扁豆凝集素的分離純化與性質描述說明書

1、 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark7 o Current Document 一、前言2 HYPERLINK l bookmark11 o Current Document 1.1凝集素的概念及其簡介 2 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 1.2凝集素的分類3 HYPERLINK l bookmark23 o Current Document 1.3凝集素的國內外研究現(xiàn)狀3 HYPERLINK l bookmark26 o Current Document 1.4凝集素的應用前景4 HYPERLINK l bo

2、okmark29 o Current Document 1.5本設計的主要研究內容包括： 6 HYPERLINK l bookmark34 o Current Document 二、扁豆凝集素的分離純化6 HYPERLINK l bookmark38 o Current Document 2.1試驗材料6 HYPERLINK l bookmark41 o Current Document 2.2試驗方法72.2.1扁豆凝集素粗品的制備72.2.2扁豆凝集素的純化7 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 三、扁豆凝集素的性質研究7 HYPERLINK

3、 l bookmark48 o Current Document 3.1試驗材料7 HYPERLINK l bookmark51 o Current Document 3.2試驗方法83.2.1扁豆凝集素的基本性質檢測83.2.2扁豆凝集素的熱穩(wěn)定性測定83.2.3 堿穩(wěn)定性測定93.2.4金屬離子結合特性試驗93.2.5扁豆凝集素的糖抑特性試驗93.2.6扁豆凝集素的抑菌試驗93.2.7扁豆凝集素的凝血活性10 HYPERLINK l bookmark67 o Current Document 參考文獻12扁豆凝集素的分離純化與性質描述一、前言1.1凝集素的概念及其簡介凝集素是自然界廣泛存在

4、的一大類能凝集細胞、多糖或糖復合物的非源于 免疫反應的糖蛋白，進一步被定義為非免疫球蛋白本質的蛋白質或糖蛋白，它 能夠特異性識別并可逆結合復雜糖復合物中的糖鏈，而不改變所結合糖基的共 價結構。它們廣泛存在于各種各樣的生物體中，并在生命活動如病毒、細菌、 支原體和寄生蟲感染、細胞和可溶性組分之間的尋靶作用、受精作用、癌細胞 轉移、生長、分化中都起著重要作用。Peumans和D amme在1995年將植物凝集素定義為至少具有一個可與單糖 或寡聚糖特異可逆結合的非催化結構域的植物蛋白。在植物凝集素的研究中， 豆科植物凝集素是最早進行研究，并且研究的最充分。豆科凝集素盡管在糖結 合專一性有不同，但它們

5、在生物化學特性、一級結構組成方面顯示出相似性， 并且依據(jù)一級結構順序和x-衍射品體圖譜分析表明：其糖結合區(qū)段也非常相 似。由于一個植物種族的凝集素有如此廣泛的同源性，有力的揭示了這些蛋白 質的基因編碼有共同的祖先。豆科凝集素經(jīng)常作為凝集素研究的模式蛋白質與 其它種類相互對照。凝集素可作為一種探針，廣泛的應用于糖精細結構、醫(yī)學 治療和鑒定，并在農(nóng)業(yè)轉基因工程方面，并有著良好的前景。有些豆科凝集素 （如PHA）具有刺激外周血淋巴細胞RNA合成和有絲分裂，誘發(fā)人外周血淋巴細胞 產(chǎn)生抗癌淋巴因子，促進巨噬細胞的吞噬作用，能使細胞凝集和腫瘤細胞失活 等生物學活性；而且，人食用未熟透的菜豆會引起中毒，國內

