常用方法學(xué)簡介

1、研究技術(shù)（一）光學(xué)顯微鏡技術(shù)（二）電子顯微鏡技術(shù)（三）組織化學(xué)術(shù)（四）免疫組織化學(xué)術(shù)（五）原位雜交術(shù)（六）細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù)（七）組織培養(yǎng)術(shù)（八）放射自顯影術(shù)1 問 題 解決方法 觀察對象太小 放大 顯微鏡光線不能透過觀察對象 切片觀察對象缺乏反差 染色觀察對象生化成分不同 細(xì)胞化學(xué) 免疫組織化學(xué)觀察對象為生活狀態(tài) 培養(yǎng)2（一）光學(xué)顯微鏡技術(shù)1、一般光學(xué)顯微鏡2、熒光顯微鏡3、相差顯微鏡4、激光掃描共聚焦顯微鏡3（二）電子顯微鏡技術(shù)1、透射電子顯微鏡2、掃描電子顯微鏡4（三）組織化學(xué)術(shù)1、多糖2、脂類3、酶4、核酸5（四）免疫組織化學(xué)術(shù)（五）原位雜交術(shù)（六）細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù)1、顯微分光光

2、度測量術(shù)2、形態(tài)計量術(shù)3、流式細(xì)胞術(shù)（七）組織培養(yǎng)術(shù)（八）放射自顯影術(shù)6（一）光學(xué)顯微鏡術(shù)light microscope（LM）1 石蠟切片取材 Formalin 40%, 4%固定 Bouin Formalin 40% 25ml 苦味酸飽和水溶液 75ml 冰醋酸 5ml 脫水-乙醇、包埋-石蠟切片 6um脫蠟 二甲苯乙醇 水 染色 HE Hematoxylin： 核酸RER、 Ribosome Eosin： 蛋白、膜結(jié)構(gòu)（mitochondria、 SER、lysosome）透明、封片78910111213141516171819202122232425262728293、涂片 血涂片

3、精液 痰液 培養(yǎng)細(xì)胞4、鋪片5、磨片 骨和牙需制成磨片、經(jīng)染色后觀察3031323334353637（二）電子顯微鏡技術(shù) 電子顯微鏡（簡稱電鏡）的發(fā)明和使用，使組織胚胎學(xué)研究內(nèi)容發(fā)生了深刻變化。光鏡分辨率為0.2um，放大倍數(shù)約為1000倍，而電鏡的分辨率為0.2nm，比光鏡高1000倍，可放大幾萬倍至幾十萬倍，因此電鏡能觀察到更微細(xì)的結(jié)構(gòu)。在電鏡下所見的結(jié)構(gòu)稱為超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)。38 用于觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，標(biāo)本制備比光鏡的要求更嚴(yán)格，組織塊要更新鮮，體積更?。?mm3），固定常用戊二醛和鋨酸。切片則用超薄切片機(jī)，制成5080nm的超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，然后

4、在電鏡下觀察并攝片。1、透射電鏡（transmission electron microscope）3940414243444546 用于觀察組織或細(xì)胞表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)，標(biāo)本需經(jīng)噴鍍金屬膜特殊處理，然后在掃描電鏡下觀察，在熒光屏上掃描成像，呈現(xiàn)富于立體感的表面圖像，如細(xì)胞表面的微絨毛、纖毛和細(xì)胞伸出的偽足等。2、掃描電鏡（scanning electron microscope)4748495051522、冰凍切片 組織置入液氮（-196）快速凍結(jié)，恒冷切 片機(jī)切片、染色。 更好保存細(xì)胞內(nèi)酶的活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 缺點(diǎn)：組織片厚，經(jīng)冷凍后易破壞組織結(jié)構(gòu)532、熒光顯微鏡（fluorescence

5、microscope） 由光源、濾光系統(tǒng)和顯微鏡三個部分組成。光源為高壓汞燈，可產(chǎn)生紫外光，標(biāo)本中的自發(fā)熒光物質(zhì)或經(jīng)熒光素染色或標(biāo)記的結(jié)構(gòu)在紫外光激發(fā)下可產(chǎn)生各種顏色的熒光，以此來研究該熒光物質(zhì)在細(xì)胞和組織中的分布。543、相差顯微鏡（phase contrast microscope） 用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)中活細(xì)胞的觀察，可使無色透明的細(xì)胞鏡下結(jié)構(gòu)反差明顯，圖像清晰。554、激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope） 是近年研制和應(yīng)用的一種新型顯微鏡。它將激光束落在樣品上，并作移動掃描，對樣品內(nèi)某種熒光標(biāo)記的物質(zhì)進(jìn)行二維和三維的動態(tài)微量分析測定。

