DNA復制09Convertor教學資料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA復制09Convertor-第三篇基因信息的傳遞BiochemistryDepartmentDepartmentofBasicMedicalSciencesHangzhouNormalUniversityGuyisheng（flowofgeneinformation)基因（gene）：為生物活性產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或各種RNA）編碼的DNA功能片段?；虮磉_（geneexpression）：基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的過程。中心法則：圖示基因的信息傳遞第十章生物化學BiochemistryDNA的生物合成（復制）（D

2、NABiosynthesis，Replication)第一節(jié)復制的基本規(guī)律(BasicRulesofDNAReplication)復制的方式半保留復制(semi-conservativereplication)復制的高保真性(highfidelity)雙向復制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復制(semi-discontinuousreplication)一、半保留復制(semiconservativereplication)（一）概念（二）實驗依據(jù)：密度梯度實驗（三）生物學意義：1.保證遺傳信息傳遞的忠實性2.遺傳和變異的統(tǒng)一DNA的生物合成（復制）遺傳信息從親代

3、DNA傳遞到子代DNA分子上，稱為復制。DNA復制的最主要特征半保留復制：DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復制方式稱為半保留復制。半保留復制半保留復制的意義DNA的半保留復制保證了DNA在代謝上的穩(wěn)定性，經(jīng)過許多代的復制，DNA多核苷酸鏈仍可保持完整，存在于后代而不被分解，這種穩(wěn)定性體現(xiàn)了DNA遺傳過程的相對保守性。遺傳的保守性是相對的，而不是絕對的。自然界還存在著普遍的變異現(xiàn)象。二、雙向復

4、制(bidirectionalreplication)原核生物復制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉，稱為雙向復制。原核生物DNA的雙向復制A.環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點B.復制中的兩個復制叉C.復制接近終止點(termination,ter)真核生物DNA的雙向復制真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復制子(replicon)。復制子是獨立完成復制的功能單位。真核生物的多復制子形式三、半不連續(xù)復制(semi-discontinuousreplication)順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行

5、的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為隨從鏈。復制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復制的半不連續(xù)性。半不連續(xù)復制圖解領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)圖示四、需要RNA引物(primer)DNA聚合酶不能直接聚合游離的dNTP，必須由一段核酸片段提供3OH末端。由引物酶催化，由NTP為原料，合成RNA引物。第二節(jié)DNA復制的酶學（TheEnzymologyofDNAReplication）復制是在酶催化下的核苷酸聚合過程

6、，需要多種物質(zhì)參與：底物：dNTP：dATP、dGTP、dCTP、dTTP聚合酶：依賴DNA的DNA聚合酶模板：解開成單鏈的DNA母鏈引物：RNA，提供3-OH末端，使dNTP可以依次聚合其他酶和蛋白因子：解螺旋酶、拓樸異構(gòu)酶、引物酶、DNA連接酶、單鏈結(jié)合蛋白等一、復制的化學反應(yīng)（形成磷酸二酯鍵）新鏈的延長只可沿53方向進行(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi全稱：依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase）（DNA-pol，DDDP）催化活性：53的聚合活性核酸外切酶活性二、DNA聚合酶聚合酶I：對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復中出現(xiàn)的

7、空隙進行填補。聚合酶II：在無聚合酶I、III時起作用，功能未完全搞清楚。參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復。聚合酶III*：復制延長時真正催化新鏈核苷酸聚合的酶。（一）原核生物的DNA聚合酶比較酶圖聚合酶*：在復制過程中起重要作用。具有引物酶活性。聚合酶：參與低保真度復制（相當于原核生物DNA-polII）。聚合酶：存在于線粒體，參與線粒體DNA復制。聚合酶*：在復制中起主要作用，延長子鏈（相當于原核生物的DNA-polIII）。有解螺旋酶活性。聚合酶：在復制中起校讀、修復和填補缺口的作用（相當于原核生物DNA-polI）。（二）真核生物的DNA聚合酶比較DNA聚合酶除了有催化53核苷酸聚合的作用

8、外，還有核酸外切酶活性。外切酶有方向性：從5-端或3-端把核苷酸從核酸鏈上水解下來。DNA聚合酶I有兩種方向的外切酶活性。DNA聚合酶I活性較強，在復制過程中能辨認錯配的堿基并加以切除。DNA聚合酶III只有35外切酶活性。（三）核酸外切酶活性圖示DNA復制的保真性主要依賴三種機制：1、遵守嚴格的堿基配對規(guī)律AT、CG2、聚合酶在復制延長中對堿基的選擇功能3、復制出錯時有即時的校讀功能聚合酶III有35核酸外切酶活性三、DNA復制的保真性外切酶教讀堿基四、復制中的解鏈及DNA分子拓撲學變化與DNA解旋和解鏈有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)：解螺旋酶（helicase）等DNA拓撲異構(gòu)酶（DNAtopoisom