6、也經(jīng)常有因食用 了未熟透的菜豆而引起中毒的報道，現(xiàn)在知道這是由于菜豆凝集素的作用結 果，因此對豆科凝集素的研究深受重視。凝集素是一種非常有用的工具，可用 來檢測，分離復合糖（主要是糖蛋白），并進行性質研究；對細胞和組織進行組 織化學研究，檢測從細胞分化到癌發(fā)生的生理和病理過程中細胞表面發(fā)生的變 化。所以對豆科植物凝集素結構、功能的進一步研究，不僅可以揭示植物凝集 素存在的其他功能，還會促進分子生物學、細胞生物學、免疫學、病理學、神 經(jīng)生物學、發(fā)育生物學等學科的發(fā)展。11.2凝集素的分類21.2.1按來源分類可以分為植物凝集素，動物凝集素和微生物凝集素三類。例如，扁豆凝集 素(Lens culi

7、naris lectin，LCL)是植物凝集素素，雞乳糖凝集素素(Chicken lactose lenin，CLL)是動物凝集素，而蘑菇凝集素素(Agaricus bisporus lectin,ABL)是真菌類的微生物凝集素。1.2.2按凝集素在細胞中存在部位分類可以分為可溶性凝集素和膜結合凝集素。例如，唾液酸糖蛋白(Major sialoglcoprotein)是紅細胞膜上面結合的凝集素蛋白，這種凝集素需用緩沖溶 液，甚至采用去垢劑溶解才能進一步純化。伴刀豆凝集素(ConcanavaliaA，ConA) 是典型的可溶性凝集素，可溶于0. 9%生理鹽水，可以采用經(jīng)典的蛋白質純化 方式純化。

8、1.2.3按凝集素的糖結合專一性分類D-甘露糖，D-葡萄糖結合，例如蠶豆凝集素(Hciafaba lcclin,VFL)和豌 豆凝集素(Pisum sativum lectin. PSL)。2-乙酰氨基2-脫氧-D-葡萄糖結合，例如馬鈴薯凝集素(Solanum tuberosum lecfin， STL)和麥胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA).2-乙酰氨基2-脫氧-D-半乳糖結合，例如剌槐凝集素(Robinia pseudoaccacia lecfin,RPL)和蝸牛凝集素(Helixpomatia lectin。HPL)。D-半乳糖結合，例如蓖麻凝集素(Ricin

9、us communis agglutinin， RCA) 和花生凝集素(Peanut(Arachis hypogaea)agglutinin， PNA)。L巖藻糖結合，例如荊豆凝集素(Ulex europeus lectino UEL)和歐洲百脈 根凝集素(Lotus tetragonolobus leetin， LTL)。唾液酸結合，例如，龍蝦凝集素(Homarus americanus lectin， HAL)。1.3凝集素的國內外研究現(xiàn)狀目前，人們已分離純化的凝集素逾1000種，它們大多為植物凝集素，其 中僅豆科植凝集素即達600余種。通過分離純化人們可以對凝集素的理化性 質、蛋白結構與

10、功能及編碼的基因作進一步的研究。目前已純化的凝集素的分 子量一般為10-100kDa，如最常見的伴刀豆球蛋白A分子量為104kDa，但小麥 胚凝集素分子量僅為36kDa。通常凝集素由亞基組成，一般為2個或4個，3 個的少見。亞基產(chǎn)生的分子機制有三種解釋：不同亞基是不同基因編碼的產(chǎn)物； 不同亞基由同一基因編碼，翻譯后裂解成分子量相同或不同的肽鏈；翻譯后發(fā) 生不同程度的修飾。大多數(shù)凝集素的前體分子都比成熟分子大，翻譯后經(jīng)過裂 解、糖基化或其它加工后成為成熟分子。3凝集素不同，化學組分也是不同的， 有的是簡單的蛋白質，有的則為糖蛋白。不同的凝集素分子還具有特定的氨基 酸組分。同時，通過研究發(fā)現(xiàn)凝集素

