第十二章其他分子診斷檢測(cè)技術(shù)

1、第十二章 其他分子(fnz)診斷檢測(cè)技術(shù)臨床(ln chun)生物化學(xué)教研室 付祖姣 博士共八十頁目 錄第一節(jié) 基因變異(biny)檢測(cè)技術(shù)第二節(jié) 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳第三節(jié) 分子影像共八十頁第一節(jié) 基因變異檢測(cè)(jin c)技術(shù)檢測(cè)(jin c)已知的基因突變檢測(cè)未知的基因突變分子診斷檢測(cè)基因突變的目的：共八十頁幾種常見的基因(jyn)變異檢測(cè)方法PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)寡核苷酸連接實(shí)驗(yàn)溫度梯度凝膠電泳和變性(binxng)梯度凝膠電泳變性高效液相色譜法錯(cuò)配接合蛋白質(zhì)截短測(cè)試法共八十頁一、PCR擴(kuò)增阻礙(z i)突變系統(tǒng)(PCR amplification regractory mytation

2、system, PCR-ARMS)以PCR方法為基礎(chǔ)，檢測(cè)已知點(diǎn)突變(tbin)的一種方法。又叫做PCR等位基因特異性擴(kuò)增法（PCR amplification of specific alleles, PASA）或等位基因特異性PCR (alleles-specific PCR, ASPCR)共八十頁（一）基本原理 PCR的引物3末端(m dun)的核苷酸與模板之間存在錯(cuò)配時(shí)，PCR擴(kuò)增效果差，或者不能擴(kuò)增。模板 3 5引物 5 3 A T G T T A T A C A A CPCR-ARMS共八十頁設(shè)計(jì)2對(duì)引物，一對(duì)(y du)引物（P1）與正常基因完全匹配，一對(duì)(y du)引物(P2)

3、與突變基因完全匹配。用這兩對(duì)引物分別擴(kuò)增模板。如果模板基因?yàn)檎；颍敲碢1擴(kuò)增可以得到大量產(chǎn)物，而P2無產(chǎn)物。如果模板已經(jīng)突變，那么P2擴(kuò)增可以獲得大量產(chǎn)物，而P1無產(chǎn)物。PCR-ARMS基本原理PCR-ARMS共八十頁5 33 5 ATGGTTCCTG TACCAAGGAC5 33 5 ATGGTACCTGTACCATGGAC突變(tbin)等位基因正常等位基因順利(shnl)延長(zhǎng)不能延長(zhǎng)5 3ATCGTT5 3ATCGTT突變基因的引物P2的擴(kuò)增PCR-ARMS共八十頁（二）應(yīng)用(yngyng)檢測(cè)單一點(diǎn)突變(tbin)基因分型檢測(cè)多位點(diǎn)突變PCR-ARMS的應(yīng)用共八十頁1. 檢測(cè)(j

4、in c)單一點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)一對(duì)引物，可以擴(kuò)增突變基因而對(duì)正?；虺蕯U(kuò)增阻遏；附加一對(duì)引物，可以擴(kuò)增標(biāo)志性基因作為陽性對(duì)照；PCR擴(kuò)增完成，進(jìn)行電泳，即可得知(d zh)點(diǎn)突變是否發(fā)生。 M MG NG 異常陽性對(duì)照突變基因PCR-ARMS的應(yīng)用共八十頁2. 基因(jyn)分型可用于單個(gè)突變的基因分型（鑒別(jinbi)雜合子和純合子）或多態(tài)性分析PCR-ARMS的應(yīng)用1: 正常基因的引物擴(kuò)增結(jié)果；2：突變基因的引物擴(kuò)增結(jié)果 M Wt1 Wt2 Ht1 Ht2 Hm1 Hm2 野生純合子雜合子 突變純合子方法一：正常等位基因野生純合子點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變純合子共八十頁方法(fngf)二：

5、野生純合子雜合子 突變純合子 M Wt Ht Hm5335496 bp371 bp野生型基因(jyn)引物突變型基因引物突變點(diǎn)PCR-ARMS的應(yīng)用共八十頁3. 檢測(cè)(jin c)多位點(diǎn)突變突變(tbin)點(diǎn)1突變點(diǎn)2片段1 片段2PCR-ARMS的應(yīng)用PCR-ARMS可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)點(diǎn)突變。共八十頁（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)適用于較少點(diǎn)突變的檢測(cè)(jin c)；具有低-中等批量處理能力；可借助多重PCR檢測(cè)多個(gè)點(diǎn)突變；無需放射性標(biāo)記；無需昂貴的試劑；無需復(fù)雜的檢測(cè)系統(tǒng)PCR-ARMS優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)只能檢測(cè)已知的基因突變及多態(tài)性共八十頁二、寡核苷酸連接(linji)實(shí)驗(yàn)(oligonucleoti