6、可用來研究活細(xì)胞內(nèi)Ca2、 Na+和 K+等pH值的動態(tài)變化；細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器、細(xì)胞骨架、核酸、蛋白質(zhì)和受體等的定位和定量分析；細(xì)胞膜電位、膜通道及信息傳遞的檢測；利用激光對細(xì)胞結(jié)構(gòu)或染色體作切割、分離和克隆等逐漸成為生物醫(yī)學(xué)研究中重要的研究手段。5657（三）組織化學(xué)術(shù)（histochemistry） 應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)與物理反應(yīng)原理檢測組織或細(xì)胞內(nèi)某種化學(xué)成分并進(jìn)行定位、定量及相關(guān)功能研究的技術(shù)。581、多糖 顯示多糖或蛋白多糖的常用方法是過碘酸雪夫反應(yīng)(periodic acid Schiff reaction,PAS反應(yīng))。組織或細(xì)胞中的多糖被結(jié)合形成紫紅色沉淀物。此反應(yīng)稱PAS陽性反應(yīng)，P

7、AS陽性部位為多糖存在部位。5960612、脂類 標(biāo)本用甲醛固定，冷凍切片，用油紅O、尼羅藍(lán)或蘇丹類染料染色，使組織和細(xì)胞中的脂類物質(zhì)顯示相應(yīng)顏色。亦可用鋨酸固定兼染色，脂類呈黑色。6263643、酶 酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的基本原理是利用酶對其相應(yīng)底物的水解、氧化等作用，使底物的反應(yīng)產(chǎn)物被某種捕獲劑捕獲并在原位沉淀，形成有色的終產(chǎn)物，借此測定該酶在細(xì)胞內(nèi)的分布及活性強(qiáng)弱。65664、核酸 顯示DNA的傳統(tǒng)方法是Feulgen反應(yīng)（Feulgen reaction），組織切片或細(xì)胞涂片先經(jīng)稀鹽酸處理，使DNA水解，醛基暴露，再用雪夫試劑處理，形成紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物。67（四）免疫組織化學(xué)術(shù)（immunoh

8、istochemistry） 利用免疫學(xué)抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，檢測組織或細(xì)胞中的多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分布。為顯示抗原抗體復(fù)合物的存在，需進(jìn)行抗體標(biāo)記；用熒光素如異硫氰酸熒光素標(biāo)記，可以在熒光顯微鏡下觀察，用膠體金標(biāo)記，可以在電鏡下觀察，用辣根過氧化酶標(biāo)記，則可在光鏡下或在電鏡下觀察。常用的方法有直接法、間接法和親和素-生物素復(fù)合物法（ABC法）等。686970熒光的觀察（按標(biāo)本分類） 在熒光顯微鏡下觀察的標(biāo)本，當(dāng)然必須發(fā)出熒光，可是大多數(shù)標(biāo)本本身不能發(fā)出熒光，因而必須用熒光色素處理過才能發(fā)出熒光。（A）自發(fā)熒光（B）二次熒光（C）抗體熒光技術(shù)71（A）自發(fā)熒光（不加染色） 有些物質(zhì)

9、不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光），但在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)（細(xì)胞學(xué)、生物組織、培養(yǎng)體等）領(lǐng)域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光，常采用后兩種方法。 測定物質(zhì)的熒光光譜或者激發(fā)光譜，可以判定物質(zhì)性質(zhì)（熒光光度法）。 應(yīng)用：生物學(xué)方面判定維生素，研究生物學(xué)上的生物源的胺。72（B）二次熒光（用化學(xué)染色） 非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、炭水化合物等）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進(jìn)行觀察，對特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細(xì)胞區(qū)別（分離）出來而可以觀察到。 應(yīng)用：吖啶橙+核酸 金胺+結(jié)核菌 介子奎二噁因+染色體73（C）抗體熒光技術(shù)（用免疫染色） 利用特定的抗原必然

10、和特定的抗體相結(jié)合這一個事實，有意識地使帶熒光標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗原進(jìn)行抗原/抗體反應(yīng)，這樣兩者的結(jié)合體就能通過抗體的熒光觀察到。熒光顯微鏡最常用于抗體滎光技術(shù)進(jìn)行觀察，并成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)很多領(lǐng)域中極為有用的工具。74Glial fibrillary acidic protein75熒光色素+物質(zhì) 激發(fā)方法 吸收波長 輻射熒光（自發(fā)熒光）維生素A 紫外（UV） 325-345nm 470-490nm維生素B6 紫外（UV） 356 432 兒茶酚胺 紫（V） 410（405-415） 480（475-485）血清素（5-羥色胺） 紫（V） 390（385-400） 530（520-540）葉