11、的糖結合位點也是各異的，不同的凝集素 分子識別復雜碳水化合物上的特定糖殘基，與糖發(fā)生可逆結合而不改變糖苷鍵 的共價結構。雖然它們的糖結合活性各不相同，但它們的可結合的糖基類型大 體可分為以下6類：（1）甘露糖（葡萄糖）；（2）N 一乙酰氨基葡萄糖；（3）半 乳糖；（4）N 一乙酰氨基半乳糖；（5）巖藻糖；（6）唾液酸。1.4凝集素的應用前景凝集素的特殊的生物學功能，使其具有廣泛的利用前景。特別是隨著生物 工程的研究手段和研究領域的不斷擴大，凝集素的各種實際應用也展現(xiàn)了新的 途徑。凝集素在生命機體中識別外來物，在體內外）起調理作用。因此它在認識 和解決集約化、半集約化的養(yǎng)殖生物的防病治病中有重要

12、作用。對凝集素認識 的普及和研究的深入將提高我國養(yǎng)殖業(yè)總體水平。對凝集素開發(fā)、利用和生化 工程技術的拓展，將會使養(yǎng)殖業(yè)及其病害防治轉化為高技術類型。凝集素的防衛(wèi)作用可應用于抗蟲基因工程，為抗蟲育種提供新的途徑。雪 花蓮外源凝集素（GNA）對某些咀嚼式和刺吸式昆蟲均有抗性，如煙草夜蛾、豇 豆象、飛虱、葉蟬和蚜蟲，但對高等動物沒有毒性。將編碼雪花蓮外源凝集素 成熟蛋白的eDNA GNA 12和其前體蛋白eDNA GNA 34插入到二元載體pBin438的 雙倍增強子CaM V 35S啟動子或二元載體pBcop l的CoYMV啟動子下游，分別構 建成植物表達載體pBGnal2、pBGna34、pBC

13、Gnal2和pBCGna34。凝集素由于能和糖專一性識別，而且糖的專一性范圍又廣，加上易于分離 純化，所以經(jīng)常作為免疫學和糖生物學的分子探針，對生理、生化過程進行研 究。首先用標記物將凝集素標記，再利用標記的凝集素來研究糖復合物的結構、 在生物體內的分布，也可用于研究生理、病理過程。比如研究精子在與卵子結 合過程中，其細胞表面受體的種類和分布的變化：研究細胞分化發(fā)育過程中， 糖結構發(fā)生的變化和蛋白質糖基化;惡性病變細胞表面糖類結構變化及轉移過 程中糖類結構特征等等。由于凝集素可與糖分子專一性可逆結合，從而被廣泛 用于分離純化糖分子、糖蛋白、糖脂。利用凝集素分離糖蛋白開始于ConA分離 酵母蔗糖

14、酶?，F(xiàn)在已有商品化的ConA、扁豆凝集素、PNA等親合層析柱出售。 目前，己應用GNA純化鼠血清中免疫球蛋白2M的單克隆抗體，用ConA純化絨毛 膜促性腺激素(HGG)、人血清白蛋白、胰島素受體等；還有，用HA分離干擾素 和免疫球蛋白等。另外，部分凝集素對人類及動物反轉錄病毒(含HIV)和巨細 胞病毒具有選擇性抑制作用。細胞在正常分化、發(fā)育或異常病變過程中，其表面糖鏈結構有很大的變化， 癌變細胞往往表現(xiàn)出糖鏈的變化。且癌變細胞表面特異凝集索受體發(fā)生變化， 凝集素可作為生物探針探測細胞表面糖分布及變異細胞表面糖的變化。扁豆凝 集素和豌豆凝集素可鑒別診斷肝癌和肝炎患者血清中血清甲胎蛋白(AFP)的

15、升 高是源于肝癌細胞或是其它病肝細胞。國內有人采用此法鑒別肝癌和肝炎，使 肝癌假陽性率明顯下降。ConA可用于胎兒神經(jīng)管缺陷及另一些畸形，如脊柱裂 的產(chǎn)前診斷，這是個很有價值的輔助診斷方法，幾乎所有這類畸形的妊娠婦 女，羊水中糖蛋白濃度顯著降低，不與ConA發(fā)生作用或僅有輕微作用。溶酶體 蓄積性疾病以某些特殊的水解酶缺乏為特征，如巖藻糖苷蓄積癥病人，缺乏a 一L 一巖藻糖苷酶，其神經(jīng)元及其它某些類型的細胞可與荊豆凝集素強烈作用， 以輔助診斷。T淋巴細胞在體外經(jīng)凝集素激活后，可轉化為淋巴母細胞，根據(jù)淋巴母細 胞的轉化情況，可反應機體的細胞免疫水平，監(jiān)視各種免疫抑制和免疫增強的 療效。用淋巴細胞轉

