細胞培養(yǎng)基本方法(復蘇、換液、傳代、凍存)課件

1、細胞培養(yǎng)1一 原代培養(yǎng)（略）2二. 傳 代 培 養(yǎng) 準備及注意事項 換 液 傳 代 凍 存 復 蘇 MTT3準備事項紫外燈照射細胞室30分鐘,風機運行10分鐘后方可進入實驗室.穿專用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等.帶手套,并用酒精擦拭之.準備好實驗必需用品.超凈工作臺內(nèi)操作前用酒精棉球擦拭臺面.超凈工作臺內(nèi)操作完成后，要用酒精棉球擦拭臺面,除了酒精燈,鑷子,試管架等物品外,其他都要拿出工作臺外.紫外燈照射30分鐘.4換液把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出, 擰緊蓋子;觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色, 是否渾濁等; 放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。放入超凈工作臺內(nèi),點燃酒精燈,拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上,

2、至少三秒.取下蓋子,燒瓶口;倒掉培養(yǎng)基,燒瓶口;拿出PBS液瓶子,燒瓶口和鑷子;用鑷子將塞子取出,燒瓶口（至少10圈）。56.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)。燒培養(yǎng)瓶口， 來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此操作一次。7.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出， 燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取5ml-8ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，燒瓶口， 鑷子和蓋子；9.蓋上蓋子，倒置顯微鏡下觀察，之后標明名稱和日期， 酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)即可。 注意：1.打開培養(yǎng)箱時盡量不要說話；2.步驟9中培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時，應把蓋子擰開少許。 6傳代1.把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出

3、，擰緊蓋子；2.觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在 倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。3.放入超凈工作臺內(nèi)，點燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶 口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞 子取出，燒瓶口（至少10圈）。7 6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)。燒培養(yǎng) 瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此 操作一次。7.拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取 出，燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，燒培養(yǎng) 瓶口和蓋子，蓋上蓋子；9.拿出工作臺外，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后 用酒

4、精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)；5分鐘 后取出；810.在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化情況。若 細胞變成單個圓形，則可進行傳代。11.拿到工作臺內(nèi)，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶 口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。12.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子 將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內(nèi)， 用吸管吹打成單個細胞懸液。計數(shù)，分裝 即可。9凍存1.把細胞培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中拿出，擰緊蓋子；2.觀察瓶內(nèi)培養(yǎng)基的顏色，是否渾濁等；放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。3.放入超凈工作臺內(nèi)，點燃酒精燈，拿培養(yǎng)瓶口在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養(yǎng)基

5、，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。106. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)。燒培養(yǎng)瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此操作一次。7. 拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，燒培養(yǎng)瓶口和蓋子，蓋上蓋子；9. 拿出工作臺外，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi)；5分鐘后取出；10. 在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化情況。若細胞變成單個圓形，則可進行傳代。1111.拿到工作臺內(nèi)，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶 口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。12

6、.拿出培養(yǎng)基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子 將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。13.用吸管吸取5ml的培養(yǎng)基打入培養(yǎng)瓶內(nèi)，用吸管 吹打成單個細胞懸液。14.用吸管將細胞懸液移至5ml離心管中，蓋上蓋 子，在離心機內(nèi)離心，1500轉(zhuǎn)/分鐘，時間為15 分鐘。15.離心結束后，拿至工作臺內(nèi)，燒離心管口。去掉 塞子，燒管口。1216.棄上清液，加凍存液2ml 吹打，使細胞均勻混在凍存液中，再加3ml凍存液，用吸管吸出打入多個凍存管中，每管1.5ml。17.蓋上蓋子，用封口膜封好,標上細胞名稱和日期 .18.凍存方式：430分鐘，-2015分鐘，-8060分鐘，最后轉(zhuǎn)移到液氮罐內(nèi)。注意：凍存管移動時要夾在

7、冰塊中間。13復蘇1. 取一敞口瓶，內(nèi)裝蒸餾水，放入電熱恒溫水槽中，溫度設置為39.0。2. 等達到39.030分鐘后，用鑷子將欲復蘇的細胞從液氮管中取出，快速放入敞口瓶內(nèi)，晃動，使凍存管內(nèi)完全液化。3. 用酒精擦拭凍存管，放入工作臺內(nèi)。4. 用鑷子將封口膜夾掉，輕燒管口；5. 用吸管吸出凍存管內(nèi)的細胞懸液，打入已裝有5ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)。146. 燒瓶口，鑷子和蓋子；蓋上蓋子， 在倒置顯微鏡下觀察。7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養(yǎng)箱內(nèi).注意： 步驟2中，蒸餾水不要沒過凍存管口 所有步驟結束過24小時后一定要換液；15MTT法1.實驗開始前，96孔板應在超凈臺紫外燈下照射2個小時以

