分菌方法2(共7頁)

1、一般液體(yt)或固體樣品的細(xì)菌篩選(shixun)方案(fng n)：以無菌操作吸取樣品lmL/1g于9mL無菌生理鹽水中,呈1:10的稀釋液，搖蕩攪拌溶解，得到為10-1，依次類推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ；加適量稀釋樣品到45-55oC的MRS瓊脂培養(yǎng)基/LB加富營養(yǎng)瓊脂（加放線菌酮）；澆注平板37培養(yǎng)12-48h；用接種針從固體平板上沾取每個(gè)單菌落，將針點(diǎn)在已畫好格的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)12-48h，每個(gè)9CM平板點(diǎn)樣20-30個(gè)為佳；觀察記錄和拍照平板上菌落形態(tài)，計(jì)數(shù)分類，鏡檢；挑選單菌落到相應(yīng)的3ml液體MRS培養(yǎng)基中，37oC培養(yǎng)過夜（12h）；取

2、1mL實(shí)驗(yàn)所得菌液，加入1mL 60%滅菌甘油，裝入保種管中，-80冰箱中保存。用另外大約1ml進(jìn)行提取DNA，通過16s(bacteria) rDNA測序進(jìn)行物種鑒定。酵母菌篩選流程:以無菌操作吸取樣品lmL/1g于9mL無菌生理鹽水中,呈1:10的稀釋液，搖蕩攪拌溶解，得到為10-1，依次類推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ，然后分別涂布到孟加拉紅的含氯霉素PDA基，28培養(yǎng)12-48h。加適量稀釋樣品到45-55oC的PDA瓊脂培養(yǎng)基；澆注平板28培養(yǎng)12-48h；用接種針從固體平板上沾取每個(gè)單菌落，將針點(diǎn)在已畫好格的PDA瓊脂培養(yǎng)基上，28培養(yǎng)12-48h，每個(gè)9CM

3、平板點(diǎn)樣20-30個(gè)為佳；觀察記錄和拍照平板上菌落形態(tài)，計(jì)數(shù)分類，鏡檢；挑選單菌落到相應(yīng)的3ml液體PDA培養(yǎng)基中，28oC培養(yǎng)過夜（12h）；取1mL實(shí)驗(yàn)所得菌液，加入1mL 60%滅菌甘油，裝入保種管中，-80冰箱中保存。用另外(ln wi)大約(dyu)1ml進(jìn)行提取DNA，通過26S（yeast）rDNA D1/D2 區(qū)PCR擴(kuò)增測序進(jìn)行(jnxng)物種鑒定。醋酸菌篩選流程：以無菌操作吸取樣品lmL/1g于9mL無菌生理鹽水中,呈1:10的稀釋液，搖蕩攪拌溶解，得到為10-1，依次類推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ，然后分別涂布到分離培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)12-48h

4、。觀察記錄和拍照記錄平板上菌落形態(tài)，并計(jì)數(shù)分類；用接種針從固體平板上挑選不同的形態(tài)的單菌落在分離瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，重復(fù)一次或幾次；挑選單菌落到相應(yīng)的3ml液體分離培養(yǎng)基中，30oC培養(yǎng)過夜（12h）；取1mL實(shí)驗(yàn)所得菌液，加入1mL 60%滅菌甘油，裝入保種管中，-70冰箱中保存。用另外大約1ml進(jìn)行提取DNA，通過16s(bacteria) rDNA測序進(jìn)行物種鑒定。谷氨酸菌篩選流程：以無菌操作吸取樣品lmL/1g于9mL無菌生理鹽水中,呈1:10的稀釋液，搖蕩攪拌溶解，得到為10-1，依次類推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ，然后分別涂布到分離培養(yǎng)基上，30-37

5、培養(yǎng)12-48h。觀察記錄和拍照記錄平板上菌落形態(tài)，并計(jì)數(shù)分類；用接種針從固體平板上挑選不同的形態(tài)的單菌落在分離瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化，重復(fù)一次或幾次；挑選單菌落到相應(yīng)的3ml液體分離培養(yǎng)基中，30-37 oC培養(yǎng)過夜（12h）；取1mL實(shí)驗(yàn)所得菌液，加入1mL 60%滅菌甘油，裝入保種管中，-70冰箱中保存。用另外(ln wi)大約1ml進(jìn)行提取DNA，通過16s(bacteria) rDNA測序進(jìn)行物種鑒定。準(zhǔn)備(zhnbi)工作：滅菌：刀子、鑷子、PDA固體基、生理鹽水(shnglynshu)、空試管、空培養(yǎng)皿、錐形瓶（用于溶解酒餅）、PDA液體培養(yǎng)基、錐形瓶（用于液體培養(yǎng)）PDA培養(yǎng)