16、化實驗評價艾滋病人的免疫功效，亦是一個簡單有效的方 法。PHA、ConA等植物凝集素用作皮內注射可反應腫瘤、肝炎等患者的細胞免 疫能力。我國目前普遍采用PHA作促細胞分裂原評價各種疾病患者的免疫功能。 SBA可選擇性沉淀在骨髓移植中引起排斥反應的T淋巴細胞，收集SBA處理過的 骨髓成功地用于臨床骨髓移植。PHA配合化療、放療或其它治療能夠提高單一 療法的療效。對頑固性白血病、晚期惡性滋養(yǎng)葉腫瘤應用PHA合并療法取得了 明顯療效。甘潤良等用I標記的花生凝集素對裸鼠載人胃癌進行靶向治療，療 效顯著，腫瘤抑制率達73. 2%,可延緩腫瘤生長，延長了荷瘤宿主的生存期。 并且對小鼠沒有毒性作用。凝集素也

17、可在固氮工程中發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)識別根瘤菌的因子是 豆科植物根上的凝集素。目前，固氮工程嘗試將豆科植物的凝集素基因轉化到 非豆科植物，再接種豆科植物的根瘤菌，使該種非豆科植物被侵染和結瘤。固 氮菌能在豌豆上形成根瘤，但不能在白三葉草根和發(fā)根中形成根瘤。若將PSL 基因轉入自三葉草后，白三葉草根毛上也產(chǎn)生了根瘤。PSL定位于轉基因白三 葉草根表皮細胞的外表面和根毛間段，但正常的三葉草和發(fā)根中則沒有PSL。 這種固氮方法應用于糧食作物將有很大的意義?？傊?，凝集素最初在植物中被檢測到并命名為盤凝索，一直到目前成為具 有許多重要功能和用途的普遍存在的識別分子，在這120多年來，人們對凝集 素的認

18、識已經(jīng)有了很大的提高。凝集素作為生物體內一類特殊的蛋白質(糖蛋 白)，在防御病原體入侵、存貯營養(yǎng)物質、?；R別等方面有其獨特的功能。 我們可以利用這些特性，在生物工程、臨床研究等各方面發(fā)揮作用，利用凝集 素的功能造福人類。1.5本設計的主要研究內容包括：對扁豆凝集素分離、純化過程。對扁豆凝集素的性質特性，包括糖結合特性，金屬離子結合特性，熱 穩(wěn)定性，pH穩(wěn)定性等進行研究。二、扁豆凝集素的分離純化2.1試驗材料扁豆種子，無水乙醚，0.15 mol/L NaCl,0.02 mol/L Tris-HCl,硫酸銨，聚乙 二醇，DEAE-52，Sephacryl S-300 CMFastFlow、Sep

19、hadexG-25，丙烯酰胺， 亞甲基雙丙烯酰胺，鏈霉蛋白酶(pronase E)，牛血清白蛋白(BSA)，對二甲基氨基苯甲醛(DAB)、N-漠代丁二酰亞胺(NBS)。2.2試驗方法2.2.1扁豆凝集素粗品的制備取扁豆種子100g，去皮磨成粉末，用無水乙醚(1： 4, v:v)于4C浸泡脫 脂 2 次。然后，用含 0.15 mol/L NaCl 的 0.02 mol/L Tris-HCI, pH 7.8 緩沖液(1： 4, v:v)在4C下浸提兩次每次24小時。提取液經(jīng)離心(4C, 10000rpm, 30 min) 后，棄去沉淀，上清液采用硫酸銨分段鹽折法，取飽和度為40%80%的沉 淀，將