8、上。2.從培養(yǎng)箱中拿出培養(yǎng)瓶，觀察，加PBS，加胰酶消化，加培養(yǎng)基，計數(shù)。 （方法及步驟同傳代1-13步。）3.加培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為10000個/200l.4.加到96孔板內(nèi),每板6行8列共48孔,每孔200l.5.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，標明名稱，序號和日期。166. 用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時。7. 從培養(yǎng)箱中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內(nèi)， 用200l的槍將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出；8. 加入不同濃度的藥物的無血清培養(yǎng)基,每孔200l。9. 蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下 觀察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 小時。10.從培養(yǎng)箱

9、中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內(nèi)， 每孔加MTT液20l。1711.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下 觀察，用酒精棉球擦板，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)4 小時。12.取出96孔板，倒掉孔內(nèi)的液體，每孔加 DMSO150l，放入酶標儀內(nèi)，振蕩600秒， 讀數(shù)即可。注意： 本實驗以CHL細胞為例.加DMSO時，帶口罩和手套。放入酶標儀內(nèi)時，96孔板勿蓋蓋子。多重復幾次。18溶液的配制PBSRPMI1640培養(yǎng)基消化液凍存液清潔液MTT其它溶液19PBS配制之后，加1000ml三蒸水,調(diào)節(jié)PH值在7.2-7.4之間,高壓121 ,30分鐘,4備用。 名稱 質(zhì)量(單位:克)NaClKClNa2HPO

10、4.12H2OKH2PO48.000.203.490.2020RPMI1640培養(yǎng)基的配制：取一小袋1640培養(yǎng)粉，加高壓過的三蒸水800ml，在1000ml的燒杯中用玻璃棒攪拌溶解；加碳酸氫鈉2.0g，再加三蒸水定容至1000ml；加青霉素(100U/ml) ，鏈霉素（100g/ml）；在超凈工作臺內(nèi)過濾除菌，分裝成180ml，-20備用。注意 燒杯要泡過酸，并在紫外線下照射至少30分鐘。21消化液的配制稱取胰蛋白酶粉0.5克，溶入PBS緩沖液200ml，混勻，調(diào)整PH值到7.2，過濾除菌，用1.5ml的EP管分裝，-20凍存。取少許放入已培養(yǎng)的無污染的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。22凍存液的配制高壓過

11、的二甲基亞砜DMSO，胎牛血清和無血清培養(yǎng)基按1:3:6的比例配制。例如配制10ml的凍存液： 高壓的小瓶中加3ml過濾的胎牛血清， 再加6ml培養(yǎng)基，最后加1ml的 DMSO,混勻即可。23清潔液的配制重鉻酸鉀(單位:克)濃硫酸(單位:ml)蒸餾水(單位:ml)弱液100 1001000次強液120 2001000強液 631000 20024一般常用次強液。新配制的清潔液為棕紅色， 多次使用后，成綠色時就不能再用, 需重新配制。注意：保護自己；先將重鉻酸鉀完全溶解于水中（必要時可加熱幫助溶解），然后緩慢加入濃硫酸，以免產(chǎn)生熱量太多，使容器破裂。 25噻唑藍MTT液配制方法 稱取25mgMT

12、T, 加入5ml PBS液, 混勻, 即成5mg/ml的MTT液； 用0.22m的微孔濾器除菌, 避光, 4保存一周內(nèi)使用.原理 活細胞的線粒體的乳酸脫氫酶可使MTT（黃綠色）分解，產(chǎn)生蘭紫色結晶狀甲贊顆粒，積淤細胞內(nèi)和細胞周圍；其量與細胞數(shù)成正比，也與細胞活力成正比。注意 MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力, 不能測定細胞絕對數(shù).26其它溶液的配制95%到75%的酒精的配制比例為4:1， 例如,配制100ml75%的酒精,80ml 95%酒精加20ml三蒸水即可。36%-38%的濃HCL到5%的稀HCL的配制比例為3:17， 例如,配制1000ml的5%的稀鹽酸,150ml的濃HCL加85

13、0ml的蒸餾水即可。27細胞計數(shù)方法吸出細胞懸液少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置三分鐘鏡下觀察，計數(shù)板四大格細胞總數(shù)。公式為：細胞數(shù)/ml=四大格細胞總數(shù)/4 104個注意鏡下見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算;若細胞團數(shù)量占10%以上，重新制備細胞懸液。計數(shù)時，計左側和上方的壓線細胞，右側和下方的壓線細胞不應該計在本方格之內(nèi)。28血清滅活把血清置于56的水浴鍋里待完全溶解后開始計時，30分鐘后分裝成20ml的小瓶，放-20備用。29實驗用品的洗滌橡膠，塑料用品玻璃器皿30橡膠，塑料用品用自來水沖洗后放入專用燒杯內(nèi),加入蒸餾水，使之淹沒物品稍許，放在電爐上加熱；等水開時開始記時，三十分鐘后取下，倒掉燒杯內(nèi)的水，自來水沖洗3遍，蒸餾水沖洗2遍，放烤箱下層中烘干