植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白研究進(jìn)展

1、植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的研究進(jìn)展李世成現(xiàn)代基因工程技術(shù)最初是建立在結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的微生物，尤其是以大腸桿菌為受體表達(dá)外源蛋白，用植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的思路出于偶然。二十世紀(jì)八十年代，比利時(shí)PGS公司的科學(xué)家將一個(gè)神經(jīng)肽（enkephalin，腦啡肽）編碼基因轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)，用意在于讓癮君子們不用抽煙，只需拿煙葉聞一聞或放在口中嚼一嚼即可過(guò)煙癮，以此減少尼古丁對(duì)人體的危害及減少空氣污染。他們?cè)谶@個(gè)小肽基因兩端設(shè)計(jì)了兩個(gè)蛋白酶的酶切位點(diǎn)，將改造后的基因串聯(lián)導(dǎo)入煙草細(xì)胞并成功獲得再生植株，結(jié)果小肽以多聚體的形式表達(dá)存在，用胰蛋白酶和羧肽酶作用后獲得了神經(jīng)肽，每粒種子在200nmol。雖然，他們的目的最終

2、沒(méi)能達(dá)到，因?yàn)樯窠?jīng)肽要經(jīng)血液運(yùn)輸而起作用，在口腔及消化道內(nèi)會(huì)被降解掉，但他們卻意外地找到了一條利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白的途徑，引起人們對(duì)此領(lǐng)域的關(guān)注。尤其是轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器的研究和開(kāi)發(fā)使植物能以極低的費(fèi)用大量生產(chǎn)藥用蛋白,具有極大的商業(yè)價(jià)值。植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的優(yōu)點(diǎn)利用植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白已成為制藥產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。通過(guò)植物基因工程技術(shù)，在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)藥用蛋白及多肽疫苗，具有微生物或動(dòng)物反應(yīng)器不可替代的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)（見(jiàn)表1）。它們不僅可以對(duì)真核生物蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的糖基化、酰氨化、磷酸化、亞基的正確裝配等翻譯后加工，使表達(dá)產(chǎn)物具有良好的生物活性和較低的免疫原性，而且也不像細(xì)菌在發(fā)

3、酵過(guò)程中那樣由于產(chǎn)生不溶聚合物包涵體，而需要將它們重新溶解并折疊成天然蛋白質(zhì)，這一過(guò)程所需要的成本很高；不僅如此，植物反應(yīng)器也不會(huì)像動(dòng)物反應(yīng)器那樣含有人類的潛在病原或其他污染等潛在的威脅；另外利用植物反應(yīng)器，來(lái)源廣，可進(jìn)行大量田間栽培；轉(zhuǎn)化植株系的種子易于儲(chǔ)存，有利于重組蛋白的生產(chǎn)和運(yùn)輸；投資小，成本低。據(jù)推算，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用重組蛋白的成本，僅為利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)成本的110150。表1微生物、動(dòng)物和植物反應(yīng)器的比較原核微生物反應(yīng)器真核蛋白翻譯后加工的能力有限；植物反應(yīng)器上游生產(chǎn)成本較低；動(dòng)物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)需要用胎牛血清作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以及從培養(yǎng)上清中提取，成本昂貴；細(xì)菌發(fā)酵常形成不

4、溶聚合基因轉(zhuǎn)化容易、成功率高、周期短、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生長(zhǎng)繁殖、飼養(yǎng)條物或回收率低；宿主菌的表達(dá)藥物種類及表達(dá)量有限；表達(dá)量高、提純?nèi)菀住⑹招Э欤ㄉ儆趦赡辏?；轉(zhuǎn)基因植物自交后得到的同質(zhì)后代的遺傳性狀穩(wěn)定；進(jìn)而在植物體內(nèi)1/6件及營(yíng)養(yǎng)要求高；基因轉(zhuǎn)化難度大、轉(zhuǎn)化成功率低、生產(chǎn)藥物等待周期長(zhǎng)（牛噬菌體等污染造成倒灌的威脅；下游加工復(fù)雜、成本高；發(fā)酵常常需龐大的設(shè)備投積累多基因；不存在噬菌體污染造成倒灌的威脅；可食藥物節(jié)省下游加工開(kāi)支；需要7年，羊需要3年）；動(dòng)物反應(yīng)器的污染問(wèn)題；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物易產(chǎn)生社會(huì)和倫理問(wèn)題。資。植物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白研究進(jìn)展近20年來(lái)，隨著植物基因工程的迅速發(fā)展，在植物抗蟲(chóng)、抗病毒和