6、de ligation assay, OLA)利用DNA連接(linji)酶，將2段寡核苷酸探針順向連接(linji)，從而檢測(cè)靶基因型的一種方法。該方法因?yàn)榭煽俊⒕_、重現(xiàn)性好，已成為臨床遺傳病分子診斷的一種基本方法。共八十頁（一）基本原理嗜溫性或耐熱的連接酶具有高特異性和高保真性，它能連接與模板序列完全(wnqun)互補(bǔ)的兩段核苷酸片段。OLA的基本原理DNA 連接酶5 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT G C TAAGGACTAG3 55 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT A C TAAGGACTAG3

7、5共八十頁雙等位基因變異(biny)的檢測(cè)OLA的基本原理探針(tn zhn)1 5 等位基因A 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT G C TAAGGACTAG3 5 TACCAAGGA G G AT TCCTGATC ATGGTTCCT C C TAAGGACTAG3 5探針2 5 等位基因a 3通用探針共八十頁OLA實(shí)驗(yàn)(shyn)的操作耐熱連接酶，可使變性和連接連續(xù)(linx)進(jìn)行，產(chǎn)物呈線性增長(zhǎng)，大大增加了檢測(cè)的靈敏度；若PCR擴(kuò)增引物的Tm值大于探針的Tm值，可在同一管內(nèi)先進(jìn)行PCR，再進(jìn)行OLA實(shí)驗(yàn)，大大減少了污染，提高檢測(cè)效率。2. 條件

8、：1. 反應(yīng)體系：3. 方法的發(fā)展：2個(gè)探針、DNA連接酶、模板探針與靶序列的雜交區(qū)域足夠長(zhǎng)（20bp）溫度：能使探針和靶序列雜交OLA的基本原理共八十頁（二）臨床(ln chun)應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥的分子診斷、產(chǎn)前檢查多種遺傳病及常見病的檢測(cè)(jin c) (P168)；局部地區(qū)人群的遺傳病分子檢測(cè)PCR-OLA的應(yīng)用共八十頁（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)能可靠地鑒別基因型及純、雜合子；不容易(rngy)產(chǎn)生假陰性和假陽性結(jié)果；利用耐熱連接酶循環(huán)進(jìn)行連接，使信號(hào)放大，更增強(qiáng)了該法的靈敏度優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)： 需要多相參與，增加實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度； 需要PCR擴(kuò)增與OLA相結(jié)合，PCR的非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致了該

9、方法的重現(xiàn)性不夠PCR-OLA的方法學(xué)評(píng)價(jià)共八十頁三、溫度梯度凝膠電泳和變性(binxng)梯度凝膠電泳 利用(lyng)不同的分子在不同濃度的變性劑作用下，失活而改變分子構(gòu)象，進(jìn)而進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。 利用不同的分子在不同的溫度下，構(gòu)象改變的不同而進(jìn)行分離的一種電泳技術(shù)。 溫度梯度凝膠電泳 （Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE） 變性梯度凝膠電泳 (denaturing-gradient gel electrophoresis, DGGE)46 50 54 58 62共八十頁（一）TGGE的基本原理 普通的非變性凝膠電泳不能分離具

10、有相似長(zhǎng)度的DNA，所以也不能分離發(fā)生了單核苷酸突變的DNA序列。 但是在溫度梯度凝膠電泳中，隨著(su zhe)溫度的逐漸升高，DNA分子會(huì)呈階梯式逐步發(fā)生解鏈。部分解鏈的雙鏈DNA分子表現(xiàn)出一種復(fù)雜的分枝構(gòu)象，使得其電泳遷移率大大下降。 TGGE共八十頁TGGE的基本原理TGGE5 33 5 ATGGTTCCTG TACCAAGGAC3 5 ATGGCTCCTG TACCGAGGAC5 3正常等位基因突變等位基因Tm=54Tm=5846 50 54 58 62 正?；?jyn)突變基因共八十頁（二）突變的檢測(cè)(jin c)原理正常(zhngchng)等位基因點(diǎn)突變突變雜合子穩(wěn)定遺傳突變純