9、erase）單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）引物酶（primase）解螺旋酶的作用是利用ATP供能來解開DNA雙鏈。DnaB蛋白-解螺旋酶DnaA蛋白-識別復制起始點DnaC蛋白-輔助解螺旋酶，使其（DnaB）在起始點上結(jié)合并打開雙鏈（一）DNA的解鏈圖示DNA雙螺旋鏈在復制過程中旋轉(zhuǎn)速度很快，易造成DNA分子打結(jié)、纏繞、連環(huán)現(xiàn)象。復制末期，母鏈DNA與新合成鏈也會相互纏繞，形成打結(jié)或連環(huán)。拓撲異構(gòu)酶分為I型和II型兩種。拓撲異構(gòu)酶對DNA的作用是既能水解，又能連接磷酸二酯鍵。使復制中的DNA能解結(jié)，達到適度盤繞。（二）DNA拓撲異構(gòu)

10、酶圖示作用機制：拓撲異構(gòu)酶切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓撲異構(gòu)酶切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進入負超螺旋狀態(tài)。SSB的作用是在復制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護單鏈的完整（免受核酸酶降解）。SSB與DNA的結(jié)合具有協(xié)同效應(yīng)（三）單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）DNA聚合酶沒有催化兩個游離dNTP聚合的能力。因此，復制是在RNA引物的基礎(chǔ)上加進脫氧核苷酸的。催化引物合成的是一種RNA聚合酶，它不同于轉(zhuǎn)錄過程的RNA聚合酶，所以稱為引物酶（DnaG蛋白）。復制起始時，D

11、naA、DnaB、DnaC蛋白，還有其他復制因子，一起形成復合體，結(jié)合引物酶，形成較大的聚合體，再結(jié)合到模板DNA上，這種復合物稱為引發(fā)體。（四）引物酶和引發(fā)體DNA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈的5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連成完整的鏈。復制中模板鏈是連續(xù)的，新鏈分段合成，是不連續(xù)的，最后留有缺口，要靠連接酶接合。連接酶的催化作用需要消耗ATP。五、DNA連接酶圖示連接酶的功能DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比

12、較琰茞提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)連續(xù)鏈拓撲酶切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態(tài)DNA合成從固定的起始點開始，同時向兩個方向進行復制。（雙向復制）真核生物的染色體龐大、復制，有多個復制起始點，同時形成許多復制的單位，兩個起始點之間的DNA片段，稱為一個復制子。復制是連續(xù)的過程，為描述方便，把它分為起始、延長、終止三個階段。第三節(jié)DNA生物合成過程TheProcessofDNAReplication（一）復制的起始：1、DNA解鏈形成復制叉DnaA、DnaB、DnaC蛋白、SSB等參與。2、形成引

13、發(fā)體，合成引物引發(fā)體的蛋白質(zhì)部分在DNA鏈上可以移動，并需要ATP供給能量。引發(fā)體到達適當位置就可按照模板的配對序列，催化NTP的聚合，生成引物。提供3-OH末端。一、原核生物DNA的合成過程DNA解鏈E.coli復制起始點oriC引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區(qū)域的復合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構(gòu)酶引物酶SSB3535引物生成引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。3535引物引物酶1、脫氧單核苷酸（dNTP）逐個加入而延長DNA新鏈，其化學反應(yīng)本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵。催化此反應(yīng)的酶，在原核生物為DNA-polIII，真核生物為DNA

14、-pol和。新鏈延長的方向：53（二）復制的延長2、復制的半不連續(xù)性和岡崎片段DNA雙鏈走向相反，而復制只能從53進行。因此，順著解鏈方向而生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，稱為領(lǐng)頭鏈；另一股鏈的復制方向與解鏈方向相反，復制不連續(xù)進行，稱為隨從鏈。不連續(xù)復制的片段稱為岡崎片段。領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著53方向可以連續(xù)地延長。隨從鏈的合成全圖同一復制叉上領(lǐng)頭鏈和隨從鏈由相同的DNA-pol催化延長階段一階段二階段三階段四DNA復制過程簡圖（三）復制的終止原核生物是環(huán)狀DNA。雙向復制的兩子鏈在復制終止點處匯合。切除引物、填補空缺、連接切口復制中的不連續(xù)片段需連接成連續(xù)的子鏈先由RNA酶水解引物。