5、品質(zhì)改良等方面已取得了舉世矚目的成就，同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白等為攻克醫(yī)藥難題也開(kāi)辟了新的天地?？茖W(xué)家正逐漸把藥物的生產(chǎn)從微生物轉(zhuǎn)向植物，在這方面許多國(guó)家競(jìng)相研究。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有幾十種藥用蛋白或多肽在植物中成功表達(dá)，一些研究機(jī)構(gòu)或公司已開(kāi)始從這些藥物蛋白的生產(chǎn)中獲得了巨大經(jīng)濟(jì)效益。1、植物抗體自從十幾年前轉(zhuǎn)基因煙草成功地表達(dá)免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因并組裝成功以來(lái),植物已經(jīng)能夠生產(chǎn)完整的IgG和IgA分子,分泌型IgG和IgA分子,單鏈可變區(qū)片段(scFv),Fab片段和重鏈可變區(qū)以及雙特異性抗體(通過(guò)具柔性的肽鍵接頭連接到一起),膜錨定抗體以及嵌合型的IgG和IgA分子等不同類

6、型抗體。應(yīng)用植物生產(chǎn)單克隆抗體具有極大的市場(chǎng)潛力,獲得的價(jià)格低廉的單克隆抗體在人類及牲畜的疾病治療中將發(fā)揮巨大的作用。目前已經(jīng)成功地獲得具有潛在醫(yī)療價(jià)值的植物抗體。主要有轉(zhuǎn)基因煙草生產(chǎn)針對(duì)腐蝕牙齒的致病原Sreptpcpccusmutans抗體IgG-IgA、人抗皰疹病毒(antiherpessimplexvirus)的抗體、針對(duì)癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)的抗體、利用植物病毒載體侵染煙草瞬時(shí)表達(dá)淋巴瘤特異的疫苗等植物抗體全面用于診斷和治療需要解決的主要問(wèn)題包括產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量、下游純化工藝、糖基化等。通過(guò)調(diào)節(jié)表達(dá)元件、優(yōu)化密碼子以及提高抗體的穩(wěn)定性可提高

7、表達(dá)系統(tǒng)中重組抗體的積累水平。重組蛋白在植物體內(nèi)的糖基化(glycosylation)方式與在人體內(nèi)不同，這一問(wèn)題近年來(lái)引起人們的關(guān)注，因?yàn)椴煌Ｊ降奶腔瘯?huì)對(duì)人體形成免疫原性。一些專門(mén)的研究工作就是針對(duì)如何消除這種免疫原性的，如在不需要糖基化仍具有抗體活性的情況下，將抗體中有關(guān)植物N-糖基化的識(shí)別序列去除。對(duì)于高爾基體介導(dǎo)的糖基化，只要在抗體的C末端附加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽KDEL，就可避免糖基化。另一種非常理想的方法是將植物糖基化方式轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合人體的糖基化，如將人的-1,4-乳糖基轉(zhuǎn)移酶（galactosyltransferase）轉(zhuǎn)化煙草，然后再與表達(dá)鼠抗體的煙草雜交，其后代產(chǎn)生的抗體就完全

8、適合于人體了。這有助于消除對(duì)植物抗體作為人類藥物可能存在免疫原性和致敏性等問(wèn)題的憂慮。而且人類食物中普遍存在植物糖蛋白,因此對(duì)多數(shù)人而言,植物抗體的應(yīng)用不會(huì)存在危險(xiǎn)。2/62、口服疫苗轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗的前景非常誘人。在植物組織內(nèi)合成某種致病原的關(guān)鍵免疫原性蛋白,然后作為可口服的亞單位疫苗給人和牲畜服用,人或動(dòng)物的體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,具有抵抗該致病原的能力。迄今為止,在植物中表達(dá)用于疫苗研究的病原基因主要有乙肝疫苗、大腸桿菌熱敏腸毒素B亞單位(LTB)基因、霍亂弧菌毒素B亞單位(CTB)基因、Norwalk病毒衣殼蛋白疫苗、豬傳染性胃腸炎病毒S糖蛋白(TGEVS)基因、口蹄疫病毒VP1

