單克隆抗體 酶標(biāo)記方法介紹

1、 單克隆抗體 酶標(biāo)記方法介紹交聯(lián)法交聯(lián)法通常用的交聯(lián)劑是戊二醛，戊二醛商品大多為25%的水溶液，利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基，分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結(jié)合而進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記時應(yīng)盡量采用新鮮純品，當(dāng)戌二醛的OD235nm/OD280nm3時，即為好的交聯(lián)劑。戊二醛交聯(lián)法又分為一步法和二步法。 一步法：即把酶、戊二醛和抗體一起加入進(jìn)行交聯(lián)。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物。由于抗體分子量大(16萬)，酶分子量小(4萬),抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多，結(jié)果生成的抗體戊二醛或抗體戊二醛抗體多而造成酶標(biāo)物的活性小。一步法操作：抗IgGAKP的制備：

2、將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生，完全溶解后，緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最終濃度為0.2%，移至室溫中靜置2h3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4充分透析或以SephadexG25柱除去過量的戊二醛，4保存?zhèn)溆?也可保存于50%甘油中置低溫冰箱)；抗IgGHRP的制備：將12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室溫2h3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，

3、避免反復(fù)凍融?；蚶鋬龈稍锉４?。 二步法：是先使酶與戊二醛反應(yīng),除去未反應(yīng)的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結(jié)合，最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作：將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反應(yīng)的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液，混合后4冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L賴氨酸，置室溫2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，離心去沉淀，上清液即為酶結(jié)

4、合物，再進(jìn)一步以硫酸銨沉淀純化后應(yīng)用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。改良HRP二步標(biāo)記法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中，加入25%戊二醛0.1ml，37溫育2h后加入冰冷的分析純的無水乙醇2ml，2 500r/min離心沉淀10min15min，傾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml5ml混懸，同上離心，傾去乙醇，將管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，加入0.5ml1ml 抗IgG抗體溶液(含抗體15mg左右)，放在冰箱內(nèi)過夜后，加KH2 PO4，使近中

5、性即可應(yīng)用。氧化法采用過碘酸鈉，過碘酸鈉是強(qiáng)氧化劑，能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關(guān)的部分)的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標(biāo)抗體。（1）氧化法操作過程如下：將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無水乙醇溶液,在室溫中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4)，置室溫中輕攪30min，在溶液呈黃綠色時，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室溫中放置1h，使氧化反應(yīng)中止，然后在4中對0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析，換液3次。在3ml HR

6、P醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中)，室溫置2h3h，加入5mg氫化硼鈉(NaBH4)，于4冰箱放置3h或過夜，然后用PBS液充分透析，離心去沉淀物。上清液即為酶結(jié)合物，純化后使用。（2）改良過碘酸鈉法：取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水128mg NaIO4) 0.5ml，混勻，置430min； 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O 0.09ml乙二醇)0.5ml，室溫放置30min；加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液

7、緩緩攪拌透析6h(或過夜)，使之結(jié)合；加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混勻，置42h；在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，430min，離心，去上清，沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4透析除鹽過夜；次日取出離心，以除去不溶物，即得酶抗體(HRPIgG)結(jié)合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；效價測定合格后，加入等量優(yōu)質(zhì)甘油，分裝小瓶，低溫保存。戊二醛法與過碘酸鈉法比較比較項(xiàng)目戊二醛法過碘酸鈉法一步法二步法標(biāo)記方法簡單較復(fù)雜較復(fù)雜酶利用率24%24%70%酶偶聯(lián)到99%抗體上產(chǎn)率5%5%50%標(biāo)記

8、抗體分子量750萬25萬40萬穿入組織能力差好一般抗體活性丟失多少較多酶活性丟失多少較多染色效應(yīng)差較好較好二馬來酰亞胺法二馬來酰亞胺(Dimaleimide)能與蛋白質(zhì)半胱氨酸的硫基反應(yīng)。首先用巰基乙胺還原蛋白質(zhì)(IgG),并用N、N苯二馬來酰亞胺活化，然后除去多余的試劑，最后使含二馬來酰IgG與含硫基的半乳糖苷酶連接。具體操作如下：將抗lgG抗體溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸鈉緩沖液并對同一緩沖液透析平衡過夜,離心除去不溶性物質(zhì),抗IgG(14mg/2ml)與10ml巰基乙胺在37溫育90min。過Sephadex后濃縮使每ml含3.0mg左右的還原抗IgG。在0中,按11滴加飽和N、NO苯二馬來酰亞胺溶液，混合，于30溫育20min，過SephadexG25柱，除去未反應(yīng)的二馬來酰亞胺。收集二馬來酰亞胺“活化”的抗IgG,濃縮使?jié)舛葹镺D280nm=1.0(光