分子標(biāo)記ppt課件-PPT課件

1、園藝植物的分子標(biāo)記 1 概述 2 常用分子標(biāo)記技術(shù)原理及操作 3 分子標(biāo)記在園藝植物中的應(yīng)用1 概述 1.1 基本概念世間萬物遺傳多樣性（遺傳變異） 遺傳多樣性（遺傳變異）：遺傳信息的總和，種內(nèi)不同群體之間或者一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異的總和。 遺傳標(biāo)記：是指可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或者某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。是表示遺傳多樣性的有效手段，可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。它具有兩個(gè)基本特征，即可遺傳性和可識(shí)別性。 性狀標(biāo)記（morphological marker） 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological marker） 生化標(biāo)記（biochemical marker） 分

2、子標(biāo)記( molecular marker ) 形態(tài)標(biāo)記（morphological marker） 是指那些能夠明確顯示遺傳多樣性的外部形態(tài)特征。特點(diǎn)：1. 簡單直觀、經(jīng)濟(jì)方便 2. 數(shù)量少 3. 易受環(huán)境影響 4. 一些標(biāo)記與不良性狀連鎖 5. 周期長細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological marker） 細(xì)胞有絲分裂的中期和早后期染色體的核型和染色體顯帶技術(shù)。特點(diǎn)：1. 不受環(huán)境影響 2. 能進(jìn)行一些重要基因的染色體區(qū)域定位 3. 材料來源難 生化標(biāo)記（biochemical marker） 主要包括同工酶、等位酶和貯藏蛋白標(biāo)記，是指利用植物代謝過程中的具有特殊意義的生化成分或產(chǎn)物進(jìn)行遺傳多

3、樣性標(biāo)記的技術(shù)。特點(diǎn)：1. 表現(xiàn)近中性，對植物經(jīng)濟(jì)性狀一般沒有大的不良影響； 2. 直接反映基因產(chǎn)物的差異，受環(huán)境影響??； 3. 有些生化大分子分離困難遺傳標(biāo)記 （Genetic marker） 性狀標(biāo)記（morphological marker） 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological marker） 生化標(biāo)記（biochemical marker） 分子標(biāo)記( molecular marker ) 多態(tài)性少標(biāo)記數(shù)量有限以 基因表達(dá)結(jié)果（表現(xiàn)型）為基礎(chǔ)，是對基因的間接反映 DNA分子標(biāo)記有其獨(dú)特的優(yōu)勢: (1) 直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測到，不受季節(jié)、環(huán)境限

4、制，不存在表達(dá)與否等問題； (2) 自然界存在許多等位變異，無需人為創(chuàng)造，多態(tài)性高 ； (3) 遍布整個(gè)基因組，可檢測的基因座位是無限的。 以DNA堿基序列變異為基礎(chǔ)，是DNA水平遺傳變異的直接反映分子標(biāo)記 廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的、可檢測的、與生物的表性性狀連鎖的DNA序列或蛋白質(zhì)。 狹義的分子標(biāo)記只是指DNA標(biāo)記。1.2 DNA分子標(biāo)記的發(fā)展歷史及類型 第一類分子標(biāo)記：以Southern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù) RFLP（1974）第二類分子標(biāo)記：以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù) SSR（1982）、RAPD（1990）、AP-PCR（1990）、AFLP （1993）、 ISSR （199

5、4）、 SAGE （2019）第三類分子標(biāo)記：以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù) SNP（2019）、SRAP（2019）、TRAP（2019）基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴(kuò)增1.3 DNA分子標(biāo)記產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)PCR技術(shù)： polymerase chain reaction 限制性內(nèi)切酶：restriction endonuclease 電泳：帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動(dòng)。 核酸電泳：核酸分子由于帶負(fù)電荷，在電場中向陽極定向運(yùn)動(dòng)。根據(jù)核酸電泳的介質(zhì)可以分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳。同一種核酸分子由于大小、電荷數(shù)相同，在電場電勢和介質(zhì)阻力固定的情況下，應(yīng)