9、蛋白(MDVVP1)基因、狂犬病病毒G蛋白基因、兔出血病病毒(RHDV)VP60蛋白基因等。另外結(jié)核桿菌分泌蛋白MPT64基因在胡蘿卜中獲得了表達(dá),輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白vp4、vp7基因分別在馬鈴薯中獲得了表達(dá)。與注射疫苗相比,口服疫苗成本低、便于管理,是一種很有市場(chǎng)前景的大眾免疫防護(hù)方式?？诜呙邕€能夠提高黏膜免疫力,提高對(duì)通過(guò)黏膜表皮進(jìn)入人體的傳染性因子的抵抗能力。目前對(duì)于口服疫苗的主要憂慮在于:蛋白質(zhì)成分在胃腸中的降解是否在引發(fā)免疫反應(yīng)之前。為了防止降解,人們利用重組微生物,脂質(zhì)體以及轉(zhuǎn)基因植物組織運(yùn)送這些蛋白質(zhì),使這些蛋白質(zhì)能夠完整地到達(dá)腸部,引發(fā)免疫反應(yīng)。目前已開(kāi)發(fā)了幾種有效的制劑，如生

10、物膠丸。另外，表達(dá)水平一直是關(guān)注的焦點(diǎn)。在現(xiàn)有的研究中,外源基因所表達(dá)的重組蛋白大約只占植物中可溶性蛋白的0.01%0.37%,即使以高表達(dá)量者為標(biāo)準(zhǔn),此表達(dá)量作為疫苗仍然很低。那么如何提高轉(zhuǎn)基因植物的抗原蛋白產(chǎn)量?針對(duì)這一問(wèn)題,解決方法是通過(guò)對(duì)目的基因的修飾，如附加先導(dǎo)序列和poly（A）信號(hào)、優(yōu)化密碼子以適應(yīng)植物系統(tǒng)或通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物與各種遺傳背景雜交，都可提高表達(dá)水平。表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位也很重要，關(guān)系到轉(zhuǎn)譯后加工及產(chǎn)品的穩(wěn)定性。對(duì)于亞單位疫苗而言,適宜表達(dá)部位是細(xì)胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體。人們還將疫苗基因與植物病毒表面蛋白基因融合構(gòu)成瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),也得到了較高的表達(dá)水平。還有一個(gè)相關(guān)

11、的策略是用來(lái)抵抗自身免疫疾病:利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)自身抗原作為口服疫苗,服用較大劑量的自身免疫原產(chǎn)生免疫耐受,進(jìn)而達(dá)到抑制自身免疫疾病的發(fā)生。這一策略已經(jīng)在治療糖尿病的小鼠模型中獲得了成功。3、其他蛋白質(zhì)生產(chǎn)具有藥學(xué)活性的植物蛋白和多肽是近年來(lái)轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用的另一迅速發(fā)展的領(lǐng)域。大量研究表明，人體內(nèi)含量甚微但具有重要臨床價(jià)值的蛋白或多肽也可在植物系統(tǒng)中表達(dá)。如人生長(zhǎng)激素、人血清白蛋白、人干擾素、人蛋白C、人表皮生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、脂肪酶、乳鐵蛋白、水蛭素、膠原蛋白等。目前生產(chǎn)實(shí)踐中面臨的主要問(wèn)題仍是表達(dá)水平過(guò)低。編碼人源蛋白質(zhì)的基因在植物中的表達(dá)量很低:人血清白蛋白(humanserumal