20、沉淀溶于0.02mol/L Tris-HCl，pH 7. 8緩沖液中得到相應的粗品。2.2.2扁豆凝集素的純化粗品4C下充分透析除鹽，然后上經(jīng)0.02mol/L Tris-HCI,pH 7.8緩沖液平 衡的DEAE-52陰離子交換柱，充分淋洗后，換用含0.5mol/LNacl的相同緩沖 液進行離子線性梯度洗脫，分部收集，流速0.5 ml/min，3 ml/管，經(jīng)紫外和凝 集兔紅細胞活性檢測后，收集活性部分。此活性部分對0.02 mol/L NaAc-HAc,pH 5.0緩沖液充分透析，然后上用相同緩沖液平衡的CM Fast Flow 陽離子交換柱，充分淋洗后，換用含0.5 mol/LNaCl的

21、相同緩沖液進行離子線 性梯度洗脫，分部收集，流速0.5 ml/min，3 ml/管，經(jīng)紫外和凝集兔紅細胞 活性檢測后，收集活性部分。此活性部分用聚乙二醇20 000濃縮后，對含0. 15 mol/L NaCl的0. 02mol/L Tris-HCl，pH 7.8緩沖液充分透析，并用相同緩 沖液平衡Sephacryl S-300柱，然后在FPLC上進行分子篩層析純化，分部收 集，流速為l ml/min，3 ml/管，經(jīng)紫外和凝集兔紅細胞活性檢測后，收集活 性部分，再過Sephadex G-25柱除鹽后得扁豆凝集素純品。三、扁豆凝集素的性質研究3.1試驗材料扁豆凝集素提取液，考馬斯亮藍，高碘酸-S

22、chiff試劑，生理鹽水，PBS 緩沖液，2 %兔血細胞懸液，緩沖系統(tǒng)，金屬離子，乳糖，蔗糖，麥芽糖，a- 半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸餾水溶液，大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌等PDA培養(yǎng)平板3.2試驗方法3.2.1扁豆凝集素的基本性質檢測3.2.1.1純度鑒定和糖蛋白的確定采用柱狀圓盤聚丙烯酰胺凝膠電泳，用考馬斯亮藍和高碘酸-Schiff試劑 分別染色，根據(jù)凝膠呈現(xiàn)色帶的情況確定扁豆凝集素的純度和是否是糖蛋白。3.2.1.2扁豆凝集素的等電點測定采用聚丙烯酰胺凝膠電聚焦發(fā)測定其等電點，所用凝膠濃度為7%，兩性 電解質為ph3.0-10.0的Ampholin，其最后濃度為1.5%左右，上下電極分別是 5%

23、的磷酸而后5%的乙二胺溶液。3.2.1.3分子量的測定采用Bio-Gelp 100凝膠色層法，以牛血清蛋白（68000）、卵清蛋白（45000）、 胃蛋白酶或乳球蛋白（35000）、和糜蛋白酶原（24500）等為標準蛋白，用1 molNaCl溶液作為平衡也和洗脫液，在01.2X 100cm玻璃柱內進行。3.2.1.4扁豆凝集素的活力測定取96孔微型凝血板，在每一個孔內滴入25叫0.9%生理鹽水。取25p l硫 酸銨沉淀樣品，進行系列倍比稀釋（從前一孔吸取25叫液體，放入下一孔內， 充分混合后25p l液體放入下一孔內，如此操作至倒數(shù)第二個孔），留下每一 排的最后一孔，作為對照。在每一個孔內滴入

