抗體工程制藥PPT通用課件

1、第四章 抗體工程制藥 教學目標：掌握抗體藥物制備的基本原理和技術。教學要求：了解免疫現象和抗體藥物制備的發(fā)展簡史，了 解基因工程抗體和抗體工程技術的基本內容；理解抗 體藥物的結構和生物學活性與單克隆抗體靶向制劑的 研究意義；掌握單克隆抗體的基本概念與制備原理和 鼠源性單克隆抗體的改造方法。教學重點：單克隆抗體的基本概念與制備原理和鼠源性單 克隆抗體的改造方法。教學難點：抗原表位的概念、單克隆抗體的制備原理。 Contents of chapter 41、概述 2、單克隆抗體的制備 3、鼠源性單克隆抗體的改造 4、基因工程抗體和抗體工程 GoGoGoGoGo5、抗體藥物 “疫”：流行性傳染病，免

2、疫即免于發(fā)生傳染病。盡管近代才出現“免疫”這個詞，但是人們在遠古時代就已認識了免疫現象。公元前5世紀希臘半島的戰(zhàn)史中，描述了在傳染病流行時，由患過該病的人來護理病人和埋葬尸體的事例。公元384年，晉朝葛洪在肘后備急方中記載“療狂犬咬人方，乃殺所咬犬，取腦傅之，后不復發(fā)” 。4.1 抗體工程制藥概述1、有關免疫學知識 免疫是機體對異種、異體及自身物質所產生的反應，即機體“自我識別，排除異己”，以達到自身穩(wěn)定的一種復雜的生理性保護，并且與人體的胚胎發(fā)育、疾病發(fā)生、衰老等一系列的生命過程有密切關系，是人體進化的結果。 免疫學是研究人類和實驗動物體內、外免疫反應的本質及其變化規(guī)律的科學。 免疫系統是由

3、淋巴器官（胸腺、骨髓、淋巴結、脾和扁桃體）、淋巴組織以及免疫細胞（淋巴細胞、漿細胞和巨噬細胞）借助血液和淋巴循環(huán)相互聯系而組成的功能系統。 T淋巴細胞（表面有抗原識別受體）巨噬細胞 B淋巴細胞（表面有抗原識別受體）人體內三種主要的免疫細胞巨噬細胞B細胞T細胞抗原識別受體目標對象作用方式無有（表面有1000個抗原識別受體，有特異性）有（表面有10萬個抗原識別受體，有特異性）幾乎所有的抗原類物質如細菌、病毒、衰老細胞。體液中的抗原（部分病毒除外），如細菌。吞噬或感染了病毒等抗原的細胞、外來器官等。吞噬產生抗體釋放細胞毒素三種免疫細胞的比較外源蛋白、細菌、病毒等抗原B細胞作用過程(體液免疫)漿細胞B

4、細胞產生抗體抗體使抗原失去活性特異抗原識別受體T細胞作用過程（細胞免疫）感染了抗原的細胞或吞噬了抗原的巨噬細胞，外來細胞。T細胞活性T細胞產生細胞毒素攻擊受感染細胞。受感染細胞死亡 自然被動免疫 母體的特異性抗體IgG通過胎盤或初乳中的分泌型IgA進入胎兒體內或嬰兒體內，使胎兒或嬰兒被動的獲得母體抗體的方式。 嬰兒在出生后6個月內很少得傳染病，是從母體獲得被動免疫的結果。 自然自動免疫 在自然條件下，人體被病原體感染后所獲得的免疫力。這種免疫可以通過得傳染病獲得，也可經過隱性感染獲得。宋朝（十一世紀）時吸入天花痂粉預防天花 ；明代（公元十七世紀七十年代左右）接種“人痘”，預防天花； 十八世紀后

5、葉，英國鄉(xiāng)村醫(yī)生Jenner種“牛痘”預防天花。 病原菌致病與疫苗十九世紀中葉，顯微鏡的改進導致病原菌的發(fā)現；1850年在羊的血液中看到炭疽桿菌；Pasteur證明實驗室培養(yǎng)的炭疽桿菌能使動物感染致病； Koch提出病原菌致病的概念； 正式認識Jenner的接種牛痘苗、預防天花的科學性和重大意義。 人工自動免疫 用人工接種的方法向機體輸入抗原性物質，使機體自己產生特異性免疫力。 免疫力出現較慢，人工接種后需經14周誘導期方可產生；但維持時間達半年到數年不等，主要用于傳染病的特異性預防。 白喉造成人類疾病有2500年的歷史，十八世紀初，在新英格蘭的白喉大流行，使得2.5的人口死亡，有三分之一的兒

