pcr技術(shù)及其應(yīng)用-ppt課件

1、PCR技術(shù)及其應(yīng)用 周俊宜基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室目 錄PCR技術(shù)簡史 PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物R

2、NA引物PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)

3、明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎Kary B. Mullis 1989年美國Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989

4、年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究基因組DNA獲取特定DNA片段擴(kuò)增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94變性50-65退火XX延伸945537Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20729455PCR循環(huán)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種d

5、NTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L1234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈

6、與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增

7、PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA引物設(shè)計(jì)：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40 bp為宜。（3）堿基盡可能隨機(jī)分布，G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。（6）引物3端為關(guān)鍵堿基；5端無嚴(yán)

8、格限制。3535限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記1）PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)條件（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（4）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿

9、基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。2）循環(huán)參數(shù)變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈 95oC 20-30秒(2) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸 70-75oC， 延伸時(shí)

10、間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版DNA的濃度 一般為25-35次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低 錯誤摻入率增加PCR的類型和應(yīng)用研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他1）不對稱PCR 目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究 高濃度引物低濃度引物2)反向PCR (revers

11、e PCR) 是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶3）多重PCR用于檢測特定基因序列的存在或缺失。電泳引物4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、熒光素等對引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷 可同時(shí)檢測多種基因成分病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4標(biāo)記引物觀察PCR產(chǎn)物5）

12、錨式PCR已知靶基因片段兩測的序列 VHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLcDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3GGGG5CCCC 錨定引物3GGGG5CCCC3GGGGCCCC6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴(kuò)增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號7）原位 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細(xì)胞的前提下，利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測病理切片中含量較少的

13、靶序列 原位PCR的作用 既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH），但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下，該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列，敏感度很高，但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。 ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來，成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。操作步驟 細(xì)胞或組織的固定 PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段 原位雜交檢測擴(kuò)增產(chǎn)物人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片 8）逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈P

14、CR擴(kuò)增基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)的應(yīng)用1) 基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段55Bam H IBam H IBam H IBam H IGTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG質(zhì)粒DNA目的基因限制性核酸內(nèi)切酶2)基因檢測A內(nèi)源性病變基因正常人A病 人病原微生物基因正常人 (-)病 人 (+)遺傳病的診斷 基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白鏈合成不平衡A正常人病 人正常病人ASO探針法ACTGASO探針正常病人探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子PCR-RFLP法： 限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突變限制性內(nèi)切酶正常突變電泳 HLA系