丹參酮IIA在卟啉單胞菌屬感染的載脂蛋白E敲除的小鼠中減弱動(dòng)脈粥樣硬化的形成

1、丹參酮IIA在卟啉單胞菌屬感染的載脂蛋白E敲除的小鼠中減弱動(dòng)脈粥樣硬化的 形成丹參酮IIA（ TSA），一種從丹參中分離的藥物活性成分，由于它的抗炎，抗氧 化和抗脂肪形成的作用可能預(yù)防心血管疾病。口卜啉單胞菌，一種主要的牙周病原 體，可能有助于動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。這里，我們研究研究TSA對(duì)于感染卟啉 單胞菌的ApoE-/-小鼠中動(dòng)脈粥樣硬化的作用。8周大的ApoE-/-小鼠被隨機(jī) 分為3 ）磷酸鹽緩沖液（PBS）,（b）卟啉單胞菌組和（c）卟啉單胞菌+TSA（60mgkg-1day-1 ）組。這些小鼠被注射（a ） PBS ,或（b ）和（c ）卟啉單 胞菌每周3次，總共10次。8周后，在血清

2、中動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)因素，和在 心臟動(dòng)脈和肝臟組織中對(duì)所有小鼠用油紅O動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞因子抗體實(shí)驗(yàn)， 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），實(shí)時(shí)PCR和microRNA陣列技術(shù)進(jìn)行分析。在 動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞因子抗體實(shí)驗(yàn)中,CD40 ,G-CSF ,IFN-y ,IL-邛,IL-6 ,MCP-1 , MIP-3a , TNF-a和VEGF通過(guò)TSA減弱。在ELISA數(shù)據(jù)中，TSA處理小鼠顯 示 CRP , ox-LDL , IL-1p , IL-6 , IL-12 和 TNF-a明顯減少。實(shí)時(shí)定量 PCR 分 析顯示在心臟和主動(dòng)脈組織中，TSA減少CCL-2 , CD40 , IL-邛,IL-6 ,

3、TNF- a，和MMP-2的表達(dá)。此外，肝臟CRP被TSA下調(diào)，盡管FASN和HMG-CoA 不可以。miR-146b和miR-155的相關(guān)表達(dá)通過(guò)卟啉單胞菌上調(diào)和通過(guò)TSA治 療下調(diào)。動(dòng)脈粥樣硬化是世界上最常見(jiàn)的一種多因素的致死性心血管疾病。其特征是內(nèi)膜 內(nèi)的脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)。炎癥和氧化應(yīng)激被認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和斑塊 形成中起著關(guān)鍵作用。牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，導(dǎo)致牙齒支持組織的破壞， 包括牙槽骨和牙周韌帶的吸收，最終導(dǎo)致牙齒喪失。牙周炎與全身性疾病如心血 管疾病、糖尿病和骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。此外，流行病學(xué)的研究表明，牙周炎與動(dòng)脈 粥樣硬化關(guān)系密切，與牙周致病菌與心血管疾病的發(fā)病正相

4、關(guān)。卟啉單胞菌屬（P. gingivalis）是一種革蘭氏陰性，無(wú)鞭毛，厭氧菌。它不 僅是與慢性牙周炎相關(guān)的最重要的病原體之一，而且也是動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)重 要危險(xiǎn)因素。牙齦卟啉單胞菌感染可增加炎癥標(biāo)志物；病原體侵入血管平滑肌細(xì) 胞和內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。以前的研究已經(jīng)表明，P. gingivalis 感染可激活響應(yīng)P. gingivalis加速動(dòng)脈粥樣硬化炎癥介質(zhì)。丹參酮IIA（ TSA）是一個(gè)從丹參中分離的主要的生物活性脂溶性成分，這 是中藥丹參根（圖1）。TSA被發(fā)現(xiàn)有心臟保護(hù)和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，由于 其抗氧化，抗炎和抗脂質(zhì)沉積的影響。TSA具有抗氧化作用，通過(guò)減少血管氧