11、合子PCR擴(kuò)增wt/wt wt/wt, mt/mt, wt/mt, mt/wt mt/mtPCR產(chǎn)物基因型TGGE共八十頁1 2 3 45 6 1 2 3 4 5 6a 異源b 雙鏈帶c 同源(tn yun)d 雙鏈帶1，5，6為點(diǎn)突變(tbin)的雜合子；2為突變(tbin)的純合子；3，4為野生的純合子.TGGE共八十頁（三）變性(binxng)梯度凝膠電泳（DGGE）實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理與TGGE一致，只不過在DGGE中，變性條件取代(qdi)了TGGE的溫度。 在DGGE試驗(yàn)中，有2個(gè)變性條件： 熱：一般采用60的恒定溫度； 變性劑：固定比率的甲酰胺、尿素TGGE/DGGE 如果想要獲得很好

12、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還有耐于利用相關(guān)軟件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件：電泳時(shí)間、凝膠的濃度、變性的梯度等。共八十頁（四）臨床(ln chun)應(yīng)用廣泛應(yīng)用于疾病基因的突變檢測(cè)(jin c)，尤其是一個(gè)等位基因發(fā)生突變就會(huì)引起的疾病檢測(cè)(jin c)；篩選人類基因的多態(tài)性；人類基因的突變檢測(cè)，如P53、FBN1等基因；線粒體DNA中的基因突變及多態(tài)性檢測(cè)；糞便及腸內(nèi)微生物多態(tài)性的鑒定；病毒基因組的突變鑒定及不同病毒株之間的基因組差異鑒定。TGGE/DGGE共八十頁（五）方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)高分辨率，能100%檢出對(duì)單個(gè)堿基突變(tbin)的基因；結(jié)合GC夾、補(bǔ)骨脂素夾或雙邊夾，可提高其靈敏度，獲得更高的檢出率。TG

13、GE/DGGE優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)合成帶GC夾的引物需要特定的儀器，成本較高。共八十頁色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，其原理是利用待分離的各種物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)、吸附能力等親和能力的不同來進(jìn)行(jnxng)分離的。將它用于分析化學(xué)并配合適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段，就成為色譜分析法。高效液相色譜：以液體為流動(dòng)性，高速、高效率地分離混合物的一種色譜技術(shù)。變性高效液相色譜：改進(jìn)傳統(tǒng)高效液相色譜的分離系統(tǒng)，并運(yùn)用變溫分析方式，高效分離各種生物大分子（包括DNA）的一種方法。四、變性(binxng)高效液相色譜法（denaturing high performance liquid chromatograp

14、hy, DHPLC)DHPLC共八十頁排阻色譜(s p) 親和色譜(s p)共八十頁（一）DHPLC的基本原理DHPLC的分離(fnl)系統(tǒng)DHPLC分離DNA的原理DHPLC檢測(cè)突變的原理DHPLC共八十頁1. DHPLC的分離(fnl)系統(tǒng)DHPLC1. 色譜柱的填料(tinlio) 特性：電中性，疏水性固定相: C18基 質(zhì)： 聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB)2. 離子對(duì)試劑：三乙基銨醋酸鹽（TEAA） 特性：帶正電荷，疏水性3. 流動(dòng)相：乙腈 特性：通過改變濃度，將DNA分子按結(jié)合程度的不同，逐步洗脫下來。共八十頁P(yáng)O3-TEAAC182. DHPLC分離(fnl)DNA的原理DH

15、PLC共八十頁DHPLC3. DHPLC檢測(cè)突變(tbin)的原理變性后，緩慢(hunmn)退火分離手段：非變性分離部分變性分離完全變性分離共八十頁（二）臨床(ln chun)應(yīng)用乳腺癌相關(guān)基因BRCA1、BRCA2及ATM等疾病相關(guān)基因的分子(fnz)檢測(cè)；短的串聯(lián)重復(fù)序列的基因分型；腫瘤樣本中雜合性缺失的檢測(cè)；Y染色體和常染色體DNA序列的篩查酵母、擬南芥、果蠅及小鼠的基因組作圖及基因克隆。DHPLC共八十頁（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)優(yōu)點(diǎn)(yudin)：具有更高的準(zhǔn)確性和敏感度。DHPLC檢測(cè)特性SSCPTGGE/DGGEDHPLCDNA測(cè)序檢出范圍0.5%的變異20%的變異檢出率50

