Lipo轉(zhuǎn)染知識(shí)分享

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Lipo轉(zhuǎn)染Invitrogen陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)2010-07-1016:16Invitrogen的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine2000Lipofectamine2000是最為人熟知的轉(zhuǎn)染產(chǎn)品之一。已知可為517種細(xì)胞（見下面連接地址）提供高轉(zhuǎn)染效率（表達(dá)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)）和活性（細(xì)胞抽提物中轉(zhuǎn)入基因的酶產(chǎn)物活性）。特點(diǎn)兩個(gè)關(guān)鍵性特點(diǎn)使得Lipofectamine2000試劑的轉(zhuǎn)染步驟快速簡(jiǎn)便：（1）DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的復(fù)合體可

2、以直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，有血清也不怕（2）轉(zhuǎn)染后不需要除去Lipofectamine2000試劑，無(wú)需換培養(yǎng)基操作流程事實(shí)上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡(jiǎn)單：稀釋DNA以及Lipofectamine2000，混合2種稀釋液保溫20分鐘，加入培養(yǎng)細(xì)胞中孵育2496小時(shí)檢測(cè)結(jié)果。下面是Invitrogen提供的詳細(xì)流程和注意事項(xiàng)。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細(xì)胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50l無(wú)血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEM培養(yǎng)基）稀釋0.8g-1.0gDNA。對(duì)于每孔細(xì)胞，使用50l

3、OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋1l-3lLIPOFECTAMINE2000試劑。Lipofectamine2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低活性。）注意：即使Lipofectamine2000使用OPTI-MEM稀釋，細(xì)胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為L(zhǎng)ipofectamine2000的稀釋液，必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合?；旌舷♂尩腄NA（第2步）和稀釋的Lipofectamine2000（第3步）。在室溫保溫20分鐘。注意：溶液可能會(huì)混濁，但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可以在室溫保持6小時(shí)穩(wěn)定。直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。

4、注意：如果在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換為0.5ml無(wú)血清培養(yǎng)基。在37，5的CO2中保溫24-48小時(shí)，無(wú)須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時(shí)后更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基也不會(huì)降低轉(zhuǎn)染活性。在細(xì)胞中加入復(fù)合物24-72小時(shí)后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測(cè)報(bào)告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動(dòng)子活性。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。對(duì)于96孔板培養(yǎng)，不再需要提前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，而可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將細(xì)胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了，這樣進(jìn)一步減少

5、了轉(zhuǎn)染時(shí)間。這種改進(jìn)步驟已經(jīng)過(guò)293-H，293-F，COS-7L和CHO細(xì)胞的試驗(yàn)，同傳統(tǒng)方法相比活性稍低?？旖莸牟襟E和蛋白表達(dá)細(xì)胞系的高效轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染，比如cDNA文庫(kù)的篩選和蛋白瞬時(shí)表達(dá)。適用細(xì)胞株范圍不同的轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株范圍各不相同。一個(gè)實(shí)驗(yàn)室常常會(huì)用到不止一種細(xì)胞株，甚至是比較特殊的細(xì)胞株。一個(gè)轉(zhuǎn)染試劑所適用的細(xì)胞株越多，當(dāng)然越受用戶的歡迎。根據(jù)Invotrogen網(wǎng)站的資料，Lipofectamine2000已經(jīng)證實(shí)可用于高達(dá)517種細(xì)胞株，覆蓋了相當(dāng)廣的范圍。要看看Lipofectamine2000是否適用于你現(xiàn)

6、有的細(xì)胞株，可以訪問以下Invitrogen網(wǎng)址（HYPERLINK/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines.dsp_searchRange/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines.dsp_searchRange）適用的核酸類型和DNA大小有的轉(zhuǎn)染試劑是為siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計(jì)的，有的則是為DNA轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)。Lipofectamine2000可以適用于包括DNA，siRNA,dsRNA,熒光標(biāo)記的Oligo,RNA等在內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)染，這使得Lipofectamine2000適用范圍非常廣泛，無(wú)論是基因

7、表達(dá)分析的DNA轉(zhuǎn)染，或者是RNAi，Lipofectamine2000都能勝任，這樣你就不需要為不同目的購(gòu)買不同試劑了。值得注意的是，最常用的DNA轉(zhuǎn)染中有一個(gè)DNA大小的問題，太大的質(zhì)粒不那么好轉(zhuǎn)。我們暫時(shí)還沒有找到Lipofectamine2000相應(yīng)的資料。用量和價(jià)格好東西往往不便宜。可是在實(shí)驗(yàn)室中，價(jià)格往往是最具有殺傷力的。Lipofectamine2000用的劑量大嗎？?jī)r(jià)格如何？根據(jù)說(shuō)明書，24孔板轉(zhuǎn)染每次用2ul左右，1.5mlLipofectamine2000大約可做750次24孔板轉(zhuǎn)染，或者大約150次6孔板轉(zhuǎn)染，而1.5mlLipofectamine2000當(dāng)前市場(chǎng)價(jià)格46