5、化 應(yīng)激、抑制血小板聚集和保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受動(dòng)脈硬化的影響。最近指出，TSA 對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。因此，本研究的目的是探討TSA抑制載脂蛋白E基因敲除P. gingivalis致 動(dòng)脈粥樣硬化（ApoE -/-）小鼠，并觀察在血清和心臟，與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān) 因子表達(dá)的主動(dòng)脈和肝臟組織，以評(píng)估可能的抗炎和TSA的抗氧化作用。由于 載脂蛋白E缺乏，先天缺陷影響脂質(zhì)代謝，在某些條件下（如病原體感染）， ApoE -/小鼠更易患動(dòng)脈硬化癥，這與飲食無(wú)關(guān)。由于高脂飲食可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣 硬化本身，正常飲食中使用這些小鼠避免混雜因素。材料和方法細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)的牙齦卟啉單胞菌FDC381在厭氧

6、環(huán)境下培養(yǎng)（80%氮?dú)猓?0%的二 氧化碳，10%氫氣）5%綿羊血瓊脂平板（Oxoid公司厭氧基底，英國(guó)）在37C 3-5天。培養(yǎng)物接種到腦心浸液肉湯（Oxoid公司，英國(guó)）5 pg/mL的血紅素 和0.4pg/mL的甲萘醌（美國(guó)），在37生長(zhǎng)2天直到它們達(dá)到每1.0相對(duì)應(yīng) 每109CFUmL的600nm的密度。細(xì)菌懸浮再4C, 8000轉(zhuǎn)20分鐘并用PBS 稀釋。小鼠和處理六周齡的雄性ApoE -/-小鼠（C57BL / 6）是從Vital River公司購(gòu)買(mǎi)，（北 京，中國(guó)）和安置無(wú)特定病原體的條件下。他們用無(wú)菌蒸餾水自由采食食物。機(jī) 構(gòu)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物保護(hù)和利用委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)研究（批

7、準(zhǔn)號(hào)la201464 ）。 經(jīng)過(guò)2周后，將小鼠隨機(jī)分為三組（n = 8 /組）：（a）ApoE -/-+ PBS ,（ b ） ApoE -/- +牙齦卟啉單胞菌，和（c ） ApoE -/-+牙齦卟啉單胞菌+ TSA。小鼠靜 脈注射接種10次，三次/周，以（a）PBS（100微升/只）或（b ）和（c ）牙齦 卟啉單胞菌（108 CFU 100p L-1 /只）。組（C ）, TSA （西格瑪奧德里奇，美 國(guó)）溶于0.5%羧甲基纖維素（CMC ；西格瑪奧德里奇，美國(guó)）口服灌胃劑量為 60 mg kg-1，先前所描述的。在16周的時(shí)間內(nèi)，處死小鼠收集血液和組織樣 本。組織準(zhǔn)備小鼠繼續(xù)接受正常的

8、食物和蒸餾水，不論是否使用TSA，直到16周齡。所 有小鼠處死腹腔注射戊巴比妥鈉（100 pg pL-1,默克，德國(guó)）。血液樣品經(jīng) 眶下穿刺收集血清以離心分離法在10000轉(zhuǎn)5分鐘在4C,心臟和主動(dòng)脈灌注 肝素冰PBS 0.9%左心室10分鐘的心臟部件（包括主動(dòng)脈根部）仔細(xì)解剖，嵌 入式OCT復(fù)合（組織Torrance, CA，美國(guó)，德安，），和冰凍切片。肝臟迅速?gòu)男∈篌w內(nèi)取出，放在液態(tài)氮中，并保持在-80C。油紅O染色冰凍切片的主動(dòng)脈竇進(jìn)行油紅O染色。測(cè)量后paigen等人的改性方法是動(dòng) 脈粥樣硬化病變。每一部分都被光學(xué)顯微鏡（尼康Eclipse CI，日本）和數(shù)碼相 機(jī)（奧林巴斯Q 顏色5

9、，日本）捕獲?？偲p面積和主動(dòng)脈管腔病變每段所占 百分比（5微米厚）采用Image-Pro Plus 6軟件計(jì)算（Media Cybernetics， 美國(guó)）。15部分為動(dòng)物的值的平均值，表示為每段每只動(dòng)物的主動(dòng)脈管腔病變 占百分比?？贵w實(shí)驗(yàn)血清樣品用小鼠動(dòng)脈粥樣硬化抗體芯片C1分析（RayBiotech，美國(guó)），由22 個(gè)不同的動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞因子抗體，按照制造商的建議如先前所描述的。 使用vilber lourmat融合FX系統(tǒng)測(cè)定點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度（Marne la Vall Cedex， 法國(guó)）以小鼠動(dòng)脈粥樣硬化因子定量分析軟件。六個(gè)陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)用于確定膜的方 向，并使不同膜的結(jié)果正?；?/p>

