2提質粒_XXXX年分子生物學實驗ppt課件

1、實 驗 一質粒DNA的提取及鑒定.背景實際知識Section 1.掌握質粒信息和用途，學會本人看質粒圖譜掌握快速提取小量質粒DNA的方法了解質粒DNA提取的根本原理掌握瓊脂糖凝膠電泳的方法1.1.1 實 驗 目 的.1.1.2 載 體定義：基因工程中攜帶目的基因進入宿主 細胞進展擴增和表達的工具。類型：大腸桿菌中的質粒、噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母人工染色體載體及動、植物病毒載體等。.載體的根本條件復制子：一段具有特殊構造的DNA序列，使與之結合的外源基因復制。可檢測的遺傳表型：如抗藥性、顯色表型反響。限制性內切酶的單一識別位點：便于外源基因的插入。適宜的拷貝數：較高的拷貝數不僅有

2、利于載體的制備；使細胞中克隆基因的劑量添加。1.1.2 載 體.質 粒 載 體是染色體外小型的雙鏈環(huán)狀的DNA，常用載體之一自我復制具有適宜的限制酶切位點挑選標志 可編碼某些遺傳性狀 如抗藥性、耐受重金屬、產生細菌素等，被質粒轉化的細菌也獲得了額外的特性高拷貝數小分子量1-200Kb 高穩(wěn)定性1.1.2 載 體.克隆載體表達載體原核真核穿越載體pGEM-T, pENTRpET28a(+), pGEX, pMAL pcDNA3.0, pEGFP-N3, pRK 質 粒 載 體 的分類根據用途分類1.1.2 載 體.質粒原核載體1.1.2 載 體.1.1.2 載 體.質粒真核載體1.1.2 載 體

3、.1.1.3 質粒提取普通步驟細菌培育物的生長細菌的收獲和裂解質粒DNA的純化.質粒提取的常用方法堿解法、煮沸法cDNA、pDNA變性、復性不同苯酚抽提法酸性、低離子強度時超螺旋在水相分布CsCl法EB插入呵斥DNA浮力密度不同SDS 裂解法高鹽濃度下大分子沉淀，質粒在上清玻璃纖維膜法(試劑盒)1.1.3 質粒提取.堿裂解法提取質粒DNA目的要求 經過本實驗學習和掌握堿裂解法提取質粒的方法和技術。1.1.3 質粒提取.實驗原理 根據共價閉合環(huán)狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差別來分別質粒DNA。在pH12.0-12.5，線性的DNA雙螺旋構造解開而被變性，雖然在這樣的條件下，質粒DN

4、A的氫鍵斷裂，但兩條互補鏈仍嚴密結合。當參與pH4.8的KAc高鹽緩沖液中和pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質粒DNA復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性慢，纏繞構成網狀構造。經過離心，染色體DNA與RNA、蛋白質-SDS復合物等一同絮狀沉淀下來而被除去。堿裂解法提取質粒DNA1.1.3 質粒提取.實驗操作Section 2.1.2.1 實驗資料含質粒載體pET28a和含目的基因質粒pEGFP-N3的大腸桿菌DH5a溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷Tris.HClpH8.0 10 mmol/L 乙二胺四乙酸EDTApH8 .0

5、溶液II 0.4 mol/L NaOH， 2% SDS用前等體積混合 溶液III 5 mmol/L 乙酸鉀 ， 冰乙酸 ，H2O .苯酚：氯仿25：24氯仿：異戊醇(24：1)無水乙醇， 70%乙醇(-20C保管) TE緩沖液: 10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0)胰RNA酶 1.2.1 實驗資料.1.2.2 實驗程序義務分配：A1和B1提取pET28a質粒A2和B2提取pEGFP-N3質粒.1、細菌培育和搜集將3ml含Kan的LB液體培育基參與到試管中，接入含質粒的大腸桿菌，37振蕩培育過夜。已完成取2.5mL培育物倒入微量離心管EP管中, 1000

6、0rpm離心1min，吸去培育液。.2、細菌裂解及質粒的提取將細胞沉淀懸浮于100ul溶液I中,充分震蕩混勻。加200ul溶液II(新穎配制),蓋緊管蓋,悄然混勻內容物,將離心管放冰上5min。加150ul溶液III(冰上預冷),蓋緊管口,悄然顛倒數次使混勻。冰上放置5min。12000rpm離心10min,將上清轉至另一EP管作好標志中。1.2.2 實驗程序.向上清中參與等體積450ul酚:氯仿(1:1) 留意下層是有機相,反復混勻。12000rpm,離心2分鐘,將上清小心地轉移到另一離心管標志！中參與等體積450ul氯仿:異戊醇 (24:1),反復混勻。12000rpm,離心2分鐘，取上清

7、液于新的EP管中。3、質 粒 的 純 化1.2.2 實驗程序.4、質粒的濃縮參與2倍體積900ul無水乙醇,混勻后,室溫放置10min。12000rpm離心5分鐘，倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體。用1ml 70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀, 振蕩并離心, 12000rpm離心2分鐘，倒去上清液, 空氣中枯燥510min。1.2.2 實驗程序.5、質粒的溶解和保管加20ul TE緩沖液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。-20保管。1.2.2 實驗程序.樣品保管1A1 1A2 1B1 1B2 2A1 2A2 2B1 2B2 3A1 3A2 3B1 3B2 4 5

8、67 8 910 11 1213 14 151.2.2 實驗程序.6、質粒DNA的電泳檢測1瓊脂糖凝膠的制備每4人制備一塊瓊脂糖凝膠6個泳道0.2克瓊脂糖+20毫升TAE緩沖液，電爐融膠充分溶解，略微冷卻加2lgoldviewna顯示液，倒在電泳膠槽中，使膠凝固(20min)。1.2.2 實驗程序.2瓊脂糖凝膠電泳每人1個樣品，pET28a或pEGFP-N3。取3l質粒DNA+1.0l點樣緩沖液，在parafilm膜上混勻后全部點至瓊脂糖凝膠孔記住本人點樣位置。接通電泳儀和電泳槽的電源(留意正負極)-+恒壓150V,電泳10-20分鐘紫外燈下察看并記錄結果(對面實驗室拍照片)分析結果。1.2.

9、2 實驗程序.負極正極1A11A21B11B22A12A22B12B2Marker1.2.2 實驗程序.實驗關鍵點溶液I參與后充分懸浮溶液II一次性參與后輕柔地顛倒混勻溶液III參與后輕柔地顛倒混勻酚抽提后小心汲取上清無水乙醇和70%乙醇不要弄混微量加樣器的正確運用.移液器排氣式和排液式1選擇一支量程適宜的移液器2設置移液量3裝槍頭4檢驗移液量5汲取一定體積的液體6目測吸入槍頭的液體體積能否合理7釋放液體8退下槍頭.實驗要求：每人提取質粒2份pET28a和pEGFP-N3各一份溶液每大組一套槍每2人一套Tips 2人一套3盒.思 考 題分子生物學實驗常用的載體有哪些？它們的特點是什么？分別基因組DNA和質粒