8、67元，0.75ml價(jià)格是2798元（可以磨到多少折扣就要看你的侃價(jià)功力了）。平均下來(lái)，再算上折扣，Lipofectamine2000性價(jià)比還是挺高的。注意事項(xiàng)Lipofectamine2000要求細(xì)胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響。Lipofectamine2000可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基，使得操作方便了許多，但是要注意制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要求用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。復(fù)合物形成后是可以加入血清。這里要特別注意檢測(cè)所用的無(wú)血清培養(yǎng)基是否能和Lipofectamine2000匹配，比如

9、已知CD293,SFMII,VP-SFM就不行。此外還應(yīng)該留意，如果你研究的基因要求比較長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間，比如細(xì)胞周期相關(guān)基因，或者時(shí)細(xì)胞表面蛋白，最好選擇細(xì)胞鋪板密較低的轉(zhuǎn)染試劑，不適合用Lipofectamine2000。對(duì)于大多數(shù)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例，通常推薦是1:2或者1:3，優(yōu)化可以從0.5-5之間慢慢試。使用小劑量確定的優(yōu)化條件可以用于進(jìn)行大劑量的轉(zhuǎn)染，只要根據(jù)培養(yǎng)板表面比例線性增加鋪板細(xì)胞的數(shù)目、陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑和DNA量就可以了。還有轉(zhuǎn)染的時(shí)候培養(yǎng)基中不能添加抗生素?？股?，比如青霉素和鏈霉素，一般對(duì)于真

10、核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前就不必潤(rùn)洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外，為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng)，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。陽(yáng)離子脂質(zhì)體應(yīng)該在4度保存，要注意避免多次反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間開蓋，因?yàn)榭赡軙?huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體氧化而影響轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)然還有要注意質(zhì)粒的質(zhì)量，質(zhì)粒的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，Invitrogen自然是大力推

11、薦自家的質(zhì)粒純化產(chǎn)品啦，這個(gè)嘛，看看生物通前面的質(zhì)粒純化專題有特別介紹就好啦。二、今年的新產(chǎn)品：Lipofectamine2000CD和Optifect作為一個(gè)新產(chǎn)品，Lipofectamine2000CD當(dāng)然應(yīng)該有區(qū)別于原來(lái)的Lipofectamine2000。這個(gè)1ml就要賣到5000多塊的新產(chǎn)品好在哪里？主要是由于不采用動(dòng)物來(lái)源的材料，可以滿足某些特殊要求，比如要求不含動(dòng)物來(lái)源材料等。其他優(yōu)缺點(diǎn)和Lipofectamine2000差不多。以24孔板計(jì)算，一次2ul,1ml足夠500次轉(zhuǎn)染，但價(jià)格不便宜，要5000多元。Optifect主要是為在較低鋪板密度條件下轉(zhuǎn)染而設(shè)計(jì)的，比如細(xì)胞增埴

12、相關(guān)基因和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)和研究往往要求較長(zhǎng)的表達(dá)周期，細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)和研究、還有部分高通量篩選等等也要求在較低鋪板密度條件下轉(zhuǎn)染，由于Lipofectamine2000要求轉(zhuǎn)染時(shí)9095匯片而不太適合，Optifect就是一個(gè)選擇。Optifect最佳的鋪板密度是30-70%，其他的操作和注意事項(xiàng)也和Lipofectamine2000相近。同樣可以直接加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)染前后都不需要更換血清，同樣不要加抗生素，等等。1ml價(jià)格是3616，用量相對(duì)高一些，24孔板一次需要34ul，6孔板就要用到1524ul/次，每次算下來(lái)就比前面的貴了。三、聞道有先后，術(shù)業(yè)有專攻，Invitrog

13、en的其他幾個(gè)當(dāng)家花旦LIPOFECTAMINEPLUS：是老版LIPOFECTAMINE的改良版。加入PLUS試劑后會(huì)導(dǎo)致在廣泛條件下的高活性，不需要進(jìn)行細(xì)節(jié)優(yōu)化就可以進(jìn)行高活性轉(zhuǎn)染了。實(shí)驗(yàn)步驟同樣很簡(jiǎn)單，細(xì)胞鋪板密度以轉(zhuǎn)染當(dāng)天匯合度至70%到90%為宜。DMRIE-C轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞效率最高，如Jurkat細(xì)胞以及其他淋巴細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系。也可以用來(lái)轉(zhuǎn)染搖瓶中使用CDCHO培養(yǎng)基培養(yǎng)的懸浮CHO細(xì)胞，易于放大。另外建議用DMRIE-C將RNA轉(zhuǎn)染入貼壁細(xì)胞。它比使用LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染RNA至BHK-21細(xì)胞的表達(dá)水平高。CELLFECTIN轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞的首選，特別是于昆蟲基因表達(dá)中生產(chǎn)桿