15、引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化dNTP逐一自5向3端聚合而填補。最后，兩不連續(xù)片段相鄰的5-P和3-OH還有一個缺口，則由DNA連接酶加以連接。隨從鏈不連續(xù)性片段的連接圖示二、真核生物的DNA生物合成特點：DNA的復制只發(fā)生在S期多復制子真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式激活而不是同步起動真核細胞含有5種DNA聚合酶端粒復制DNA合成期細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關(guān)鍵點。G1S及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調(diào)控作用。哺乳動物的細胞周期G1G2SM（一）復制的起始復制的起始需要DNA

16、-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復制因子(replicationfactor,RF)。增殖細胞核抗原細胞周期蛋白(cyclin)，細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)等。與原核基本相似增殖細胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在復制起始和延長中起關(guān)鍵作用。PCNA為同源三聚體，具有與E.coliDNA聚合酶的亞基相同的功能和相似的構(gòu)象，即形成閉合環(huán)形的可滑動DNA夾子，在RFC的作用下PCNA結(jié)合于引物模板鏈；并且PCNA使pol獲得持續(xù)合成能力。PCNA水平也是檢驗細胞增殖的重要指標。細胞能否分裂，決定于進入S期及M期

17、這兩個關(guān)鍵點。G1S及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調(diào)控作用。相關(guān)的激酶都有調(diào)節(jié)亞基即細胞周期蛋白(cyclin)，和催化亞基即細胞周期蛋白依賴激酶(cyclindependentkinase，CDK)。CDK相匹配的周期蛋白作用點CDK2CyclinD1,D2,D3G1期CyclinEG1S期CyclinAS期CDK3和CDK4CyclinD1,D2,D3G2期CDK1（CDC2）CyclinA,BG2M期哺乳類動物的周期蛋白和CDK哺乳類動物細胞內(nèi)還發(fā)現(xiàn)天然抑制CDK的蛋白質(zhì)，例如錨蛋白(ankynin)是CDK4的特異性抑制物，P21蛋白

18、能抑制多種CDK。錨蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使細胞周期開放/關(guān)閉，因此被形容為細胞周期的檢查點(checkpoint)蛋白。（二）復制的延長發(fā)生DNA聚合酶/轉(zhuǎn)換DNA-pol和pol分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復制叉及引物生成后，DNA-pol通過PCNA的協(xié)同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由pol催化合成。然后由PCNA協(xié)同，pol置換pol，繼續(xù)合成DNA子鏈。復制叉的延長圖示（三）復制的終止和端粒酶染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空

19、隙。染色體兩端DNA子鏈上最后復制的RNA引物，去除后留下空隙：切除引物的兩種機制端粒是真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。染色體DNA與它的結(jié)合蛋白緊密結(jié)合因而末端膨大成粒狀。末端DNA序列是多次重復的富含G、C堿基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒在維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復制的完整性有重要作用。真核生物的端粒和端粒酶三種成分端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT

20、)在端粒DNA復制上，端粒酶既有模板，又有逆轉(zhuǎn)錄酶這兩方面的作用。端粒酶的組成：一種RNA-蛋白質(zhì)復合物端粒酶的催化延長作用爬行模型DNA聚合酶復制子鏈進一步加工一、逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄是依賴RNA的DNA合成作用，即以RNA為模板由dNTP聚合成DNA分子。催化此反應(yīng)的酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶。第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄和其他復制方式（ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays）逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)催化逆轉(zhuǎn)錄過程的酶稱逆轉(zhuǎn)錄酶，

21、RNA病毒中都含有此酶。具有三種酶活性：RNA指導的DNA聚合酶RNA酶DNA指導的DNA聚合酶反應(yīng)過程：先以單鏈RNA為模板，催化合成一條單鏈DNA，形成DNA-RNA雜化雙鏈其中的RNA被RNA酶水解后再以新合成的單鏈DNA為模板，催化合成第二鏈的DNA。RNA病毒在細胞內(nèi)復制成雙鏈DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遺傳信息，并可在細胞內(nèi)獨立繁殖。在某些情況下，前病毒基因組通過基因重組(recombination)，參加到細胞基因組內(nèi)，并隨宿主基因一起復制和表達。這種重組方式稱為整合(integration)。前病毒獨立繁殖或整合，都可成為致病原因。分子生物學研