10、表1）。每個(gè)點(diǎn)的凈光密度水平是從總的光密度 減去背景光水平來(lái)確定的，每個(gè)細(xì)胞因子的水平代表陽(yáng)性控制的百分比。檢查細(xì) 胞因子的列表見(jiàn)表1。細(xì)胞因子ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒定量血清白細(xì)胞介素-1（ IL-1）、白細(xì)胞介 素-6（ IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF- a）（ RayBiotech美國(guó)）；白細(xì)胞介素-12 （IL-12）（ eBioscience、美國(guó)）；和C反應(yīng)蛋白（CRP）（慈生物科技公司， 美國(guó)）。ELISA試劑盒也被用來(lái)量化氧化低密度脂蛋白（LDL）（ Cusabio，中 國(guó)），高密度脂蛋白（HDL）（慈生物科學(xué)，美國(guó)），和低密度脂蛋白（LDL） 和極低密

11、度脂蛋白（VLDL）（慈生物科學(xué)，美國(guó)）。定量實(shí)時(shí)PCR 從心臟、主動(dòng)脈純化總RNA，用試劑盒提取肝組織纖維組織（Qiagen公司， 美國(guó)）和試劑加試劑盒（Qiagen公司，美國(guó)）。以下采用PrimeScript RT Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄（Takara Bio，日本）產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA（ cDNA），實(shí)時(shí)定 量聚合酶鏈反應(yīng)PCR冷析使用應(yīng)用Biosystems 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng):Life Technologies，美國(guó)）按照制造商的協(xié)議。簡(jiǎn)單的反應(yīng)，包含2xSYBR Green（Takara生物、日本），100 nm的每個(gè)引物和30ng的逆轉(zhuǎn)錄的RNA。PCR 條件為95

12、C30s , 95C5s , 60C34s , 40循環(huán)。解離曲線分析證實(shí)特異性。每 個(gè)基因測(cè)試，一式三份，與靶RNA水平正?；?-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH ） 信使RNA （ mRNA ）。引物序列如表2所示。MicroRNA實(shí)驗(yàn)和定量實(shí)時(shí)PCRMicroRNA （ miRNA ）使用miRcute miRNA分離試劑盒分離的小鼠的心臟部 位（Tiangen、中國(guó)），根據(jù)制造商的說(shuō)明。miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄使用mircute miRNA cDNA第一鏈cDNA合成試劑盒（Tiangen，中國(guó)）。miRcute miRNA 定量檢測(cè)試劑盒（SYBR Green、Tiangen、中國(guó)）和轉(zhuǎn)錄和

13、TaqMan mRNA 的檢測(cè)引物和TaqMan miR-146b miR-155 （ Tiangen、中國(guó)）用于實(shí)時(shí)定量 RT-PCR分析。反應(yīng)使用Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行（Life Technologies，美國(guó)），并顯示閾值周期（Ct） 35的患者被排除在分析之外。 通過(guò)使用snoRNA234通過(guò)2-ct相對(duì)定量方法。一種內(nèi)源性miRNA控制計(jì) 算值的表達(dá)式。將miRNA的表達(dá)分析為折疊變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有結(jié)果均以平均士標(biāo)準(zhǔn)差（SD ）表示。數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)或方差分析，隨后Tukey Kramer多次試驗(yàn)分析。SPSS 16

14、 (IBM、美國(guó))用于分析。P0.05認(rèn)為有顯著意義。結(jié)果在主動(dòng)脈竇的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊在主動(dòng)脈竇的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊冰凍切片進(jìn)行油紅O染色。對(duì)近端主動(dòng)脈 粥樣硬化斑塊占管腔的比，P.gingivalis處理小鼠比PBS接種小鼠更高(圖2A , B , PBS : 5.992.02%vs.牙齦卟啉單胞菌：10.541.78% ; P 0.01 )。與此 相反，TSA處理組提出的小P. gingivalis感染弓I起的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊(圖2A , B，牙齦卟啉單胞菌：10.541.78%vs.牙齦卟啉單胞菌+TSA : 8.711.66% , P 0.05 )。在血清中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子探討TSA