14、狀病毒的Sf9和Sf21細(xì)胞以及果蠅細(xì)胞。LIPOFECTIN已經(jīng)成功用于人類和非人類內(nèi)皮細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。除了質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染外，使用LIPOFECTIN也可以將RNA，寡聚核苷酸，酵母人工染色體和蛋白轉(zhuǎn)入多種細(xì)胞系。四、陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑的一些注意事項(xiàng)（Invitrogen提供）有血清時(shí)的轉(zhuǎn)染：血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，但只要在DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清，在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的。陽(yáng)離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用O

15、PTI-MEM培養(yǎng)基，一種營(yíng)養(yǎng)豐富的無(wú)血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE2000。培養(yǎng)基中的抗生素：抗生素，比如青霉素和鏈霉素，一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外，為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng)，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

16、細(xì)胞維護(hù)和培養(yǎng)的演變：可以通過(guò)常規(guī)的次培養(yǎng)步驟保持轉(zhuǎn)染鋪板前的細(xì)胞健康。每周傳代一到兩次，不要使細(xì)胞保持融合超過(guò)24小時(shí)。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率。融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。細(xì)胞鋪板密度：用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)

17、胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2106-4106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的，CAT活性也最高,試劑的量也相應(yīng)增加。這些結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的最佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。啟動(dòng)子的選擇：獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟

18、動(dòng)子，如SV40和RSV相比，在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細(xì)胞）中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時(shí)會(huì)提高，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。DNA量：高質(zhì)量的DNA對(duì)于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)：DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在14天內(nèi)檢測(cè)到。僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。

19、幾天內(nèi)，大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋；一周后就檢測(cè)不到其存在了。瞬時(shí)表達(dá)分析檢測(cè)非重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)。因此，表達(dá)水平與位置無(wú)關(guān)，不會(huì)受到周圍染色體元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大，實(shí)驗(yàn)必須很小心。為了進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)入的基因必須能和細(xì)胞同步復(fù)制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時(shí)就會(huì)如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，加入的DNA通過(guò)重組整合到基因組上。包含整合DNA的細(xì)胞很少，必須通過(guò)對(duì)藥物的抗性篩選進(jìn)行擴(kuò)增或通過(guò)表型變化進(jìn)行鑒定。穩(wěn)定基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)需要數(shù)周，如果需要驗(yàn)證蛋白產(chǎn)量，所需的時(shí)間更長(zhǎng)。但

20、得到的細(xì)胞系可以做為蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定來(lái)源或用于得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測(cè)：基因的瞬時(shí)表達(dá)在24-72小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時(shí)表達(dá)非常適用于驗(yàn)證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠?bào)告基因來(lái)確定優(yōu)化條件，其表達(dá)蛋白易檢測(cè)，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報(bào)告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤?jiǎn)單的非同位素方法檢測(cè)b-gal的表達(dá)以測(cè)定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV-SPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá)bgal。結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)步

21、驟，可以做為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選：連同帶有藥物抗性的篩選標(biāo)記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通過(guò)磷酸化使藥物失活，從而提供對(duì)GENETCIN選擇性抗生素（G418Sulfate）的抗性?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個(gè)質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個(gè)不同的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染，兩個(gè)質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對(duì)于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的改進(jìn)一般也會(huì)提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如，

22、使用LIPOFECTAMINEPLUS試劑得到的NIH3T3細(xì)胞GENETICIN抗生素抗性克隆的數(shù)目比單獨(dú)使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍。要進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)分析，在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細(xì)胞，低密度鋪板，給予生長(zhǎng)空間，在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN抗生素的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時(shí)，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN抗生素的培養(yǎng)基，抗生素的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN抗生素的最佳濃

23、度，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線，確定最佳濃度。篩選可能需要較長(zhǎng)時(shí)間，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN抗生素存在條件下，細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在維持培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的抗生素，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可以分別純化（克?。占M(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇：哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的，翻譯后修飾的蛋白，比細(xì)菌，真菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以快速表達(dá)，迅速地合成小量蛋白。常用的細(xì)胞系包括CHO，293和

24、COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F，293-H，COS-7和CHO-S細(xì)胞，來(lái)源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細(xì)胞系。這些細(xì)胞也可用于無(wú)血清和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞中進(jìn)行。這些細(xì)胞易于生長(zhǎng)到高密度并合成更多蛋白。使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)。用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。但更傾向于使用無(wú)血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白，因?yàn)檠宓鞍讜?huì)干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無(wú)血清培養(yǎng)基一般針對(duì)某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無(wú)血清培養(yǎng)基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養(yǎng)基低得多）。無(wú)蛋白培養(yǎng)基不含