16、%-95%40%-100%100%80%工作度需要特殊的GC夾輔助，增加了工作量快速，2-3 min費(fèi)時(shí)費(fèi)力共八十頁錯(cuò)配接合(jih)蛋白質(zhì)截短測(cè)試法（PTT）： 又稱為體外蛋白質(zhì)合成檢測(cè)(jin c)技術(shù)(IVPS),只檢測(cè)(jin c)與疾病相關(guān)的突變，即檢測(cè)(jin c)使蛋白不能全長(zhǎng)翻譯的突變。五、錯(cuò)配接合蛋白質(zhì)截短測(cè)試法（protein truncation test, PTT)共八十頁（一）PTT的原理(yunl)PTT檢測(cè)基因(jyn)缺失、異常的復(fù)制或剪接檢測(cè)翻譯終止突變共八十頁（二）臨床(ln chun)應(yīng)用最早被用于杜氏肌營養(yǎng)不良的檢測(cè)；家族(jiz)性腺瘤樣息肉?。贿z傳性

17、硬纖維瘤?。还矟?jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥；遺傳性乳腺癌；卵巢癌等。PTT共八十頁（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)優(yōu)點(diǎn)(yudin)：PTT不僅可檢測(cè)出只與疾病相關(guān)的蛋白截短突變，還能檢測(cè)出在RNA形成過程中發(fā)生的突變?？梢灾苯硬捎胢RNA進(jìn)行檢測(cè)，減少了操作步驟，加快了分析進(jìn)程；只鑒定引起疾病的截短突變，不會(huì)受到基因沉默的影響；截短蛋白質(zhì)分子的長(zhǎng)度指明了突變的位置，可以更方便地進(jìn)行DNA測(cè)序分析以確定突變。共八十頁DHPLC缺點(diǎn)(qudin)：最佳檢測(cè)范圍(fnwi)為2kb的基因組或1.3-1.6kb的cDNA，因此對(duì)于序列較長(zhǎng)、包含多個(gè)外顯子的疾病基因，需要分幾次進(jìn)行檢測(cè)；PTT因?yàn)槟z的分辨率，

18、而檢測(cè)不出編碼序列中小的插入或錯(cuò)義突變；引起RNA產(chǎn)量改變或使mRNA不穩(wěn)定的突變可能被漏檢。共八十頁謝 謝！共八十頁第二節(jié) 脈沖(michng)電場(chǎng)凝膠電泳 交替采用兩個(gè)方向的不均勻(jnyn)電場(chǎng)，使DNA分子在連續(xù)間隔交替的電場(chǎng)中，不斷改變方向運(yùn)動(dòng)，從而將DNA按分子大小分開的電泳技術(shù)。脈沖電場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)特點(diǎn)：能分離50 kb-10 Mb的DNA片段。共八十頁 在PFGE中，電場(chǎng)的方向、脈沖時(shí)間和電壓大小可交替改變(gibin)。 在每次電場(chǎng)方向改變時(shí)，DNA分子都需要時(shí)間來改變其分子構(gòu)型和遷移方向。 DNA分

19、子越大，分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換所需的時(shí)間越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)變遷移方向的時(shí)間也越長(zhǎng)。 不同大小的DNA分子，因?yàn)槠涓淖冇緞?dòng)方向的時(shí)間不同，遷移速度也就不同，從而可以在脈沖電場(chǎng)中很好地分開。一、PFGE的原理(yunl)共八十頁二、PFGE的一般(ybn)步驟真核或原核細(xì)胞包埋原位裂解限制性酶切脈沖(michng)電泳結(jié)果分析原位裂解獲得完整的染色體DNA與瓊脂糖混合制備包埋塊（含有染色體）限制性酶切后電泳共八十頁三、PFGE的種類(zhngli)倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)(din chng)凝膠電泳（field-inversion gel electrophoresis, FIGE）交流電場(chǎng)凝膠電泳（transverse-alter

