-肝糖原的提取、鑒定與定量(共8頁(yè))

1、生物化學(xué)(shn w hu xu)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名： 范嘉俊 學(xué) 號(hào)： 3140070081 專業(yè)(zhuny)年級(jí)： 2014級(jí)中西醫(yī)臨床(ln chun)五年制 組 別： FORMTEXT 第四實(shí)驗(yàn)室 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)名稱(Title of Experimetn)肝糖原的提取、鑒定與定量實(shí)驗(yàn)日期(Date of Experiment)2016-01-07實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(Lab No.)第四實(shí)驗(yàn)室合作者(Partner)劉海指導(dǎo)老師(Instructor)殷志新總分(Total Score)教師簽名(Signature)批改日期(Date)1.實(shí)驗(yàn)原理（1）肝糖原提取與鑒定提?。?/p>

2、1.糖原儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)，采用研磨勻漿等方法可使細(xì)胞破碎，釋放出糖原。2. 5%三氯醋酸溶液能使用糖原與蛋白質(zhì)分離，糖原保存于上清液，而蛋白質(zhì)沉淀。3.糖原不溶于乙醇而溶于熱水，故先用95乙醇將濾液中糖原沉淀，再溶于熱水中。鑒定：糖原水溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色。糖原還可被酸水解為葡萄糖。利用呈色反應(yīng)和葡萄糖的還原性，可判定肝組織中糖原的存在。（2）肝糖原定量測(cè)定糖原在濃酸中可水解成為葡萄糖，濃硫酸能使葡萄糖進(jìn)一步脫水生成糖醛衍生物5-羥甲基呋喃甲醛，此化合物再與蒽酮脫水縮合生成藍(lán)色的化合物。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收。糖含量在(10100)mg范圍內(nèi)，溶液顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。利

3、用此反應(yīng)與同樣處理的已知葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)溶液比色，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法（直接比較法）即可計(jì)算出樣品中糖原的含量。糖原在濃堿溶液中非常穩(wěn)定，故在顯色之前，肝組織先置于濃堿中加熱，以破壞其它成分，而保留肝糖原。2.實(shí)驗(yàn)材料（1）實(shí)驗(yàn)樣品：雞肝。（2）主要試劑：肝糖原的提取與鑒定： 95%乙醇，0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液，0.15mol/LNaCl溶液，濃鹽酸，NaOH溶液，碘試劑。肝糖原定量測(cè)定： 30%KOH溶液，0.5mg/ml的葡萄糖溶液，蒸餾水，蒽酮顯色劑。（3）主要儀器與器材：可見光分光光度計(jì)，恒溫水浴箱，試管架，三支支試管，加樣槍，加樣槍架，普通離心機(jī)，研缽，刻度吸量管，白瓷反應(yīng)器

4、，100ml容量瓶。3.實(shí)驗(yàn)步驟（1）實(shí)驗(yàn)流程肝糖原的提取與鑒定注意事項(xiàng)：在提取肝糖原中，向上清液中加入乙醇后，要充分混勻（可以用玻璃棒攪拌）。糖原中葡萄糖螺旋鏈吸附碘產(chǎn)生的顏色與葡萄糖殘基的多少有關(guān)。肝糖原分支中葡萄糖殘基在20個(gè)以下，吸附碘后呈現(xiàn)紅棕色。糖原水解液中葡萄糖的鑒定一步，加班氏試劑不能過(guò)量，否則反應(yīng)液呈黑色渾濁，觀察不到應(yīng)有的結(jié)果。肝糖原的定量測(cè)定步 驟操作糖原提取在試管中加入30%KOH1.5ml，在稱取0.100.15g肝組織放入試管中，置沸水浴中15min。取出后冷卻，將管內(nèi)容物全部移入100ml容量瓶，定容，搖勻。糖原的測(cè)定取3支試管，按下表操作：試劑（ml）空白管標(biāo)準(zhǔn)

5、管樣品管蒸餾水 1.0-標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液-1.0-糖原提取液-1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混勻，沸水浴10min，冷卻。在分光光度計(jì)620nm波長(zhǎng)處，用空白光溶液調(diào)零，測(cè)定個(gè)溶液的吸光光度（A）。計(jì)算出樣品肝糖原含量。注意事項(xiàng)： 肝組織必須在沸水浴中完全溶解，否則影響比色。注意要全部溶液，用水多次洗試管，一并收入容量瓶中。蒽酮溶液必須2倍于被測(cè)液。若肝糖原含量小于1%，須改用間接測(cè)量法，即肝組織消化后，用95%乙醇沉淀糖原。4.實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象（1）糖原的提取與鑒定雞肝上清液經(jīng)乙醇處理，離心后得到微量的白色沉淀物。沉淀上清液糖原溶解液滴加碘液后，對(duì)比純碘液，有紅棕色物質(zhì)生成

6、。純碘液紅棕色物質(zhì)用班氏試劑與糖原水解液反應(yīng)，混勻后沸水浴2min，發(fā)現(xiàn)管壁有磚紅色沉淀。反應(yīng)前 反應(yīng)后（2）肝糖原定量測(cè)定加蒽酮試劑的糖原溶液（水浴后）：樣品管標(biāo)準(zhǔn)管空白管可見：空白管中為淺黃色；標(biāo)準(zhǔn)管中為藍(lán)綠色；樣品管中為淺綠色。3.原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)： 620nm波長(zhǎng)吸光值記錄表測(cè)定次數(shù)各管吸光值（A620）空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管100.6540.098200.6540.098300.6530.098各管平均值62000.65370.0985.結(jié)果與討論：1.結(jié)果由碘液反應(yīng)結(jié)果可知，雞肝中存在少含量的肝糖原。肝糖原含量計(jì)算：根據(jù)如下公式：肝糖原（g/100g肝組織）=A樣本 /A標(biāo)準(zhǔn) 0.05(100/肝組織重) 0.11.11計(jì)算得本組肝糖原含量為0.554g/100g肝組織。2.討論（1）肝糖原的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)：第二次離心后的糖原溶液白色沉淀明顯；加碘試劑與糖原試劑混合有紅棕色沉淀，鑒定出糖原；實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期基本吻合，實(shí)驗(yàn)基本成功 （2）肝糖原的定量測(cè)定實(shí)驗(yàn)：通常，每百克雞肝組織中肝糖原含量在2-3克之間。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)得肝糖原數(shù)值（0.554g/100g肝組織，即0.554%）偏低于標(biāo)準(zhǔn)范圍值，這可能是由于沸水浴后冷卻后轉(zhuǎn)移液體的時(shí)候部分液體殘留在試管未完全轉(zhuǎn)移或者轉(zhuǎn)移時(shí)部分液體流失導(dǎo)致肝糖原損失，進(jìn)