6、當(dāng)具有相同的遷移速率，而不同大小的核酸分子遷移率不同，從而加以分離。三種情況： 1. DNA 序列酶切位點(diǎn)（或PCR引物結(jié)合位點(diǎn)）處的堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)（或者PCR引物結(jié)合位點(diǎn)）消失、酶切產(chǎn)物（或者擴(kuò)增產(chǎn)物）減少。WMWM MW酶切產(chǎn)物電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳2Kb3Kb3Kb2Kb 2. DNA 序列酶切位點(diǎn)（或PCR引物結(jié)合位點(diǎn)）之間缺失（或插入）了一段核苷酸序列，或者是酶切位點(diǎn)（或者PCR引物結(jié)合位點(diǎn)）之間的串聯(lián)重復(fù)單元數(shù)目發(fā)生了改變，導(dǎo)致酶切產(chǎn)物（或者擴(kuò)增產(chǎn)物）片段長度發(fā)生了改變。WWWWWWMMM1M2MMM1M24Kb1Kb5Kb5Kb4Kb5Kb4Kb1Kb5Kb4Kb4K

7、b5Kb3Kb5Kb4Kb3Kb3. 單核苷酸突變，即DNA序列發(fā)生了單堿基轉(zhuǎn)換（A與T或C與G）或顛換（A、T與C、G）ATCGAATGCGCATCGATTGCCCATCGAATGCACACCGAATGCGCWWMM2 常用分子標(biāo)記方法2.1 限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) RFLP標(biāo)記是用限制性內(nèi)切酶酶解具有相對性狀的兩個(gè)群體的DNA，然后通過電泳和Southern雜交技術(shù)在酶切后形成的DNA片段中發(fā)現(xiàn)這種不同。這種不同就是目的性狀的RFLP標(biāo)記。特點(diǎn)：1. 遍布，無限2. 不受外界環(huán)境、發(fā)育階段、器官

8、等影響3. 探針多4. DNA需求量大，純度高5. 技術(shù)要求高，成本大 RFLP的基本步驟： 1、DNA的提取 堿法、CTAB、SDS 2、用限制性內(nèi)切酶酶切DNAEcoR 5gDNA 10U 終體積30-40l3、 核酸電泳4. 核酸雜交 核酸分子雜交是指非同一分子來源但具有互補(bǔ)序列（或是某一區(qū)段互補(bǔ)）的兩條多核苷酸鏈，通過堿基互補(bǔ)配對原則形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過程。若其中的一條鏈被認(rèn)為標(biāo)記上，該標(biāo)記可以通過某種特定方法檢出，即成為所謂的探針。探針是指經(jīng)特殊化合物標(biāo)記的、特定的、已知的核苷酸序列。探針與其互補(bǔ)的核苷酸序列雜交后，雜交體也就帶上了同樣標(biāo)記，可被檢測出來。這樣，我們以特定的已知核苷

9、酸序列為探針就可以在諸多的核苷酸序列中找到所需核苷酸。核酸雜交包括Southern雜交、Northern雜交。 蛋白質(zhì)分子雜交是利用抗原與抗體特異結(jié)合的原理來進(jìn)行檢測的，稱為Western雜交。探針的標(biāo)記：同位素標(biāo)記、生物素標(biāo)記（地高辛標(biāo)記，Digoxigenin）支持物重 物轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman 3MM 濾紙雜交膜吸水紙注意事項(xiàng)：DNA要完整，純度要高氣泡多種酶2.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD) 建立于PCR 技術(shù)基礎(chǔ)之上的一種技術(shù)。它分別以具有相對性狀的基因組DNA為模板，以一個(gè)10bp隨機(jī)寡核苷酸作引物進(jìn)行PCR

10、擴(kuò)增反應(yīng)，在擴(kuò)增產(chǎn)物中查找與目的性狀相連鎖的DNA片段（即差異片段），獲得的片段就是目的性狀的RAPD標(biāo)記。特點(diǎn)：試驗(yàn)步驟少；沒有物種特異性；技術(shù)簡便；DNA樣品量少；易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性；顯現(xiàn)標(biāo)記重復(fù)性不高；存在共遷移問題基本步驟： 1、DNA的提取； 2、用隨機(jī)引物對兩個(gè)相對性狀個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（1）模板（2）引物 （3）緩沖液（4）Mg2+（5）dNTP（6）耐熱DNA聚合酶 變性、退火、延伸 3、用凝膠電泳分開產(chǎn)物DNA片段； 4、查找特異的與目的性狀共分離的DNA片段；注意事項(xiàng)：冰上加樣操作；DNA質(zhì)量；反應(yīng)靈敏，防止污染；影響因子多，要調(diào)體系；瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠；轉(zhuǎn)變?yōu)閯e的標(biāo)記D

