反相柱使用注意事項(xiàng)

1、反相柱使用注意事項(xiàng)液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相 色譜法（RPC）。正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相 為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、 四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng) 的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。反相色譜法 一般用非極性固定相（如c18、C8）；流動相為水或緩沖液， 常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留 時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最 為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它

2、占整個HPLC應(yīng)用的80%左右。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些 無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制 流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5 （28）， 太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品 柱可在pH 1.510范圍操作。正相色譜法與反相色譜法比較表正相色譜法反相色譜法固定相極性高中中低流動相極性低中中高組分洗脫次序極性小先洗出極性大先洗出從上表可看出，當(dāng)極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線 （如氨基鍵合固定相）。1.泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)為

3、了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行 操作：防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會磨損柱塞、 密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好 在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2pm或0.45pm） 等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)， 尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由 于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)品體，這些晶體 將和上述固體

4、微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗 后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相， 可以是甲醇或甲醇一水）。泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱 塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形， 產(chǎn)生漏液。流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大 量氣泡，泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障：沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打 開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將

5、氣泡排盡，也可用一個50ml 針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物， 可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微 細(xì)品?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡， 或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立 即清洗。壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能 是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進(jìn)行。2 .與檢測器有關(guān)的故障及其排除1）流動池內(nèi)有氣泡如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大，如果氣

6、泡較大，則會在 基線上出現(xiàn)許多線狀“峰”，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對流動相進(jìn)行充分的 除氣，檢查整個色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停 留在流動池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好 不連接色譜柱）；或者啟動輸液泵的同時，用于指緊壓流動池出口，使池內(nèi)增壓， 然后放開?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動池破裂。2）流動池被污染無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當(dāng)溶 劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L 硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。3）光源燈

7、出現(xiàn)故障紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產(chǎn)生嚴(yán)重 噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時需要更換光 源燈。4）倒峰倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光 檢測器時，如果組分的折光指數(shù)低于流動相的折光指數(shù)，也會出現(xiàn)倒峰，這就需 要選擇合適的流動相。如果流動相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測器時， 無吸收的組分就會產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動相。在死時間附近 的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動相不同所引起 的。3.流動相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3pKa7）或弱堿（7pKa8）樣品

8、時，通 過調(diào)節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留， 并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對于弱酸，流動相的pH值越小，組 分的k值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在； 對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用 50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入 少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰 拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。4 .流動

9、相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器 中。因許多有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導(dǎo)致溶劑受污染。 這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴(yán)， 防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應(yīng)盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需 貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3天內(nèi)使用，用前應(yīng)重新濾過。容器應(yīng)定期清洗， 特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì)沉淀和可能生長的微 生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。5.HPLC用水HPLC應(yīng)用中要求超純水，如檢測器基線的

10、校正和反相柱的洗脫。進(jìn)行HPLC、GC、電泳和熒光分析，或在涉及組織培養(yǎng)時，沒有有機(jī)物污 染是非常重要的。測高錳酸鉀顏色保留時間的定性方法反應(yīng)慢，對很低水平的有 機(jī)物（對HPLC可能還是太高了）不夠靈敏，特別是不能定量?？傆袡C(jī)碳（TOC） 分析儀（把有機(jī)物氧化成CO2，測游離的CO2）常用于I類（NCCLS）水中低濃 度有機(jī)物的測定。6 .儀器的使用：流動相濾過后，注意觀察有無肉眼能看到的微粒、纖維。有請重新濾過。柱在線時，增加流速應(yīng)以0.1ml/min的增量逐步進(jìn)行，一般不超過1ml/min， 反之亦然。否則會使柱床下塌，叉峰。柱不線時，要加快流速也需以每次0.5ml/min 的速率遞增上去

11、（或下來），勿急升（降），以免泵損壞。安裝柱時，請注意流向，接口處不要留有空隙。樣品液請注意濾過（注射液可不需濾過）后進(jìn)樣，注意樣品溶劑的揮發(fā)性。測定完畢請用水沖柱1小時，甲醇30分鐘。如果第二天仍使用，可用水 以低流速（0.10.3ml/min）沖洗過夜（注意水要夠量），不須沖洗甲醇。另外需 要特別注意的是：對于含碳量高、封尾充分的柱，應(yīng)先用含510%甲醇的水沖 洗，再用甲醇沖洗。沖水的同時請用水充分沖洗柱頭（如有自動清洗裝置系統(tǒng)，則應(yīng)更換水）。方法研究1.波長選擇：首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選 擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中 還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將 會很小。2.流動相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動相。參考資料：乙睛的毒性是甲醇的5倍