6、基（用于霉菌或酵母菌培養(yǎng)）和試管斜面：馬鈴薯（去皮）：200g；蔗糖（或葡萄糖）：20g（霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖）；水1000ml；自然PH；煮爛（煮沸20-30分鐘，能被玻璃棒戳破即可），八層紗布過濾，按照培養(yǎng)基體積加入1.5-2%量的瓊脂，加熱，直接 121滅菌20分鐘左右倒平板，或加熱后試管中加入3-4mL到試管中，然后再滅菌，結(jié)束后等高壓鍋?zhàn)匀唤祲汉?，取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?。YPD培養(yǎng)基（用于霉菌或酵母菌培養(yǎng)）：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g、瓊脂20g、水1000ml；將葡萄糖溶解在水中，添加蛋白胨及酵母膏，混勻后，加瓊脂溶化，滅菌。醋酸菌分離培養(yǎng)基（用于醋酸菌

7、培養(yǎng)）葡萄糖 1%，酵母膏1%，無水乙醇3%，0.04%的溴甲酚紫5%，瓊脂1.8%，水100mL，0.1MPa滅菌20分鐘。乙醇在滅菌后培養(yǎng)基溫度降到75度左右加入。谷氨酸菌分離培養(yǎng)基（用于谷氨酸菌培養(yǎng)）葡萄糖 2%，玉米漿0.2%，磷酸(ln sun)氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.04%，尿素0.2%，溴麝香草酚蘭（BTB）0.01%，瓊脂2%，Mn2+、Fe2+各2ppm,PH 6.7,尿素(nio s)與BTB分別滅菌。MRS培養(yǎng)基（乳酸菌篩選(shixun)培養(yǎng)基）：配制（1L）:蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母提取物 5.0g，K2HPO4 2.0g，檸檬酸三銨 2.0g，

8、乙酸鈉 5.0g，葡萄糖 20.0g，吐溫80 1.0mL，MgSO47H2O 0.5g，MnSO44H2O 0.25g；調(diào)PH至6.26.4；酪蛋白胨 10g/L，牛肉浸膏 8g/L,酵母浸膏 4g/L，磷酸氫二鉀 2g/L，檸檬酸二銨2g/L，葡萄糖20g/L，吐溫80 1g/L，葡萄糖 20g/L，醋酸鈉 5g/L，硫酸鎂 0.2g/L，硫酸錳 0.04g/L，瓊脂 14g/L。CaCO3溶圈法：2.稱取20g CaCO3加入到100mL蒸餾水中，制成CaCO3乳濁液；3.將MRS培養(yǎng)基和CaCO3乳濁液分開滅菌；4.倒平板前，待培養(yǎng)基融化冷卻后，平板上加入一定量的CaCO3乳濁液，晾干

9、了以后再接種。 溴甲酚綠指示劑法：1、培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（含溴甲酚綠酒精溶液）2、同上，不同之處是稀釋涂布后長出菌落，挑取使溴甲酚綠變色的菌落。DNA分離及PCR鑒定：細(xì)菌/酵母等基因組DNA快速純化方法：1.5ml菌液于EP管中5000rpm離心5min，4，棄上清；細(xì)胞裂解裂解液1：A試劑：0.2g NaOH、80ul 0.5M EDTA、40ml H2O，不需要調(diào)節(jié)ph值，最終ph值大概12.B試劑：40mM Tris HCl ph=5 或者PBS在菌沉淀管中加大約200ul A溶液，懸浮(xunf)菌后在95-100oC煮15min-1h,每10min混勻樣品，直到所有樣品都裂解（時(shí)

10、間,A液體積要摸索）加等體積(tj)的B液中和樣品，混勻。裂解(li ji)液2：50 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM EDTA pH 8.0、100 mM NaCl、1% SDS。加適量的裂解液2懸浮細(xì)胞后，在95-100oC煮10min-1h，每10min混勻樣品，直到所有樣品都裂解. （時(shí)間,A液體積要摸索）裂解液3： Stock Solution per 100ml2% Triton X-100 10% TX-100 20 ml1% SDS 10% SDS 10 ml100 mM NaCl 2 M 5 ml10 mM Tris, pH 8.0 1 M Tris, p