22、究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補的DNA鏈。試管內(nèi)合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆轉(zhuǎn)錄研究的意義逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學研究中的重大發(fā)現(xiàn)。逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論。逆轉(zhuǎn)錄酶基因工程中目的基因的獲取滾環(huán)D環(huán)突變是指一個或多個脫氧核糖核苷酸的構(gòu)成、復制或表型功能的異常變化，即遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變引起遺傳信息的改變。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變在復制過

23、程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNAdamage)。第五節(jié)DNA損傷（突變）與修復DNADamage(Mutation)andRepair一、突變在生物界普遍存在突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)突變導致基因型改變突變導致死亡突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)二、引發(fā)突變的因素物理因素：紫外線、各種輻射化學因素：5-BU、羥胺類、亞硝酸鹽、烷化劑如；嘧啶二聚體TT光修復三、突變的類型錯配(mismatch)又稱點突變（pointmutation）缺失（deletion）插入（insertion）重排（rearrangement）（一）錯配轉(zhuǎn)換：發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。顛

24、換：發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。DNA分子上的堿基錯配又稱點突變。(pointmutation)圖示（二）缺失(deletion)、插入(insertion)缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。缺失或插入都可導致框移(frame-shift)突變?？蛞仆蛔兪侵溉笔Щ虿迦耄ê塑账幔┑耐蛔?，引起三聯(lián)密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變，其后果是翻譯出一級結(jié)構(gòu)完全不同的另一種蛋白質(zhì)。圖示（三）重組(recombination)DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。移位的DNA可以在新位

25、點上顛倒方向反置（倒位），也可以在染色體之間發(fā)生交換重組。圖示DNA損傷（突變）可能造成兩種結(jié)果：其一是導致復制或轉(zhuǎn)錄障礙（如胸腺嘧啶二聚體，DNA骨架中產(chǎn)生切口或斷裂）；其二是導致復制后基因突變（如胞嘧啶自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ?，使DNA序列發(fā)生永久性改變。所以，必須通過進化使細胞擁有靈敏的機制，以識別和修復這些損傷，否則細胞無法維持正常代謝。體內(nèi)DNA的損傷修復機制主要有：1、光修復2、切除修復3、重組修復4、SOS修復四、DNA損傷的修復（一）直接修復如：光修復(lightrepairing)可見光（最有效波長400nm）激活生物界廣泛分布（高等哺乳動物除外）的光復活酶，該酶分解嘧啶二聚

26、體。是一種高度專一的修復形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體。圖示（二）切除修復(excisionrepairing)是細胞內(nèi)最重要和有效的修復機制，主要由DNA-pol和連接酶完成。通過切除損傷部位，剩下的空隙由DNA-polI催化dNTP聚合而填補，最后由DNA連接酶連接缺口。切除損傷在原核生物需Uvr蛋白類，真核生物需XP蛋白類。圖示核苷酸切除修復不僅能夠修復整個基因組中的損傷，而且能拯救因轉(zhuǎn)錄模板鏈損傷而暫停轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，即參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(transcription-coupledrepair)。轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復的意義在于，將修復酶集中于正在轉(zhuǎn)錄的DNA，使該區(qū)域的損傷盡快得

27、以修復。（三）重組修復(recombinationrepairing)又稱復制后修復（postreplicationrepair）這種情況出現(xiàn)在DNA損傷面積較大，來不及修復就進行復制。受損傷的DNA在進行復制時，跳過損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。通過分子間重組（鏈間的交換），從完整的母鏈上將相應(yīng)的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再通過DNA-polI、DNA連接酶進行修補上母鏈的空缺，此過程即重復修復。并非完全校正。這種修復的不足之處在于原損傷部位仍然存在，但隨著多次復制，損傷鏈所占比例越來越少。圖示SOS修復又稱傾錯性修復（Error-ProneRepair）當DNA損傷廣泛難以繼續(xù)復制時，由此而誘發(fā)出一系列復雜的反應(yīng)。在E.coli，各種與修復有關(guān)的基因，組成一個稱為調(diào)節(jié)子(regulon)的網(wǎng)絡(luò)式調(diào)控系統(tǒng)。這種修復特異性低，對堿基的識別、選擇能力差。通過SOS修復，復制如能繼續(xù)，細胞是可存活的。然而DNA保留的錯誤較多，導致較廣泛、長期的突變。中心法則圖岡崎片段與半不連續(xù)復制大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的性質(zhì)比較DNA-pol分子量：109kD功能：對復制中的錯誤進行校讀