6、童死亡。在類毒素治療發(fā)明之前，白喉是15歲以下兒童的三大死因之一。 1884年，首次分離出白喉桿菌，白喉桿菌是一種革蘭氏陽性桿菌，在有氧及37的環(huán)境下，生長良好。 人的鼻咽部若受到白喉桿菌感染，會產生毒性很強的外毒素，抑制正常細胞蛋白質合成，引起局部組織破壞及形成白色膜狀物，毒素可經由血液到達全身，主要造成心肌炎、神經炎，血小板低下及蛋白尿。十九世紀八十年代后期，發(fā)現白喉桿菌經其分泌的白喉外毒素致?。浑S后發(fā)現再感染者的血清中有“殺菌素”-抗體；1890年， Behring和Kitasato用白喉抗毒素治療白喉病人。 Behring（德）和 北里柴三郎(日)用白喉脫毒外毒素注射馬等動物，在動物血

7、清中發(fā)現了一種能中和白喉外毒素的物質，稱為抗毒素。 以抗毒素對白喉患者進行治療，發(fā)現此種中和毒素的能力能被動地轉移給正常動物，使后者獲得抗白喉毒素的免疫力，因此稱這種方法為人工被動免疫法。此后很多人從免疫動物或傳染病病人血清中發(fā)現了多種能和微生物或其產物發(fā)生結合反應的物質，通稱為抗體，而引起抗體產生的物質稱為抗原?？乖涂贵w因能發(fā)生特異性結合，為診斷傳染病建立了血清學診斷方法。此二人在1901年共同獲得諾貝爾生理和醫(yī)學獎。人工被動免疫 采用人工方法向機體輸入由他人或動物產生的免疫效應物，如免疫血清、淋巴因子等，使機體立即獲得免疫力，達到防治某種疾病的目的。 特點是產生作用快，輸入后立即發(fā)生作用

8、。但由于該免疫力非自身免疫系統產生，易被清除，故免疫作用維持時間較短，一般只有23周。主要用于治療和應急預防。2、抗原 能刺激人或動物機體產生抗體或致敏淋巴細胞，并能與這些產物在體內或體外發(fā)生特異性反應的物質。抗原的基本性質具有異物性、大分子性和特異性。ABO血型：紅細胞表面的糖蛋白末端寡糖的特點決定了它的抗原性。3、抗體是免疫球蛋白 抗體是能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。二十世紀三十年代，Tiselius和Kabat用電泳研究血清蛋白。動物免疫后，血清中-球蛋白顯著增高。-球蛋白有Ab活性。4、多克隆抗體的制備 抗淋巴細胞多克隆抗體的制備 采用人的淋巴細胞、胸腺細胞或脾細胞作為

9、抗原，經過處理后接種到異種動物如馬或兔體內，使其致敏產生各種針對人的淋巴細胞表面不同抗原決定族的多樣抗體，然后再將所采集的動物血清經過一系列的分離、提純等處理，去除無關的其它雜抗體，從而獲得精制的抗淋巴細胞的多種免疫球蛋白（IgG）。 器官移植后的排斥反應是宿主T細胞被外來移植物抗原刺激活化之后所介導的免疫反應。而T細胞的完全活化必須具備三個外來信號，即由抗原提呈細胞（APC）提供的移植物抗原（第一信號）和共刺激因子（第二信號）以及T細胞自分泌或旁分泌的促生長因子（第三信號）。這三個信號的糖蛋白分子都必須與T細胞表面的受體或配體結合，才能傳遞活化信號，引起T細胞的活化與克隆增殖。 抗淋巴細胞多

10、克隆抗體主要通過阻斷抗原與淋巴細胞的結合、殺滅和清除淋巴細胞來實現免疫抑制效應。但由于每批次產品制作所用的抗原（淋巴細胞）不同，或提純過程的流水線生產差異，不同批次的多克隆抗體產品間存在差異，療效不一。此外，多克隆抗體對淋巴細胞無關的抗原（包括血小板、紅細胞）可發(fā)生交叉反應而導致全血象的降低。 PcAbMcAb基因工程抗體抗體組藥物 利妥昔單抗 Rituximab是1997年美國FDA批準的、用于治療B細胞非霍杰金氏淋巴瘤，已達30多萬例病人。治療總有效率為50%，其療效與化學藥物相同，但更安全，幾乎無副作用，抗體聯合化療有效率高達80%以上。 Rituximab 500mg/支的價格為210