11、H 8.0 1 ml1 mM EDTA 100 mM EDTA 1 mlDistilled water 63 ml加適量的裂解液3懸浮細(xì)胞后，在95-100oC煮10min-1h，每10min混勻樣品，直到所有樣品都裂解. （時(shí)間,A液體積要摸索）加等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（P：C：I=25：24：1）徹底混勻。4oC 12000rpm離心5-10min，取上清。加2倍體積的冰異丙醇（-20），徹底混勻12000rpm離心5-10min，去上清。加入500ul 70%乙醇，混勻懸浮DNA沉淀，12000rpm離心1min，小心棄上清，室溫干燥。（如果要測序等需要較干凈DNA可以重復(fù)這一步，最

12、后干燥）加適量(10-20ul) TE溶液回溶，取1ul產(chǎn)物跑0.8%的瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)，測DNA濃度，取適量DNA（10-200ng）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。霉菌DNA提取方法是（氯化芐）。（1）取在米曲汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h的新鮮米曲霉菌株大約6 g左右，按照每管3 g計(jì)算。將米曲霉菌株放入用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮，迅速研磨3-4次。取大約3 g研磨碎的粉末裝入滅過菌的40 mL的離心管內(nèi)。提取液（100 mmol/L Tris-HCl pH8.0 + 125 mmol/L EDTA pH8.0）在50的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱1 h左右。（2）每個(gè)離心管中加入(jir)10 mL提取液，充分混勻，靜置

13、2 min。（3）每個(gè)離心管中加入(jir)2 mL10 %的SDS溶液(rngy)，上下顛倒混勻后加入6 mL的氯化芐溶液，劇烈振蕩。把離心管放入50水浴鍋中孵育1 h，期間要不時(shí)地顛倒混勻。（4）每個(gè)離心管中加入3 M的 6 mL醋酸鈉（NaAc），冰浴15 min。（5）10，6000 rpm離心15 min，將上清液移入新的滅菌的40 mL離心管中。（6）加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）抽提，10，10000 rpm離心15 min，并將上清液移入新的滅菌的40 mL離心管中。（7）加入100-150 L的RNase A（100 mg/L），37孵育2 h后，用等體積的氯仿/異戊醇

14、抽提2次。（8）加入等體積的冷凍的異丙醇，10，10000 rpm離心5 min。（9）棄上清，用70 %乙醇洗2遍沉淀，最后用無水乙醇再洗一遍，干燥，2 mL水溶解，保存?zhèn)溆茫铆傊悄z驗(yàn)證。1.菌落PCR DNA的制備：挑取新鮮單菌落置于 30l 0.2 SDS 中；漩渦混勻器上混勻 15 秒；90 熱激4min；4 13000rpm1min，離心，取上清液 20L 至新的無菌離心管中，-20保藏。2.菌落PCR：挑取新鮮單菌落置于 20l 水中；漩渦混勻器上混勻 15 秒；取5L 作為PCR模板，剩余菌液放-20C保藏。用于酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列：菌株26SrDNAD

15、1/D2區(qū)的 PCR 擴(kuò)增26SrDNAD1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增的引物對(duì)為NL1（5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3）；NL4（5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3）；Initial denaturation at 94C for 3 min; 36 cycles of 94C for 2 min, 52C for 1 min, 72C for 2 min; final extension at 72C for 7 min, holding at 4C.Jespersen, L., Nielsen, D.S., Hnholt, S., Jakobsen, M.,

16、2005. Occurrence and diversity of yeasts involved in fermentation of West African cocoa beans. FEMS Yeast Research 5, 441e453.用于細(xì)菌16S rDNA序列:Primers for the PCR amplication of16S rDNA were selected from conserved regions of the 5-end (16Sd, 5-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3) and the 3-end (16Sr, 5-GGAGGTGA

17、TCCAGCCGCAGGT-3) of the 16S rDNA. For amplication of the 16S rDNA, samples were incubated for 5 min at 94 C and then cycled 35 times at 94C for 1 min,58C for 1 min and 72C for 2 min. The samples were then incubated for 10 min at 72C for a nal extension and maintained at 4C until tested.Ruiz, A., Poblet, M., Mas, A., Guillamon, J.M., 2000. Identification of acetic acid bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S rDNA and 16S23S rDNA intergenic spacer. International Journal of Systematic and