HIV1 Tat 蛋白結(jié)合Tar的抗艾滋病藥物篩選模型的建立研究

1、李在留劉朝奇，鄒坤，李鳳蘭，韓鈺，楊凡，王磊黎【摘要】目的創(chuàng)立HIV-1Tat卵白結(jié)合Tar的抗HIV-1藥物挑選模子用于抗HIV藥物篩眩要領(lǐng)構(gòu)建表達(dá)HIV-1Tat卵白的真核表達(dá)質(zhì)粒pDNA3.1(+)-Tat和HIV-1LTR-lu熒光素酶陳訴基因，接納脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，熒光儀檢測Tat卵白促進(jìn)熒光素酶在HeLa細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)環(huán)境，創(chuàng)立HIV-1Tat卵白結(jié)合Tar的細(xì)胞模子，用于抗HIV-1的藥物篩眩以DRB5,6-二氯-1-呋核亞硝脲-苯并咪唑?yàn)殛栃员容^，舉行模子的創(chuàng)立及條件的優(yōu)化。結(jié)果通過重復(fù)試驗(yàn)表白，目的基因和陳訴基因的配比、轉(zhuǎn)染時(shí)造就液中小牛血清的含量、細(xì)胞濃度、轉(zhuǎn)染

2、前細(xì)胞狀態(tài)以及藥物作用時(shí)間的是非等對模子的不變性和敏感性有影響。結(jié)論應(yīng)用優(yōu)化的細(xì)胞模子對文冠果、紫蘇等浸提物舉行挑選及結(jié)果的闡發(fā)?！娟P(guān)鍵詞】HIV-1TatLTR-Lu熒光素酶基因艾滋藥物挑選模子Keyrds:HIV-1Tat;LTR-Luluiferasegene;delfrsreening人類免疫缺陷病毒HIV是得到性免疫缺陷綜合征AIDS的病原體；是一種逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒，被稱為“20世紀(jì)的瘟疫，在環(huán)球廣為流傳，至今尚無根治藥物?，F(xiàn)已容許上市的藥物HIV卵白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶按捺劑只能緩解病痛，代價(jià)昂貴、毒副作用大，病毒易產(chǎn)生變異性、耐藥性，藥效較差、抵消等1，2。因此，從艾滋病病毒的底子研究中

3、探求新的不易產(chǎn)生耐藥性的靶點(diǎn)成為國表里研究熱門。如今抗HIV藥物的研究重點(diǎn)會合在逆轉(zhuǎn)錄酶、卵白酶、整合酶及病毒吸附、交融等幾個(gè)靶點(diǎn)。HIV反式激活因子(transativatr，Tat)作為HIV的調(diào)治卵白，不但可以通過反式激活效應(yīng)調(diào)控病毒基因的復(fù)制與表達(dá)，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活靜態(tài)T淋巴細(xì)胞，按捺免疫細(xì)胞的分化和增殖，有助于病毒的熏染和體內(nèi)流傳，導(dǎo)致種種并發(fā)癥等3，4。Tat與反式激活效應(yīng)區(qū)trans-ativatrrespnseregin，TARRNA彼此作用，反式激活轉(zhuǎn)錄。Tat和TAR的布局具有高度守舊性，使它成為探求新的作用機(jī)制和不易產(chǎn)生耐藥性的抗艾滋病藥物的非常有吸引力的新靶點(diǎn)5

4、。Tat基因編碼卵白可與HIV-1病毒長末了重復(fù)序列LTR結(jié)合，以增長病毒全部基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進(jìn)病毒RNA的翻譯，導(dǎo)致病毒的復(fù)制增長6。本研究通過創(chuàng)立HIV-1Tat和LTR的結(jié)合，導(dǎo)致陳訴基因熒光素酶在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)，反響Tat和LTR序列的有用結(jié)合，創(chuàng)立Tat的反式激活效應(yīng)調(diào)控病毒基因的復(fù)制與表達(dá)模子，從而用于自然藥物有用身分的挑選，具有簡樸、快速、微量、用度低廉、寧靜、不受P3實(shí)行室限定，不消同位素等特點(diǎn)，可為實(shí)行室創(chuàng)立抗HIV-1藥物挑選模子提供鑒戒與引導(dǎo)，具有較強(qiáng)的理論意義。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1質(zhì)料HIV-1Tat卵白的真核表達(dá)質(zhì)粒pDNA3.1(+)-Tat及陳訴基因HIV

5、-1LTR-lu(LTR-LU)由三峽大學(xué)分子生物學(xué)研究所構(gòu)建保存。HeLa細(xì)胞株由北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。Lipfetaine2000、pti-E造就液均為Invitrgen公司試劑，新生牛血清NS為GIB公司產(chǎn)物。DE造就基、胰卵白酶、底物L(fēng)uiferin、陽性比較DRB，細(xì)胞裂解液1,2-diainyllhexane-N,N,N,N-tetraaetiaid，考馬斯亮蘭等藥品均為Siga公司產(chǎn)物。1.2要領(lǐng)構(gòu)建表達(dá)HIV-1Tat卵白的真核表達(dá)質(zhì)粒pDNA3.1(+)-Tat、HIV-1LTR-lu熒光素酶陳訴基因，接納脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，熒光儀檢測Tat卵白在HeLa細(xì)胞內(nèi)的