11、NA指紋技術(shù) (DNA fingerprinting，DNF) 原理與RAPD技術(shù)相同，不同的是，在DNF分析中，引物濃度更高，引物長度更短，一般6個(gè)堿基，產(chǎn)物片段比較小且極為豐富，往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，DNF通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型。任意引物PCR(Arbitary primer PCR，AP-PCR) 武斷的選擇一個(gè)非特異性引物，在標(biāo)準(zhǔn)的PCR體系中，首先在不嚴(yán)格的條件下使引物與待分析的DNA序列通過錯(cuò)配而復(fù)性，如果兩個(gè)引物之間的序列符合擴(kuò)增的條件則可以進(jìn)行擴(kuò)增，再后期嚴(yán)格的擴(kuò)增條件下產(chǎn)生指紋圖。引物的選擇：M13-20測序引物影響因素：鹽濃度、復(fù)性溫度、模板濃度、引物濃度操作步驟：D

12、NA的提取PCR反應(yīng)：先寬松后嚴(yán)格電泳觀察分析2.3 序列特征擴(kuò)增區(qū)域 (sequence characterized amplified region，SCAR) 先做RAPD或DNF分析，然后把標(biāo)記片段測序，根據(jù)片段兩端的序列設(shè)計(jì)一對特定引物（通常16-24個(gè)堿基），再對具有相對性狀的兩個(gè)基因組進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，這樣就可把與相對性狀對應(yīng)的序列單一擴(kuò)增出來。這樣的DNA片段與原先的性狀存在對應(yīng)關(guān)系，就稱為該性狀的SCAR標(biāo)記。Random primerRandom primerspecific primer 1specific primer 2RAPD markerSCAR markerS

13、equencing SCAR比RAPD和其它利用隨機(jī)引物的方法在基因定位和作圖中的應(yīng)用更好，因?yàn)樗懈叩目芍貜?fù)性（原因是使用的引物長）。SCAR的操作過程： RAPD標(biāo)記技術(shù)分析； 回收特異RAPD擴(kuò)增片段； RAPD產(chǎn)物克隆與測序； RAPD產(chǎn)物特異引物設(shè)計(jì)； 特異引物引導(dǎo)下的PCR反應(yīng)； 電泳獲得SCAR標(biāo)記。2.4 簡單序列重復(fù)標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR） 真核生物基因組含有分散重復(fù)序列和串連重復(fù)序列兩種類型的重復(fù)序列。根據(jù)重復(fù)序列的長度、拷貝數(shù)和位置等又將串連重復(fù)序列分為衛(wèi)星DNA（基序長100300bp）、小衛(wèi)星DNA （基序長1060bp）、 微衛(wèi)

14、星DNA（基序長16bp，如 CA、 CTCG ）等幾種類型。 SSR根據(jù)簡單重復(fù)序列外兩翼的特定短序列設(shè)計(jì)引物，用來擴(kuò)增重復(fù)序列本身，由于重復(fù)的長度變化極大，所以會(huì)得到不同長度的片段。如果擴(kuò)增出來的某個(gè)片段與某個(gè)特定性狀存在對應(yīng)關(guān)系，則該片段為該性狀的SSR標(biāo)記。SSR原理 重復(fù)單元： 1 6bp,如 CA, CTCG 重復(fù)次數(shù)：5 30 次 覆蓋長度：10300 bp特點(diǎn)：數(shù)量多且平均分布；位于內(nèi)含子中；共顯現(xiàn)遺傳；結(jié)果重復(fù)性高；引物問題SSR 多態(tài)性2.5 簡單重復(fù)序列間區(qū)標(biāo)記（inter-simple sequence repeat, ISSR） 進(jìn)行SSR反應(yīng)需要知道兩側(cè)序列以設(shè)計(jì)引