20、nating field gel electrophoresis, TAFE）鉗位均勻電場(chǎng)凝膠電泳（contour-clamped homogeneous electric fields, CHEF）旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（rotating gel electrophoresis, RGE）共八十頁兩個(gè)(lin )電場(chǎng)方向?yàn)?80脈沖間隔時(shí)間為： 向前向后=31裝置簡(jiǎn)單：電泳槽和脈沖電極控制器分離片段范圍：10 kb-800 kb特點(diǎn)(tdin)：1. 倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳（FIGE）共八十頁兩個(gè)電場(chǎng)方向?yàn)?15 165 樣品(yngpn)在凝膠中呈“之”字形泳動(dòng)分離片段可大至 1 600 kb在病原生物的

21、基因分析中有特殊的用途特點(diǎn)(tdin)：2. 交流電場(chǎng)凝膠電泳（TAFE）共八十頁目前應(yīng)用最廣泛的一類脈沖電泳沒有所謂的“負(fù)極(fj)”,兩個(gè)主要的電場(chǎng)方向呈120DNA分子在凝膠中能很好地聚焦 分離片段可大至7 000 kb特點(diǎn)(tdin)：3.鉗位均勻電場(chǎng)凝膠電泳（CHEF）共八十頁只有一個(gè)均一的電場(chǎng)凝膠可以周期性旋轉(zhuǎn)用于不同電場(chǎng)角度時(shí)，脈沖時(shí)間、電壓等參數(shù)對(duì)DNA分離效果的影響分離片段(pin dun)范圍：50 kb-6 000 kb特點(diǎn)(tdin)：4. 旋轉(zhuǎn)凝膠電泳（RGE）共八十頁（二）PFGE的應(yīng)用(yngyng)菌株的基因分型；制備某個(gè)(mu )菌株的染色體圖譜；大質(zhì)粒的分離

22、和大小測(cè)定。PFGE共八十頁 菌株的基因(jyn)分型；傳統(tǒng)(chuntng)的細(xì)菌分型方法：生物學(xué)分型；血清學(xué)分型；噬菌體分型；細(xì)菌素分型；優(yōu)點(diǎn)：分辨率高；準(zhǔn)確度高；對(duì)流行病學(xué)的研究貢獻(xiàn)大PFGE共八十頁2. 制備某個(gè)(mu )菌株的染色體圖譜作用(zuyng)：鑒定基因大??；構(gòu)建菌株的基因組物理圖譜 A BPFGE共八十頁3. 大質(zhì)粒的分離和大小(dxio)測(cè)定操作方法：將細(xì)菌(xjn)包埋在瓊脂糖塊中；裂解細(xì)胞壁；S1核酸酶酶切；PFGE電泳PFGE共八十頁第三節(jié) 分子(fnz)影像 1999年由Weissleder等人提出，也被稱為分子成像或分子顯像，它是指在活體狀態(tài)下從細(xì)胞、基因和分

23、子水平，通過無創(chuàng)傷的影像技術(shù)，對(duì)其生物學(xué)行為進(jìn)行(jnxng)定性和定量研究。分子影像 (molecular imaging)共八十頁 分子探針(tn zhn)是分子影像中的關(guān)鍵組成部分，高特異性的分子探針是進(jìn)行分子影像學(xué)研究的先決條件。一、分子(fnz)影像探針分子探針示蹤劑: 放射性核素、順磁性物質(zhì)或熒光素等能參與體內(nèi)自然的生理生化活動(dòng)的特殊分子: 受體、生物酶及單克隆抗體 分子影像探針：一類帶有示蹤劑，能參與體內(nèi)自然的生理生化活動(dòng)的特殊分子。共八十頁 分子探針(tn zhn)需要具備的特點(diǎn)：相對(duì)分子質(zhì)量小、純度高、安全，不影響所研究的疾病過程；具有良好的生物學(xué)功能，能參與人體正常的生理生

24、化活動(dòng)；能夠克服人體內(nèi)部的“生理屏障”（如腦屏障、血管壁、細(xì)胞膜等），順利到達(dá)靶分子所在的器官，同時(shí)不會(huì)積聚(jj)于其他組織；示蹤劑、分子探針和靶分子應(yīng)該緊密結(jié)合，不能脫落，且有足夠長(zhǎng)的半衰期以便于檢測(cè)。共八十頁 根據(jù)(gnj)分子探針的不同，分子影像有2種基本的檢測(cè)策略：1. 直接(zhji)成像2. 間接成像： 采用一個(gè)特異性探針(細(xì)胞表面報(bào)告分子、細(xì)胞內(nèi)分子或基因表達(dá)產(chǎn)物），它與靶分子作用可直接提供一個(gè)與靶分子濃度相關(guān)的信號(hào)而成像。 一般需要一個(gè)報(bào)告基因和一個(gè)報(bào)告探針，它們?cè)谔囟ǖ陌屑?xì)胞中相互作用產(chǎn)生一個(gè)代謝物截留于細(xì)胞中發(fā)出信號(hào)，通過成像設(shè)備探測(cè)到而成像。 共八十頁二、分子(fnz)