15、抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，應(yīng)用小鼠動(dòng)脈粥樣硬化抗體芯片C1測(cè)定 血清動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因素。牙齦卟啉單胞菌的處理增加血清堿性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(bFGF )( P 0.05 ),CD40(P 0.01)，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(P 0.01),干擾素-Y (IFN-y )( P 0.05 ), IL-1。( P 0.05 ), IL-6 ( P 0.05 )，調(diào)節(jié) 活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES )(P 0.01)，腫瘤壞死因子(TNF- a ) (P 0.01)，和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) (P 0.01 )與PBS接種小鼠。 bFGF的表達(dá)(P 0.05 ), CD40( P

16、0.01)，嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(P 0.01)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(P0.05)，干擾素-y (P0.01), IL-1P ( P 0.01), IL-6 ( P 0.01)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1 ( MCP-1 )(P 0.01)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)(P0.01)，趨化因子(P0.05)，腫瘤 壞死因子(P 0.05 )，與VEGF的表達(dá)(P 0.01)減少在TSA處理的小鼠與牙齦卟啉單胞菌攻擊小鼠相比(圖3)。血清中的炎癥細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激標(biāo)志物不同人群中檢測(cè)血清Cytokine ELISA炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激標(biāo)志物，與表征 的動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素的大小的關(guān)系。相

17、比于PBS的牙齦口卜啉單胞菌接種小 鼠，P.gingivalis處理小鼠表現(xiàn)出高水平的IL-1 (圖4A , 240.635 vs. 124.7 50.4 pgmL-1 ,P0.01)，白細(xì)胞介素-6(圖4B ,287.985.5 vs. 146.441.2 pg mL-1 , P 0.01)，腫瘤壞死因子(圖 4C , 767.8101.2vs.600.339.1 pg mL-1 , P 0.01), CRP (圖 4E , 615.657.7 vs. 451.222 pg L-1, P 0.01 )、氧化低密度脂蛋白(圖 4F ,7.61 vs. 5.30.4 pmol mL-1 ,P0.

18、01), 高密度脂蛋白(圖 4g 57.43.9vs.71.914.8 pmol mL-1 ,P0.05) ,LDL/VLDL (圖 4h , 32.45.2vs.25.47.6pmol mL-1 , P 0.05 )。與此相反，TSA 處理降低 IL-1 p (圖 4A , 197.6 33.6 vs. 240.6 35 pg mL-1 , P0.05 )，白細(xì)胞介素-6 (圖 4B , 191.984.3 vs. 287.985.5 pg mL-1 , P 0.05 )，腫瘤壞死因子(圖 4C , 630.9101.7 vs. 767.8101.2 pg mL-1 , P 0.05 )、I

19、L-12(圖 4D , 1116 vs. 128.117 pg mL-1 , P 0.05 ), CRP (圖 4E , 493.139.5 vs. 615.6 57.7 g L-1 , P 0.01)、氧化低密度脂 蛋白(圖 4F , 6.40.9 vs. 7.61 mol mL-1 , P 0.05)，高密度脂蛋白(圖 4g 678.3 比 57.43.9 mol mL-1 , P 0.05 )。心臟，主動(dòng)脈和肝臟組織的炎性細(xì)胞因子和氧化介質(zhì)在牙齦卟啉單胞菌感染激活的動(dòng)脈粥樣硬化中，檢查參與各種炎癥與氧化介 質(zhì)，在心臟、主動(dòng)脈、肝組織實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)炎性細(xì)胞因子和氧化標(biāo)記基因 表達(dá)。在心

20、臟組織中，牙齦卟啉單胞菌感染升高CCL-2表達(dá)(P v 0.01) , CD40 (Pv0.01) ,IL-1p( P0.01) ,IL-6( Pv0.01)，腫瘤壞死因子(Pv0.01), 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2 )(P 0.01)，與MMP-9 ( P 0.05 )，以及氧化 介質(zhì)凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(LOX-1)( P 0.05 )和環(huán)氧化酶-2 (COX-2 )(P 0.05)，與PBS對(duì)照組小鼠。相反，該TSA處理組顯著降低 (P 0.05 表達(dá) CCL-2 )、CD40 ( P 0.05 ), IL-邛(P 0.05 ), IL-6 ( P 0.05 )，腫瘤壞死因子(