12、bumin)占植物TSP的0.020%；人蛋白C(humanproteinC)占0.001%；紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)占0.003%；人干擾素(human3/6interferon-)不到0.001%(鮮重)。人工合成的人表皮生長(zhǎng)因子(humanepidermalgrowthfactor)基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)量?jī)H達(dá)到TSP的0.001%。一般來(lái)說(shuō)，在臨床應(yīng)用中需要純化的重組蛋白表達(dá)量應(yīng)占轉(zhuǎn)化細(xì)胞TSP的1%以上時(shí)才具有商業(yè)價(jià)值。因此,真正用于生產(chǎn)還需做大量工作。為了進(jìn)一步提高人源蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,人們采用的策略:(1)希望在葉綠體內(nèi)合成復(fù)雜的需要翻譯后修

13、飾的或亞基裝配的真核蛋白質(zhì),如sIgA；在高等植物葉綠體中表達(dá)外源基因是一種可供選擇的轉(zhuǎn)基因體系。整合到煙草葉綠體基因組中的外源基因拷貝數(shù)能夠達(dá)到每個(gè)細(xì)胞10000個(gè)拷貝,相應(yīng)的重組蛋白占全部可溶性蛋白的比例也提高到47%；(2)蛋白質(zhì)靶向定位:重組抗體不在細(xì)胞質(zhì)中而是靶向定位在離質(zhì)體(apoplast)的表達(dá)策略明顯提高了重組抗體的產(chǎn)量；靶向定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重組蛋白的表達(dá)水平提高了10100倍；(3)植物中遺傳密碼子的使用頻率與動(dòng)物不同,對(duì)外源基因的一些密碼子進(jìn)行替換能夠顯著提高該基因在植物體內(nèi)的表達(dá)水平；(4)使用組織特異啟動(dòng)子和病毒序列能夠提高基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平；(5)在擬南芥中生產(chǎn)豆類

14、arcelin,同時(shí)表達(dá)種子儲(chǔ)存蛋白清蛋白(albumin)2S的反義基因,結(jié)果使得arcelin的表達(dá)量達(dá)到種子總蛋白的24%,利用相似的策略有助于顯著提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。藥用蛋白的表達(dá)策略在植物中生產(chǎn)藥物蛋白主要通過(guò)兩個(gè)途徑：第一條途徑是利用土壤桿菌或農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、粒子轟擊法或其他標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)，來(lái)培育穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。這一途徑科學(xué)家作了許多研究工作。1989年美國(guó)Scripps研究所分別克隆了抗體的重鏈和輕鏈基因，并導(dǎo)入煙草中，子代煙草葉片中抗體表達(dá)量達(dá)葉片總蛋白的1.3%，隨后白細(xì)胞介素、血清白蛋白、二氫吡啶羧酸合成酶等都成功地在煙草中得到表達(dá)

15、。在疫苗方面，霍亂毒素蛋白、乙型肝炎抗原、狂犬病抗原、Norwalk病毒外殼蛋白、瘧疾抗原及口蹄疫抗原VP1均在不同的轉(zhuǎn)基因植物中得到表達(dá)。用這些轉(zhuǎn)基因植物或植物的提取物飼喂小鼠，可以在小鼠體內(nèi)引發(fā)一定的免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出對(duì)相應(yīng)病毒的抗病力，也就是說(shuō)，這些轉(zhuǎn)基因植物作為飼料對(duì)小鼠有強(qiáng)的免疫作用。美國(guó)得克薩斯州ProdiGene公司利用轉(zhuǎn)基因玉M來(lái)表達(dá)病毒的抗原，首次生產(chǎn)了一種可食疫苗。該可食疫苗生產(chǎn)的資金和人力投入都比較少。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將這種丸狀或粉末狀的疫苗飼服動(dòng)物，可使其抵抗病毒感染。該可食疫苗已獲得美國(guó)專利，并將在美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的兩三年后投入商品化生產(chǎn)。由于這種疫苗價(jià)格低廉、使用方便，因