25、影像學(xué)技術(shù)（一） 放射性核素成像（radionuclide imaging）（二） 磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）（三） 光學(xué)(gungxu)成像（optical imaging）共八十頁 正電子發(fā)射(fsh)計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)（positron emission tomography,PET） 單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（single photon emission computed tomography, SPECT）2. 常用(chn yn)的放射性核素成像技術(shù)：（一） 放射性核素成像1. 概念 將有明確生物學(xué)效應(yīng)的放射性探針導(dǎo)入人體內(nèi)，使

26、它參與體內(nèi)的生物學(xué)活動(dòng)，利用相關(guān)成像技術(shù)進(jìn)行探測(cè)和顯像，以反映體內(nèi)特定的生物學(xué)活動(dòng)過程，從而了解體內(nèi)的生理、生化狀態(tài)。共八十頁 又被稱為生化(shn hu)顯像或功能分子顯像技術(shù)，集中了核物理、放射化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)影像新技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，從分子水平上觀察細(xì)胞代謝的活動(dòng)，可提供獨(dú)特的生理性示蹤研究和活體生化顯像。特點(diǎn)(tdin)： 正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)（positron emission tomography,PET）共八十頁檢測(cè)(jin c)策略 將人體代謝所需要的物質(zhì)（如葡萄糖、蛋白質(zhì)等）標(biāo)記上短壽命的放射性核素（如14C、13N）制成探針注入人體內(nèi)。因?yàn)椴∽兘M織和正常組織的代謝狀態(tài)

27、不同，它們富集的示蹤劑的量不同。示蹤劑中的放射性核素的正電子與人體內(nèi)的一個(gè)(y )負(fù)電子湮滅能產(chǎn)生兩個(gè)互呈180發(fā)射的光子，而被PET設(shè)備捕獲。 通過對(duì)放射性核素的檢測(cè)成像，PET可顯示出示蹤劑的分布情況和聚集的部位、組織或器官以及量的多少，從而對(duì)疾病進(jìn)行定位、定量、定性及定期分析。（1）直接成像：共八十頁 常用(chn yn)的報(bào)告基因：?jiǎn)渭儼捳畈《拘剀占っ福℉SV-TK）等（2）間接(jin ji)成像： 原理： 胸苷類似物經(jīng)放射性核素標(biāo)記后稱為探針，可以通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)自由通過細(xì)胞膜。但該物質(zhì)可被細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的HSV-TK酶磷酸化，而不能再自由穿過細(xì)胞膜而滯留于細(xì)胞內(nèi)，其放射性的信號(hào)指示HS

28、V-TK的存在，證明外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。共八十頁某個(gè)(mu )特定的器官或組織細(xì)胞表達(dá)(biod)HSV-TKHSV-TK與胸苷類似物特異性結(jié)合，并發(fā)生磷酸化成像發(fā)出信號(hào)HSV-TK基因攜帶報(bào)告基因的細(xì)胞帶標(biāo)記的探針檢測(cè)信號(hào) 間接成像示意圖共八十頁2. SPECT技術(shù)(jsh)原理(yunl)： 通過探測(cè)和處理體內(nèi)的放射性核素自行發(fā)射的單個(gè)的光子構(gòu)成斷層圖像，它可以反映器官結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)，現(xiàn)已用于臨床檢測(cè)。與PET技術(shù)的方法學(xué)比較：PET技術(shù)： 一次檢查，全身顯像； 但設(shè)備昂貴，且核素半衰期短， 不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)探針SPECT技術(shù)：價(jià)格便宜，可同時(shí)進(jìn)行多探針成像； 但只能進(jìn)行半定量分析。共八