21、P0.05)，與 MMP-2 ( P0.01)(圖 5A )。在主動(dòng)脈(圖 5B),P. gingivalis 誘導(dǎo) CCL-2 表達(dá)增加(P 0.01), CD40 (P0.01) ,IL-1p( P0.01) ,IL-6( P0.01)，腫瘤壞死因子(P0.01), MMP-2( P0.05 ) ,MMP-9( P0.05 ) , LOX-1( P 0.01)，但沒(méi)有 COX-2。 相比于牙齦卟啉單胞菌的處理組、TSA處理降低CCL-2表達(dá)(P0.05) ,CD40 (P0.05 ) ,IL-邛(P0.05 ) ,IL-6( P0.05 )，腫瘤壞死因子(P0.05), 與 MMP-2 (

22、 P0.05 )。另外，雖然TSA處理顯著降低牙齦卟啉單胞菌感染組CRP的表達(dá)(P0.05) 的活性，從肝臟樣品觀察牙齦卟啉單胞菌處理組和TSA處理之間組脂肪酸合酶 (FASN )和 3hydroxy-3-methylglutaryl 輔酶 A ( HMG-CoA )均無(wú)顯著差異 (圖 5c )。在心臟組織中的microRNA的表達(dá)ApoE缺乏伴有牙齦卟啉單胞菌感染小鼠 miR-146b的相對(duì)表達(dá)增加(P 0.01），并下調(diào)在心臟組織TSA處理（P v 0.01 ）。同樣，miR-155的相對(duì)表 達(dá)顯示出牙齦卟啉單胞菌明顯增加小鼠（P v 0.01），然后通過(guò)TSA顯著下降（P 0.05）（圖

23、 6）。討論P(yáng). gingivalis是參與牙周疾病的炎癥反應(yīng)的主要致病菌。牙齦口卜啉單胞菌感染引 起的炎癥反應(yīng)，也通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。許多研究表 明，牙齦卟啉單胞菌感染加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，在人類和動(dòng)物模型。此外， 研究表明,Pgingivalis不僅侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞但也激活免疫細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞、 T細(xì)胞和單核細(xì)胞，誘導(dǎo)心血管系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。因此，目前的研究表明，牙齦卟啉單胞菌感染加速ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬 化斑塊發(fā)展，并認(rèn)為血清動(dòng)脈粥樣硬化因子bFGF、嗜酸性細(xì)胞活化趨化因子-1、 G-CSF、MCP-1、MIP、IFN-y、IL-1、IL-6、TNF-a、V

24、EGF、CD40、和 RANTES 增加，與PBS處理小鼠相比。此外，炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-12和TNF- a血清水平，和炎癥標(biāo)志物 CRP 和 IL-6 ,IL-1、TNF-a、CRP、MMP-2、MMP-9、 CCL-2 , CD40的mRNA表達(dá)的，在心臟和主動(dòng)脈組織中牙齦卟啉單胞菌小鼠 中增加。另一方面，氧化介質(zhì)ox-LDL, LDL / VLDL,LOX-1、COX-2、FASN、 HMG-CoA只是輕微上調(diào)牙齦卟啉單胞菌感染。此外對(duì)miR-146b和miR-155 的相對(duì)表達(dá)呈顯著增加小鼠牙齦卟啉單胞菌。許多研究表明，Pgingivalis可以 增加炎癥介質(zhì)IL-1

25、、IL-6、IL-12、TNF-a、MCP-1和加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。 牙齦卟啉單胞菌的侵襲也上調(diào)M-CSF、G-CSF、IFN-y、IL-1、IL-13、CD40、 RANTES、CRP、MMP-2和MMP-9 ,誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬 化病變的形成。近日，Pgingivalis已被證明在兔子模型中，通過(guò)核因子-kB（ NFKB ）, P65 , p38 MAPK和 JNK信號(hào)通路激活 TLR-2、TLR-4、TNF-a、CRP、IL-6、MMP-9和MCP-1表達(dá)。另一方面，一些報(bào)告表明，牙齦卟啉單胞菌加重ox-LDL和TNF -a誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和與LDL-C水平呈正相關(guān)

