存）。加等體積70%乙醇，吹打混勻。將液體轉(zhuǎn)入HiBind RNA提取柱內(nèi)（ 2.1: 核酸降解 1.6: 蛋白質(zhì)污染第32頁，共67頁。第四章 基因操作DNA提取測序反應(yīng)上機(jī)測序及結(jié)果分析PCR擴(kuò)增電泳檢驗(yàn)電泳檢驗(yàn)，PCR產(chǎn)物純化測序產(chǎn)物純化第33頁，共67頁。PCR擴(kuò)增（以K-ras為例）反應(yīng)體系為：10buffer dNTP(2mM) Mg2+TaqGenome DNAPrimer-F（10M）Primer-R（10M）H2O 2l 2l0.75l0.25l1l0.4l0.4l13.2lTotal 20l第34頁，共67頁。 PCR反應(yīng)條

15、件： 置PCR擴(kuò)增儀中95預(yù)變性15min，用TouchdownPCR，94變性50秒，63-58退火1分鐘，72延伸1分鐘，共循環(huán)10次，94變性50秒，57退火1分鐘，72延伸1分鐘，共循環(huán)30次，最后于72延伸10分鐘。第35頁，共67頁。電泳圖用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否為單一目的條帶。第36頁，共67頁。PCR產(chǎn)物純化1.加100lPCR-A液，混勻，轉(zhuǎn)入純化柱內(nèi)，室溫靜置10min，12000rpm離心2min。2.棄收集管內(nèi)液體，加700lwashing buffer，12000rpm離心2min。3.棄收集管內(nèi)液體，加400lwashing buffer，12

16、000rpm離心2min。4.棄收集管內(nèi)液體，12000rpm離心2min。5.柱內(nèi)加30l70C預(yù)熱洗脫液，12000rpm離心2min。第37頁，共67頁。測序反應(yīng)（以K-ras為例）反應(yīng)體系為：BigDye（2.5X） 0.8l BigDyeSeqBuffer （5X） 1.6 l Primer 0.3lPCR純化產(chǎn)物 1lddH2O 6.3lTotal 10l第38頁，共67頁。測序產(chǎn)物純化1.每管加1lEDTA（125mM）;1lNaAc（3M）到管里。2.每管加100l100%酒精，震蕩混勻，室溫靜置15min。3.10C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心

17、1min。4.每管加100l70%酒精，5C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min。5.37C;30min揮發(fā)凈酒精，加10l Hi-Di溶解DNA。6.95C；變性5min，4C；4min，加樣上機(jī)。第39頁，共67頁。片段分析操作PCR擴(kuò)增加LIZ、HIDI混合變性上機(jī)測序及結(jié)果分析避光第40頁，共67頁。步驟1多重?zé)晒釶CR：15lPCRmix五種（胃腸）或七種（尿）引物0.8l（其中D17S283加1.2l）1lDNA.條件：95 C15min，94 C1min，56 C1min，72 C1min，30個cycle.lPCR產(chǎn)物0.4lLIZ size s

18、tandard+8l HiDi,95 C 5min, 4C冰冷5min。上機(jī)，分析數(shù)據(jù)。第41頁，共67頁。Q-PCR操作RNA提取Q-PCR儀擴(kuò)增結(jié)果分析RT分光光度計(jì)評估質(zhì)量第42頁，共67頁。詳細(xì)步驟1.RT反應(yīng):gDNA1l+RNA 6l；上機(jī)42C，2min；離心。RT Buffer 2l，RT酶0.5l，Primer 0.5l；上機(jī)A64程序。2.Q-PCR儀擴(kuò)增 （反應(yīng)體系）2SYBR 2.5l Primer 1(5uM) 0.5lPrimer 2(5uM) 0.5lRT產(chǎn)物 1 lNuclease-free water 1l Total 5l第43頁，共67頁。7900PCR儀

19、反應(yīng)程序95C 10min；95C 15s；60C 1min，40cycle。RQ Manager 1.2軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。第44頁，共67頁。第五章 結(jié)果解讀及診斷報(bào)告出具基因測序結(jié)果分析RNA表達(dá)量結(jié)果分析第45頁，共67頁。測序結(jié)果圖及分析ABI3100測序儀測序，SeqScape v2.0分析結(jié)果為。以K-ras和EGFR為例第46頁，共67頁。K-RAS 基因測序突變類型K-ras :K2第12（GGT),13密碼子（GGC） K3第61（CAA）密碼子共9種突變類型：GGT-GAT G12DGGT-GTT G12VGGC-GAC G13DGGT-TGT G12CGGT-GCT G12AGGT-AGT G12SGGT-CGT G12RGGC-TGC G13CGGC-GCC G13AGGC-GTC G13V7