29、十頁（二） 磁共振成像 基本原理 在外加磁場(chǎng)的作用下，氫原子核（H）即質(zhì)子以一種特定方式繞磁場(chǎng)方向旋轉(zhuǎn)。用一個(gè)適當(dāng)頻率的射頻脈沖從與主磁場(chǎng)相垂直的方向上對(duì)質(zhì)子進(jìn)行激發(fā)后，會(huì)引起質(zhì)子共振，成為激發(fā)態(tài)，即所謂磁共振。在射頻脈沖停止后，質(zhì)子在由激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵紤B(tài)時(shí)，會(huì)發(fā)射出與激發(fā)脈沖頻率相同的信號(hào)。通過身體附近(fjn)的接受器接收，并經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，就可獲得MRI圖像。 人體2/3的重量為水分，如此高的比例正是磁共振成像技術(shù)能被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷的基礎(chǔ)(jch)。人體內(nèi)器官和組織中的水分并不相同，很多疾病的病理過程會(huì)導(dǎo)致水分形態(tài)的變化，即可由磁共振圖像反應(yīng)出來。 共八十頁MRI顯示(xinsh)左腎

30、囊腫共八十頁 磁共振成像的策略(cl)間接成像 為了增強(qiáng)磁共振在病變組織的信號(hào)(xnho)，通常采用標(biāo)記報(bào)告基因，并將其轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞并在靶細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增來放大MR信號(hào)(xnho)成像。常用的報(bào)告基因：酪氨酸激酶-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)鐵蛋白受體共八十頁 酪氨酸激酶(jmi) 胞內(nèi)受體； 它是黑色素合成的限速酶，而黑色素有高度(god)結(jié)合鐵的能力； 酪氨酸激酶的過量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致黑色素合成增加，從而使其結(jié)合鐵的量也相應(yīng)增加，而增強(qiáng)MR信號(hào)。共八十頁2. -半乳糖苷酶 胞內(nèi)受體； 該系統(tǒng)采用的分子探針：由釓（ga）的不配對(duì)電子組成，探針周圍(zhuwi)由一個(gè)化學(xué)箍環(huán)封閉，不能與水分子反應(yīng)，箍環(huán)上有一個(gè)糖分子作

31、“門”。 當(dāng)-半乳糖苷酶存在時(shí)，糖分子被降解，“門”開放，釓就暴露在水分子中，其不配對(duì)電子與氫質(zhì)子作用，增強(qiáng)了MR信號(hào)。共八十頁3. 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 細(xì)胞表面蛋白受體； 分子(fnz)探針：超順磁性的單晶氧化鐵微粒和轉(zhuǎn)鐵蛋白的復(fù)合物； 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白-鐵結(jié)合形成復(fù)合體，將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，而增強(qiáng)MR信號(hào)。共八十頁 MRI的方法學(xué)評(píng)價(jià)(pngji)空間分辨率高（達(dá)到m）；能同時(shí)獲得生理及解剖信息；在觀察基因表達(dá)變化(binhu)、腫瘤血管生成及細(xì)胞分子水平的功能成像中具有獨(dú)特的作用。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：需要大量的探針；敏感度較低；掃描和后加工時(shí)間長(zhǎng)；價(jià)格昂貴共八十頁（三） 光學(xué)(gungxu)成

32、像 分類(fn li)熒光成像技術(shù)生物發(fā)光成像技術(shù)共八十頁1. 熒光(ynggung)成像技術(shù)報(bào)告基因：綠色(l s)熒光蛋白（green fluorescence protein, GFP）基因紅色熒光蛋白（RFP）基因近紅外（NIR）熒光素 通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。 紅光的穿透性在小動(dòng)物體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多。近紅外熒光素的波長(zhǎng)為650900 nm，其光子穿透組織能力較可見光強(qiáng)；而且在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，血紅蛋白、水、脂質(zhì)對(duì)光子的吸收率最低，背景噪音的干擾最小。因此近紅外熒光為觀測(cè)生理指標(biāo)的最佳選擇。成像原理：共八十頁2. 生物(shngw)發(fā)光成像技術(shù)通過分子克隆技術(shù)將熒光素酶基因插入靶基因，即可將所需研究(ynji)的基因或細(xì)胞標(biāo)記上熒光素酶。將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)；觀測(cè)前通過腹腔或靜脈注射導(dǎo)入熒光素酶的底物熒光素，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象?；铙w觀察一般采用Fluc基因，這種酶催化熒光素的氧化發(fā)光反應(yīng)需要ATP和氧氣的存在，因此只在活細(xì)胞內(nèi)才產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，而且光