15、物，但大多數(shù)情況下這些序列并不知道。為了解決這一問題，提出了ISSR標(biāo)記。 設(shè)計(jì)出各種能與SSR序列結(jié)合的PCR引物，這些引物的3端或5端加上24個(gè)隨機(jī)核苷酸，通過PCR反應(yīng)，對兩個(gè)相距較近，方向相反的重復(fù)序列之間的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。所擴(kuò)增的inter SSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過聚丙烯酰胺凝膠電泳或者瓊脂糖凝膠電泳得以分辯，擴(kuò)增帶多為顯性表現(xiàn)。 5錨定引物 3錨定引物 NNNN（CA）n （CA）n NN CACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGT CACACACACACACACA NN n（CA） （CA）n NNNN 3錨定引物 5錨定引物 3錨定

16、引物的PCR產(chǎn)物5錨定引物的PCR產(chǎn)物2.6 表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記（expressed sequence tag，EST） 一個(gè)基因組的所有堿基中一般只有大約2的堿基來組成編碼蛋白質(zhì)的基因，因此測序基因組已不再是一種創(chuàng)建基因目錄的有效途徑。大量的實(shí)驗(yàn)證明，cDNA的大規(guī)模測序才是了解基因組的先驅(qū)。 EST標(biāo)記技術(shù)的原理是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并克隆到載體構(gòu)建成cDNA文庫后，大規(guī)模隨機(jī)挑選cDNA克隆，對其5端或3端進(jìn)行一步法測序，一般長度為300500bp，平均長度為360120bp。所獲得序列與基因數(shù)據(jù)庫已知序列比較，從而獲得對生物體生長發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異、衰老死亡等一系列生命過程認(rèn)

17、識(shí)的技術(shù)。EST標(biāo)記技術(shù)也是一種相對簡便和快捷鑒定大批基因表達(dá)的技術(shù)。 EST來源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫。每一個(gè)EST代表一個(gè)表達(dá)基因的部分轉(zhuǎn)錄片段。通過對EST序列的分析，從中可以獲得大量的基因表達(dá)信息。EST標(biāo)記分為兩大類：（1）以分子雜交為基礎(chǔ)的EST標(biāo)記，使用EST本身為探針和經(jīng)過不同限制性酶酶切的基因組DNA雜交可以產(chǎn)生這類標(biāo)記；（2）以PCR為基礎(chǔ)的EST標(biāo)記，按照EST的序列設(shè)計(jì)引物對植物基因組特殊區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增能夠產(chǎn)生此類EST標(biāo)記。EST標(biāo)記的產(chǎn)生過程及應(yīng)用（1）cDNA文庫的構(gòu)建（2）序列分析：去掉載體序列得到EST序列比較找出已知、未知ES

18、T最后進(jìn)行綜合評價(jià)分析獲得所需EST標(biāo)記（3）數(shù)據(jù)分析 cDNA文庫EST公共數(shù)據(jù)庫基因表達(dá)譜分析電腦克隆全長cDNA克隆RACE2.6 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP) 建立在RFLP和PCR基礎(chǔ)上的標(biāo)記方法。 AFLP標(biāo)記是用DNA限制性內(nèi)切酶酶解具有相對性狀的兩個(gè)群體的DNA，然后對酶切產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，最后在形成的擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)不同。這種不同就是與目的性狀相連鎖的AFLP標(biāo)記。AFLP原理AFLP基本步驟是：（1）基因組DNA的提取和檢測；（2）限制性內(nèi)切酶酶切及連接； 酶切時(shí)一般選擇兩種酶（一種識(shí)別6堿基，

19、一種識(shí)別4堿基），酶切后將酶切產(chǎn)物與人工接頭連接（人工接頭為人為設(shè)計(jì)的一段雙鏈DNA，包括核心區(qū)和酶切區(qū)兩部分，連接前也要酶切）。在實(shí)踐中，這兩步一般是同時(shí)在一起反應(yīng)的。（3）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增； 設(shè)計(jì)的引物包括三部分：5端是與人工接頭核心區(qū)互補(bǔ)的序列、與限制性酶互補(bǔ)序列、3端是帶有選擇性堿基的黏性末端。PCR擴(kuò)增一般有兩步：一是預(yù)擴(kuò)增（只有一個(gè)選擇性堿基）、二是選擇性擴(kuò)增（有兩或三個(gè)選擇性堿基）。（4）在測序膠上分開這些擴(kuò)增產(chǎn)物并檢測其多態(tài)性。熒光標(biāo)記全自動(dòng)AFLP原理與方法For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP KitsAFLP3 果樹分子標(biāo)記研究現(xiàn)狀RAPD：