6、表達(dá)環(huán)境，創(chuàng)立HIV-1Tat卵白結(jié)合Tar的抗HIV-1的藥物挑選模子。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞參加對細(xì)胞毒性在20%以下的藥物濃度，以DRB為陽性比較Tat/Tar按捺劑，anebetal.,1997;Nekhaietal，1997，造就一按時(shí)間后網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞裂解液上清檢測相對熒光值RLU，考馬斯亮蘭G-250測定卵白含量，在卵白含量同一的條件下，藥物對Tat卵白表達(dá)的按捺作用表現(xiàn)為藥物組與空缺比較組RLU的差值。2結(jié)果與闡發(fā)從表1和圖1可看出：RLU值隨著兩種質(zhì)?？偭康脑鲩L而明顯增長，當(dāng)兩種質(zhì)粒都為0比較時(shí)，RLU值極低，即：未轉(zhuǎn)染；當(dāng)兩種質(zhì)粒的含量達(dá)20l時(shí)，RLU值可達(dá)3108，且隨著LTR-Lu含

7、量的低落而顯著低落，但不由其決定，由于當(dāng)LTR-Lu含量均為10l，而pDNA3.1(+)-Tat的含量由10l變?yōu)?時(shí)，其RLU值低落了100倍，充實(shí)說明LTR-Lu的表達(dá)必要pDNA3.1(+)-Tat刺激。當(dāng)pDNA3.1(+)-Tat為3l，LTR-Lu為1ul時(shí)，RLU值為5459851可作為較佳的配比，開端創(chuàng)立模子。表1pDNA3.1(+)-Tat與LTR-Lu差異含量、差異配比轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞所得結(jié)果略2.2模子的不變優(yōu)化實(shí)行結(jié)果表2所得結(jié)果再次驗(yàn)證了表1中結(jié)果。此中a1b2，a2b2組合所得RLU值相對別的組合值較適中，對其舉行藥物挑選實(shí)行，同樣參加對細(xì)胞毒性低于20%的藥物濃

8、度，顛末重復(fù)實(shí)行，a2b2組合中藥物作用結(jié)果明顯，a1b1組合中不顯著，表白轉(zhuǎn)染率凹凸影響藥物作用結(jié)果，進(jìn)一步確定a2b2組合為優(yōu)化質(zhì)粒配比，即：pDNA3.1(+)-Tat與LTR-Lu別離以0.017，0.0017g/l配比轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞可以得到較高的Tat卵白表達(dá)，且待測藥物對其按捺作用敏捷，尤其陽性比較DRB表現(xiàn)出較為明顯的按捺率。表2pDNA3.1(+)-Tat與LTR-Lu梯度稀釋配比轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞所得RLU值略表中a表現(xiàn)質(zhì)粒pDNA3.1(+)-Tat，此中a1為原液；a2為3倍稀釋液；a3為9倍稀釋液；a4為27倍稀釋液；a5為0；b表現(xiàn)LTR-lu，此中b1為原液，b2為

9、10倍稀釋液，b3為30倍稀釋液從表3及圖3可看出，隨著轉(zhuǎn)染歷程中NS含量的升高，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率明顯低落，當(dāng)NS含量為5%時(shí)，藥物按捺率較為顯著，故確定NS用量為5%。表4和圖4所得結(jié)果表現(xiàn)：隨著24孔板中細(xì)胞密度的減小，RLU值減小，藥物按捺作用無顯著變革。此中4倍、8倍稀釋液RLU值較低，結(jié)果可信度小；不稀釋或2倍稀釋下RLU值較高，藥物作用同等。故轉(zhuǎn)染細(xì)胞可均勻分傳入兩塊24孔板，舉行大批量藥物篩眩表4轉(zhuǎn)染細(xì)胞分傳密度對藥物按捺作用的影響略表5及圖5表白：隨著DRB濃度的低落，RLU值低落，即：DRB對Tat卵白的按捺作用低落，DRB的按捺作用與其劑量呈依靠性干系；進(jìn)一步說明本模子構(gòu)建樂成，

10、不變性好、重現(xiàn)性強(qiáng)。別的，DRB對細(xì)胞毒性較大，在大于50l/l時(shí)，細(xì)胞部門殞命，隨著其濃度的增長，細(xì)胞殞命數(shù)目增多。3討論艾滋病藥物挑選暫無抱負(fù)的動(dòng)物模子，如今重要從細(xì)胞和分子程度上舉行體外挑選8。王岱等7初次應(yīng)用牛免疫缺陷病毒(BIV)合胞體和BlV長末了重復(fù)序列(LTR)引導(dǎo)的熒光素酶(Lu)基因，創(chuàng)立抗AIDS藥物的挑選和評價(jià)模子。隨著基因工程、生物化學(xué)和分子生物學(xué)及檢測儀器的生長，該模子原理、機(jī)理方面得以深化研究，由HIV代替BIV912，但對其創(chuàng)立要領(lǐng)等僅作扼要先容。本研究初次對該模子的實(shí)行室構(gòu)建、模子優(yōu)化等舉行了全面、體系的研究，進(jìn)一步美滿了該模子，為抗HIV藥物挑選積聚資料。表5藥物濃度的影響實(shí)行略顛末優(yōu)化創(chuàng)立的細(xì)胞模子，其結(jié)果表白：目的基因與陳訴基因的配比起決定性作用，當(dāng)兩者含量過高時(shí)，Tat表達(dá)量大，藥物險(xiǎn)些無按捺作用，以0.017，0.0017g/l配比可以得到較高的Tat卵白表達(dá)及明顯的藥物按捺作用；