26、。我們以前 的研究也表明，在ApoE -/-小鼠中牙齦卟啉單胞菌感染與高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈 粥樣硬化病變和高表達(dá)的炎性細(xì)胞因子和氧化介質(zhì)。格羅爾在一項(xiàng)動(dòng)物研究發(fā) 現(xiàn)，在主動(dòng)脈高膽固醇飲食的野生型C57BL / 6小鼠，牙齦卟啉單胞菌升高 ICAM-1 ,VCAM-1 ,LOX-1 和 TLR4 的表達(dá)。此外，P. gingivalis 脂多糖（LPS ） 增加在ApoE -/-小鼠中COX-2 mRNA的表達(dá)?？傊?，P. gingivalis和它的毒 力因素在炎癥和氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要的作用，并且加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。丹參被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)對(duì)心血管疾病如心肌梗死（MI）,動(dòng)脈粥樣硬化和血 栓閉塞性

27、脈管炎的治療。TSA是丹參的的主要成分，具有抗炎、抗氧化和心臟 保護(hù)作用。藥物名為傅芳丹神是中國(guó)藥典上市并在慢性穩(wěn)定型心絞痛患者已完 成III期臨床試驗(yàn)的療效和安全性（第nct01659580 ）。大多數(shù)研究揭示了 TSA對(duì)心血管疾病的抗氧化作用，但對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抗炎作用研究有限。有 了這個(gè)目標(biāo)，目前的研究表明，Pgingivalis加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，而這 可以通過(guò)TSA處理防止。在這項(xiàng)研究中，TSA抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展，ApoE -/-小鼠與減 少炎癥標(biāo)志物 CRP、IL-6、IL-1、IL-12、MMP-2、MMP-9 , CCL-2、CD40、 TNF-a ,和在牙齦卟啉單

28、胞菌攻擊小鼠中，稍微降低氧化介質(zhì)氧化低密度脂蛋 白、COX-2和LOX-1。先前的研究表明，ApoE-/-小鼠TSA通過(guò)下調(diào)清道夫 受體降低血清ox-LDL水平氧化低密度脂蛋白，即清道夫受體A （ SR-A ）和 CD36。其他研究也表明，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)減弱LDL誘導(dǎo)的ICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及MMP-9的影響穩(wěn)定斑塊。TSA可以下調(diào)ox-LDL通過(guò)LOX-1表達(dá)的抑制作用，這可能有助于改善動(dòng)脈粥樣硬化，支持本研究。TSA 不影響血脂水平降低HDL亞組分中的水平和增加高密度脂蛋白亞組分水平。 另一方面，TSA對(duì)相關(guān)因素HMGCoA和FASN脂質(zhì)合成無(wú)影響。參與調(diào)節(jié) 脂質(zhì)代謝的酶有很多

29、種，但目前僅對(duì)其中兩種進(jìn)行了研究。未來(lái)的工作應(yīng)該研 究TSA對(duì)合成脂類的一系列綜合酶的影響。血清CRP與LOX-1和氧化型低 密度脂蛋白的相互作用參與了血管內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的。促炎 細(xì)胞因子，如TNF-a、CRP，IL-1，可以增加LOX-1表達(dá)，這也增加了牙齦 卟啉單胞菌感染和下調(diào)TSA在本研究。另一項(xiàng)研究表明，TSA可以削弱oxLDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和MMP-9的表達(dá)刺激的影響。我們的數(shù)據(jù)一致， TSA 調(diào)節(jié) IL-1、IL-6、TNF-a、CD40、ICAM-1 和 VCAM-1 的表達(dá)，均由 NF-k B調(diào)節(jié)和血管內(nèi)皮功能障礙的單核/巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)相關(guān)。此外，徐