16、而擁有很好的市場(chǎng)前景。盡管在利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白等方面取得了很大的成績(jī)，但科學(xué)家們?nèi)匀挥龅搅送庠椿虮磉_(dá)水平低的困難，于是科學(xué)家們又開(kāi)發(fā)了另一條途徑，通過(guò)植物病毒作為載體，重組病毒感染植株，使其在復(fù)制時(shí)將轉(zhuǎn)移基因表達(dá)于宿主，瞬時(shí)高效表達(dá)大量外源蛋白，這是農(nóng)桿菌等表達(dá)系統(tǒng)所不能做到的，它已成為轉(zhuǎn)化植物生產(chǎn)藥用蛋白等的重要方向。植物病毒作為瞬時(shí)表達(dá)載體具有許多優(yōu)點(diǎn)：4/6首先是病毒增殖水平較高，可使伴隨的外源基因有高水平表達(dá)，相對(duì)于基因遺傳轉(zhuǎn)化，其表達(dá)量高達(dá)100多倍。其次，病毒增殖速度快，外源基因在較短的時(shí)間內(nèi)，通常在接種后12周以內(nèi)就可達(dá)到最大量的積累。第三，植物病毒的基因組很小，易于進(jìn)

17、行遺傳操作。而大多數(shù)植物病毒可以通過(guò)機(jī)械接種感染植物，這樣適于大規(guī)模的商業(yè)操作。第四，植物病毒可以侵染單子葉等農(nóng)桿菌的非寄主植物，擴(kuò)大了基因工程的適用范圍。另外，植物病毒主要是利用植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行繁殖，可以使伴隨表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行真核生物特有的修飾如翻譯后加工和糖基化，這也是大腸桿菌和酵母等表達(dá)系統(tǒng)所不能的。國(guó)內(nèi)外不少實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展這方面的研究，已有十幾種植物病毒被改造成不同類型的外源蛋白表達(dá)載體，包括花椰菜花葉病毒（CaMV）、煙草花葉病毒（TMV）和豇豆花葉病毒（CPMV）等，其中超過(guò)150多種蛋白多肽在TMV載體中成功表達(dá)。如美國(guó)科學(xué)家在TMV中插入指導(dǎo)合成血紅蛋白和其它蛋白質(zhì)的基因，

18、使用葉片切刀和滴管把這種重組病毒引入植物葉片，在兩周之內(nèi)所有葉片便感染病毒，并開(kāi)始制造目的蛋白質(zhì)。運(yùn)用同樣的思想方法，英國(guó)劍橋的農(nóng)業(yè)基因公司最近宣布已成功地在植物中生產(chǎn)動(dòng)物疫苗。他們將口蹄疫苗（FMDV）和艾滋病病毒（HIVl）的表面蛋白導(dǎo)入植物病毒載體豇豆花葉病毒（CPMV）基因組，CPMV的分子結(jié)構(gòu)顯示構(gòu)成外殼蛋白之一的S蛋白的BC環(huán)編碼區(qū)中有單個(gè)插入位點(diǎn)，F(xiàn)MDV和HIV1核酸序列可插入該位點(diǎn)，且不改變由FMDV抗原決定基因的讀碼框。用機(jī)械方式接種豇豆植株，10d（天）后，接種過(guò)的植株顯示已被野生型CPMV侵染相同的癥狀。檢測(cè)表明，雜合RNA指導(dǎo)產(chǎn)生了完整的病毒粒子，據(jù)估算，一片豇豆葉足以產(chǎn)生200劑疫苗所需的病毒。這些實(shí)驗(yàn)的成功，無(wú)疑為極大降低治療艾滋病等疑難病癥的成本提供了可能性。用植物病毒做載體生產(chǎn)藥用蛋白為生物技術(shù)開(kāi)辟了新的領(lǐng)域，極有希望成為藥用蛋白的主要來(lái)源和生產(chǎn)方法。因此許多發(fā)達(dá)國(guó)家爭(zhēng)相研究，一旦有所突破，立即在世界范圍內(nèi)申請(qǐng)專利權(quán)，因?yàn)檫@項(xiàng)技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室走向商業(yè)化生產(chǎn)后，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。還有可能產(chǎn)生新的壟斷！問(wèn)題及展望研究及應(yīng)用植物生物反應(yīng)器首先要解決