24、25 u1 2%兔血紅細胞，室溫下 放置30 min后觀察。73.2.2扁豆凝集素的熱穩(wěn)定性測定在96孔V型血凝板上加4 5叫凝集素溶液與等量PBS緩沖液倍比稀釋后, 放在溫度為 30C、40C、50C、60C、70C、80 C、90 C水浴中保溫 5min 后取出，待其冷卻全室溫，加入等量的2 %兔血細胞懸液，振勻。1h后，用 顯微鏡進行檢測。血凝活力以凝集素最大稀釋倍數(shù)（以2n表示），以PBS作空 白對照。比較凝集活性。3.2.3堿穩(wěn)定性測定在凝血性試驗的基礎上，選定兔紅血球配制成2% (體積濃度)生理鹽水重 懸液，分別使用以下緩沖液為溶劑配制濃度為1-5 mg/mL的凝集素溶液：NaAc

25、-HAc 緩沖液(pH 3.7-5.8)NaH2P04Na2HP04 緩沖液(pH 6.2-7.8)TrisHcl 緩沖液(pH 8.23-9.10)Na2C03-NaHC03 緩沖液(pH 9.5-10.83)Na2HP04 一 NaOH 緩沖液(pH 11.2-11.9)KCl-NaOH 緩沖液(pH 12.2-13.0)0.09%生理鹽水配制好的溶液在25r水浴鍋保溫30min后，分別加入融含25p l血球緩 沖液和50p l此2% (體積濃度)紅血球重懸液的“，形板孔中，振蕩Imin, 室溫下靜置1.5-2h，觀察凝血結果。3.2.4金屬離子結合特性試驗將離子交換層析得到的樣品裝入透析

26、袋內，放入20 mm EDTA溶液中24 h， 以螯合凝集素中的金屬離子。然后用0.9%NaC!溶液充分透析去除EDTA。取透 析后的樣品進行倍比稀釋，加入25 p l 2%兔紅血細胞懸液。取25p l濃度 為10mm的10個過渡金屬離子和一種非金屬離子，即Ba2+、K2+、Za2+、Li2+、 Mg2+、Fe2+、Ca2+、Fe3+、Al3+和Mn2+等lO個金屬離子和NH+4離子放入V型血 凝孔內。另取25pl 0.09%NaCl溶液作為對照。靜置1 h后觀察現(xiàn)象并讀取 血凝孔數(shù)。103.2.5扁豆凝集素的糖抑特性試驗用0.9%生理鹽水倍比稀釋離子交換層析得到的樣品后，在每一個稀釋孔 內加

27、入依次分別加入25叫50 mM，100 mM和200 mM濃度的乳糖，蔗糖，麥 芽糖，a-半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸餾水溶液。隨后在每一個稀釋孔內加入 25p l2%兔紅血細胞懸液。靜置30 min后觀察凝血現(xiàn)象并讀取凝血孔數(shù)。m3.2.6扁豆凝集素的抑菌試驗本過程采用濾紙圓片法，在超凈工作臺內進行如下操作(所有器材均已滅 菌)：將1mL滅菌生理鹽水注入長滿菌絲或已形成孢予的病菌試管中，振 蕩、搖勻。將菌液移入從50C烘箱取出的PDA平皿，仔細搖晃、混勻，平放至 冷卻、凝固。將生理鹽水過濾到1小試管中，用細菌過濾器將扁豆凝集素生理鹽水 溶液過濾到另一小指管中。12用小鑷子將濾紙圓片在凝集素溶液中、生理鹽水中浸潤(但不滴瀝)將濾紙圓片按以下規(guī)格擺放到先前準備好的PDA平皿中，沿平皿圓周 (距皿沿0.5cm)繞圓心每隔60度擺放1片，共5片，余下位置放生理鹽水片。將PDA平皿倒置，25C培養(yǎng)，此后l周內，每天察記錄抑菌情況。133.2.7扁豆凝集素的凝血活性3.2.7.1紅血球溶液的制備按如圖1所示的流程進行操作：從動物體或人體現(xiàn)采的新鮮血液，按血： 抗凝劑=9:1的比例保存在預裝有抗凝劑的30 mL塑料離心管。帶回實驗室離 心、去除上清液，沉淀用生理鹽水重懸，再離心(如此重復4次)，最后用生理 鹽水將沉淀配制成2 % (體積濃度)紅血球溶液