30、等人還 透露，在ApoE -/-小鼠中TSA能明顯抑制NF-kB的表達(dá)，以及減少炎癥因 子MCP-1、IL-6、TNF-a。在H2O2損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）株 中，TSA是炎癥過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段。在ApoE -/-牙齦卟啉單胞菌感染小鼠中通過(guò)我們的研究也證實(shí)了 IL-12和IFN-y的表 達(dá)是由TSA在LPS刺激巨噬細(xì)胞的強(qiáng)烈抑制。MMPs促進(jìn)炎癥在受傷的血管壁的T細(xì)胞，巨噬細(xì)的浸潤(rùn)。特別是， MMP-2和MMP-9的已被確定為在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和穩(wěn)定性中主要的 蛋白酶降解膠原。TSA抑制高脂飲食兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中 MMP-2和 MMP-9的表達(dá)

31、/活性。在本研究中，我們證明TSA降低MMP-2的水平而不 影響心臟和主動(dòng)脈組織中MMP-9的表達(dá)。方等人表明在腎性高血壓大鼠中 TSA在高劑量(70 mg kg-1d-1)，對(duì)MMP-9基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。我 們推測(cè)，TSA 60 mg kg-1天能通過(guò)抗炎作用減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。臨床 研究報(bào)告說(shuō)，心血管疾病患者血液中的miRNA水平顯著改變。miR-146a / b 單核細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈影響受炎癥刺激，如通過(guò)NF-kB依賴機(jī)制LPS。研究表明miR-146b被內(nèi)皮細(xì)胞暴露于促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并通過(guò) ox-LDL miR-155表達(dá)來(lái)調(diào)控泡沫細(xì)胞的形成；在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展發(fā)揮了至 關(guān)重要

32、的作用。miR-155表達(dá)在單核細(xì)胞顯示出最明顯的變化在LPS、IFN- Y、TNF-a刺激或在一個(gè)NF-kB方式與對(duì)TNF-a的生產(chǎn)的作用相反。另一方 面，miR-155可以提高翻譯因子通過(guò)影響IKK、FADD. 和 RIPK1穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。 兩miR-146b miR-155已報(bào)道與心血管疾病相關(guān)的。因此，TSA可以發(fā)揮與 抑制miR-155，miR-146b水平相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化的作用，如在本研究中 觀察到的?？傊例l口卜啉單胞菌感染弓I起的炎癥反應(yīng)，在動(dòng)脈粥樣硬化ApoE -/- 小鼠起到了至關(guān)重要的作用。這可以通過(guò)TSA處理來(lái)預(yù)防。TSA降低動(dòng)脈粥 樣硬化進(jìn)展時(shí)炎癥介質(zhì)的表達(dá)。TSA可

33、通過(guò)抗炎和抗氧化作用預(yù)防病原體加速 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。Fia，L Stru ctun: of tansh m one HA (TSA).Table 1. Moiise .七IhcfBclergi主 ilixibodyMjpARCDFFGH1PONmsMFC；NF3Rl-ANKhFCSFrrwFaiairn-l-PONmsMFC；NFot, .VfG ncftive coilrol spot BIANK hlai山f, 何踞的/?版攜擔(dān)麗占十T$Ac 一巳彳be=:_iqhF單 2. Lipid dfiposnon aanM with OiE Ked Q .-Vish-y irtdi融k ij

34、pixal. np 4四此hi W uiuixbdzrgE area m Lhc aoru: siuus oE Apot etikc ftcm ciftereiul grcups 歸口羽 也 L magnitkstiiHi 罰 KX)| (w). I ti pcrccmage atHe uiEiewiuusg 呷我 IsiiNis is shownI & we As (b). L tie dia represent ihc cuzin = SD (ff = 8)l *P0.& compared n the PBS-ncKuEaicd group: *P GJ5 ranpaKdthe F呻Awa

35、awm山 印jjgA-dialltngeii group. PBSF. g網(wǎng)心腌11 R qggrjg虺+FSAFig 3. Cybukuic C7.pn:xiHjn rdcxl Tjy die Mtusr ALlicrnlciusiu AmihLdy Anriy- CmnnLuiliiin eH dnerusukrutiis ihd. lacLir jjutii iPsjrpUv.TjflBumis- in- KJ/ductulkrcd End IS A-nc itol sc nun samples colJcd bl Jb wecki. The txjrcsatHi crtcadn cytokenr is- presumed is the percentage of lie pnsia