20、所有果樹SSR：柑橘類、柚類、果梅、柿ISSR：柑橘類、柚類、李、杏、楊梅、波蘿、羅漢果AFLP：柑橘類、柚類、扁桃、蘋果、海棠、荔枝、芒果、桃EST：柑橘類4 DNA分子標(biāo)記在果樹方面的應(yīng)用4.1 親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究4.2 DNA 指紋的建立 （1）新品種登記和品種鑒定，主要作為該品種的專有“代號(hào)”，保護(hù)新育成的品種及育種家的權(quán)益；（2）品種純度和重復(fù)性檢驗(yàn)；（3）品種分類研究根據(jù)各品種DNA 指紋的差異程度可判斷品種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。4.3 遺傳圖譜的構(gòu)建 遺傳圖譜 (genetic linkage map) 是通過遺傳重組交換結(jié)果進(jìn)行連鎖分析所得到的基因在染色體上相對位置的排列圖。

21、4.4 基因定位4.5 分子標(biāo)記的輔助育種5 DNA分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù) 植物育種包括兩方面的重要工作，首先是確定育種材料中是否存在有用的遺傳變異，其次是采用有效的方法把目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到品種中。利用易于鑒定的遺傳標(biāo)記來輔助選擇是提高選擇效率和降低育種盲目性的常用手段。 近二十年來迅速發(fā)展起來的DNA分子標(biāo)記技術(shù)給育種提供了新的途徑，這就是所謂的“分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)（marker-assisted selection，MAS）”。 但此處不包括利用分子標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)異種質(zhì)的鑒定篩選、親本的確定、遺傳材料的鑒定和分析、親本遺傳多樣性的分析和親緣關(guān)系的分析等，而是指把分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于育種過程之

22、中，通過分析與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記的基因型來進(jìn)行育種，從而達(dá)到提高育種效率的目的。5.1 生物性狀及其分子標(biāo)記方法5.1.1 生物性狀及其類型 生物性狀是生物體所表現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生理生化特征。 質(zhì)量性狀（qualitative character） 質(zhì)量性狀是指分離群體中表現(xiàn)為不連續(xù)變異而顯示質(zhì)的差異的性狀。植物的抗病性、抗蟲性和某些抗逆性（抗鹽、抗旱）等性狀表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳。 質(zhì)量性狀一般具顯隱性，在分離世代無法通過表型來識(shí)別目的基因的位點(diǎn)是否純。在幾對基因共同作用相同時(shí)，無法識(shí)別哪些基因在起作用。 數(shù)量性狀（quatitative character

23、） 數(shù)量性狀是指分離群體內(nèi)表現(xiàn)為連續(xù)變異而不顯示質(zhì)的差異的性狀。產(chǎn)量性狀、成熟期、開花期、品質(zhì)等性狀屬于數(shù)量性狀遺傳。 數(shù)量性狀易受外界環(huán)境條件影響，選擇周期長，效果差。5.1.2 質(zhì)量性狀的分子標(biāo)記方法 近等基因系（near isogenic , NIL）分析法 近等基因系是一組遺傳背景相同或者相近，僅僅在個(gè)別染色體區(qū)段上有差異的標(biāo)記體系，是一系列回交過程的產(chǎn)物。輪回親本（受體）和非輪回親本（供體）雜交得到輪回親本的近等基因系。 如果近等基因系與輪回親本的標(biāo)記基因型不同，而與非輪回親本的標(biāo)記基因型相同，那么該分子標(biāo)記可能和目標(biāo)基因連鎖。 分離體分組混合分析（bulked segregation analysis , BSA）法 BSA法的原理是將分離群體中的個(gè)體依據(jù)研究的目標(biāo)性狀（如抗病和染?。┓殖蓛山M，在每組群體中把各個(gè)個(gè)體的DNA等量混合，形成兩個(gè)DNA混合池。 因此又稱為近等基因池法。它克服了許多植物不易獲得近等基因系的缺點(diǎn)。5.1.3 數(shù)量性狀的分子標(biāo)記方法 數(shù)量性狀的分子標(biāo)記為研究數(shù)量性狀的遺傳