11、綠素 蘭（B） 520 650-66076熒光色素+物質(zhì) 激發(fā)方法 吸收波長 輻射熒光（二次熒光）芥子奎二噁因 蘭紫（BV） 450 500四環(huán)素+骨，牙 紫（V）或蘭（B） 390 560吖啶橙+DNA 蘭（B） 460 530吖啶橙+RNA 蘭（B） 460 650金胺+結(jié)核菌 蘭（G） 470 557福爾根反應(yīng)+DNA 綠（G） 550 650溴化乙啶（EB）+DNA 綠（G） 545 605Propidium Iodide（PI）+DNA 綠（G） 530 615DAPI+A-T 紫外（U） 372 456Mithramycin+G-C 蘭紫（BV） 395 570Olivomycin

12、+G-C 蘭紫（BV） 430 545 77熒光色素+物質(zhì) 激發(fā)方法 吸收波長 輻射熒光（抗體熒光技術(shù)） FITC 蘭（B） 495 525TRITC 綠（G） 555 580羅達(dá)明（Rhodamine） 綠（G） 568 597尼羅紅+溶酶體 蘭，綠（B、G） 485-530 525-605派若寧丫+線粒體 綠（G） 540 47078（五）原位雜交術(shù)（in situ hybridization） 通過檢測細(xì)胞內(nèi)mRNA和DNA分子序列片段，原位顯示細(xì)胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。應(yīng)用某種已知的并被標(biāo)記的RNA或DNA片段即核酸探針（cRNA或cDNA），與細(xì)胞內(nèi)的待測核酸（RNA或DN

13、A片段）進(jìn)行雜交，通過標(biāo)記物的顯示在光鏡和（或）電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。79標(biāo)記胰島素cRNA探針，示胰島素mRNA陽性80（六）細(xì)胞和細(xì)胞化學(xué)定量術(shù)1、顯微分光光度測量術(shù)2、形態(tài)計量術(shù)3、流式細(xì)胞術(shù)811、顯微分光光度測量術(shù)（microspectrophotometry） 應(yīng)用顯微光光度計，以物質(zhì)分子對光波的選擇性吸收為基礎(chǔ)，在顯微鏡下對生物樣品中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。822、形態(tài)計量術(shù)（morphometry） 運(yùn)用幾何學(xué)和統(tǒng)計學(xué)原理，對組織或細(xì)胞進(jìn)行二維和三維的形態(tài)測量研究，如對細(xì)胞的數(shù)量、體積、表面積和周長的相對和絕對值的測量等。833、流式細(xì)胞術(shù)（flow cy

14、tometry） 是近年發(fā)展起來的細(xì)胞分類和定量研究技術(shù)，能對細(xì)胞的生物化學(xué)和生物物理特性進(jìn)行快速定量測定，還可分選收集各種細(xì)胞。該技術(shù)的建立為細(xì)胞動力學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)和腫瘤學(xué)等的研究提供了重要的研究手段。如細(xì)胞周期各時相細(xì)胞的比例，同步分析細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量，T淋巴細(xì)胞亞群的分離和定量，淋巴細(xì)胞表面受體的分析，分離和濃縮造血干細(xì)胞，血細(xì)胞增殖情況，惡性腫瘤早期診斷，藥物作用機(jī)制等。84（七）組織培養(yǎng)技術(shù)（tissue culture） 是將離體的細(xì)胞、組織或器官置于培養(yǎng)基中，在無菌和適宜溫度及酸堿度條件下進(jìn)行培養(yǎng)成活，藉以觀察各種物理、化學(xué)和生物因素對組織或細(xì)胞的作用，探索和提示細(xì)胞生命活動規(guī)律和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能變化。8586新鮮實體組織細(xì)胞分離 膠原纖維1、酶消化法原理 緊密連接 粘多糖常用酶 蛋白酶類-胰酶：脂鍵、肽鍵 -膠原酶：膠原 -溶菌酶：糖蛋白和肽的糖苷鍵 血管 -彈性蛋白酶：糖蛋白和彈性蛋白 心臟 肝臟87注意：溶解液-酶效價 時間-新鮮組織、酶解時間過長，細(xì)胞自溶 pH值-堿性：胃蛋白酶失活 -中性：胰酶活性欠佳 酶純度 細(xì)胞膜改變882、機(jī)械法