25、蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇最適合您應(yīng)用的一種。在含血清時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基，無(wú)蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），對(duì)于已適應(yīng)無(wú)血清或無(wú)蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞，可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無(wú)血清培養(yǎng)基包含抑制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分。在這些情況下，有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEM等培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染FAQs：針對(duì)同種陽(yáng)離子脂質(zhì)體的疑難解答Q1:轉(zhuǎn)染效率低A1:1)沒有使用優(yōu)化的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。解決建議:選擇針對(duì)您的細(xì)胞類

26、型轉(zhuǎn)染效率可能最高的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。參見附錄A或網(wǎng)站（HYPERLINK/）上“TransfectionCollection”中的參考文獻(xiàn)列表。2)沒有使用優(yōu)化條件。解決建議:優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。參見第7章優(yōu)化步驟。參見網(wǎng)站（HYPERLINK/在Tech-online分子生物學(xué)部分）上的細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)染步驟。3)DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。解決建議:在復(fù)合體形成時(shí)不要使用血清。OPTI-MEMI培養(yǎng)基和DMEM是用于復(fù)合體形成的較好的培養(yǎng)基。如果使用含有血清的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染，保證在無(wú)血清條件形成復(fù)合物。注意：不要將OPTI-MEMI培養(yǎng)基用于LIPOF

27、ECTAMINEPLUS試劑或昆蟲細(xì)胞。對(duì)于Sf9和Sf21細(xì)胞，Sf-900SFM會(huì)得到最佳結(jié)果。4)存在抑制劑。解決建議:不要在用于制備DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。5)不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度。解決建議:細(xì)胞密度應(yīng)該在轉(zhuǎn)染時(shí)融合度為70%-90%。6)轉(zhuǎn)染DNA的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子沒有被宿主細(xì)胞識(shí)別。解決建議:確保轉(zhuǎn)染DNA的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子同目的細(xì)胞類型兼容。7)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)。解決建議:不要使用凍結(jié)的或儲(chǔ)存溫度低于4的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑。8)轉(zhuǎn)染分析的問題。解決建議:轉(zhuǎn)染分析中加入陽(yáng)性對(duì)

28、照。9)質(zhì)粒純化的問題。解決建議:請(qǐng)核對(duì)是否使用轉(zhuǎn)染級(jí)的質(zhì)粒純化試劑盒。通常轉(zhuǎn)染級(jí)的質(zhì)粒純化試劑盒使用DEAE樹脂而非硅樹脂，并且最好是用重力流動(dòng)（過(guò)濾）的方法而不是離心技術(shù)，因?yàn)闃渲瑤?lái)的污染會(huì)導(dǎo)致較高的內(nèi)毒素。另一種方法（可用于任何級(jí)別的純化試劑盒），是在最后一步從樹脂柱上洗脫質(zhì)粒后，將溶液置于55的水浴上保溫5分鐘。最后小心地從上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。這是減少樹脂的交叉污染的方法。Q2:細(xì)胞死亡率高。A2:1)DNA量太高。解決建議:作一個(gè)劑量-反應(yīng)曲線以確定最佳的DNA量。在劑量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，因?yàn)閱为?dú)DNA也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)基礎(chǔ)的影響。參見第7

29、章微調(diào)優(yōu)化方法。2)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑量太高。解決建議:作一個(gè)劑量-反應(yīng)曲線以確定最佳的陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的量。在劑量-反應(yīng)轉(zhuǎn)染中加入DNA，因?yàn)閱为?dú)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑也只對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一個(gè)基礎(chǔ)的影響。參見第7章微調(diào)優(yōu)化方法。3)在轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用抗菌素。解決建議:在轉(zhuǎn)染過(guò)程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因?yàn)殛?yáng)離子脂質(zhì)體試劑使細(xì)胞更敏感。4)細(xì)胞太少。解決建議:作一個(gè)劑量-反應(yīng)曲線以確定每個(gè)轉(zhuǎn)染過(guò)程中最佳的細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)您的應(yīng)用所要求的效率調(diào)整細(xì)胞數(shù)量。5)在無(wú)血清條件下細(xì)胞活性降低。解決建議:使用OPTI-MEM培養(yǎng)基。降低或省去在無(wú)血清培養(yǎng)基中清洗的次數(shù)。在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用5%到10%的血清。確保在不存在血清的條件下形成復(fù)合物。6)陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑氧化了。解決建議:不要過(guò)分?jǐn)噭?dòng)或振蕩陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑；這可能會(huì)形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的過(guò)氧化物。7)對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，篩選抗生素加入的太快。解決建議:在加入篩選性抗生素前至少預(yù)留48小時(shí)使細(xì)胞表達(dá)抗性基因。Q3:陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑-DNA復(fù)合物沉淀。注意：在顯微靜下可以在細(xì)胞上觀察到