11、00元左右，盡管價格高，但卻供不應求，2005年市場銷售額近32億美元。據統計，2005年治療性和診斷性抗體的銷售額大約為150億美元，治療性抗體的銷售達到120億美元。 1、單克隆抗體的原理 骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)能無限增殖，免疫的B淋巴細胞能產生特異性抗體，細胞融合后形成雜交瘤細胞；HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)雜交瘤細胞；微量蛋白質檢測技術篩選出能產生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞。4.2 單克隆抗體的制備 2、單克隆抗體的制備過程 抗原制備、免疫動物免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備細胞融合雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)、雜交瘤細胞的篩選雜交瘤細胞的克隆化 單克隆抗體的檢定分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立單克隆抗

12、體的大量制備動物體內誘生法體外培養(yǎng)法單克隆抗體的純化 1982年，美國斯坦福醫(yī)學中心的科學家用小鼠制備的單克隆抗體治療B細胞淋巴瘤，治療后患者的病情緩解、瘤體消失。 1986年，美國FDA批準世界上第一個單克隆抗體藥物莫羅單抗-CD3（OKT3）進入市場，用于器官移植時的抗排斥反應。在這個時期，抗體藥物的研制和應用給人們治療疾病帶來了很大的期望。20年后的今天，單克隆抗體藥物已經成為生物醫(yī)藥最重要的發(fā)展領域之一，到2006年，FDA共批準23個治療性單克隆抗體藥物。 OKT3單抗主要和T細胞表面的CD3抗原結合，而CD3分子是與T細胞受體（TCR）緊密相聯在一起的一個復合體（TCR-CD3復合

13、體）。這樣，OKT3就可通過封閉TCR而阻斷由APC提呈的啟動T細胞活化的第一信號（外來抗原）的結合。 OKT3的選擇性好、特異性強，制劑和療效較穩(wěn)定，對急性排斥反應的逆轉率可達8595%。 作業(yè)1、名詞解釋： 抗原、抗體、單克隆抗體。2、簡述單克隆抗體的制備原理。3、簡述單克隆抗體制備的基本過程。4.3 鼠源性單克隆抗體的改造 雜交瘤單克隆抗體均為鼠源性大量應用于人體可產生人抗鼠抗體改造鼠源性單克隆抗體的目的：降低免疫原性降低相對分子質量，增加組織通透性 一、免疫球蛋白的結構 B淋巴細胞在抗原刺激下增殖分化為漿細胞，漿細胞產生能與相應抗原發(fā)生特異性結合的免疫蛋白-Ab。抗體也稱為球蛋白。19

14、68年和1972年將具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白統一命名為免疫球蛋白。 免疫球蛋白分為分泌型（SIg）和膜型（mIg）。SIg主要存在于血清及其他體液或外分泌液中，具有抗體的各種功能。mIg是B細胞表面的抗原識別受體。Ig是由兩條相同的重鏈（H鏈）和兩條相同的輕鏈（L鏈）通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。 重鏈的分子量約為5075kD，由450550個氨基酸殘基組成。重鏈恒定區(qū)的氨基酸的組成和排列順序不同，其抗原性也不同。據此將免疫球蛋白分為五類，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為鏈、鏈、鏈、鏈和鏈。根據Ig鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別

15、，同一類Ig可分為不同的亞類。 輕鏈的分子量約25 kD，由214個氨基酸殘基構成。輕鏈分為(kappa)型和(lambda)型。天然Ig分子上兩條輕鏈的型別總是相同。 兩型輕鏈的功能無差異。 不同種屬中，兩型輕鏈的比例不同。:比例的異?？赡芊从趁庖呦到y的異常 -人類免疫球蛋白鏈過多，提示可能有產生鏈的B細胞腫瘤。 可變區(qū) ：重鏈和輕鏈靠近N端的約110個氨基酸的序列變化很大。 高變區(qū) ：VH和VL各有三個區(qū)域的氨基酸組成和排列順序特別易變化。 互補性決定區(qū)：三個高變區(qū)共同組成Ig的抗原結合部位，該部位形成一個與抗原決定簇互補的表面。骨架區(qū)：高變區(qū)之外區(qū)域的氨基酸組成和排列順序相對不易變化。恒

16、定區(qū)：重鏈和輕鏈的C區(qū)分別稱為CH和CL 。鉸鏈區(qū)：位于CH1與CH2之間，含有豐富的脯氨酸，易伸展彎曲，易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。 二、免疫球蛋白的功能區(qū) VH和VL是結合抗原的部位。 HVR（CDR）是V區(qū)中與抗原表位互補結合的部位。 CH和CL具有部分同種異型的遺傳標志。 三、免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶水解片段。2個Fab段：抗原結合片段，由一條完整的輕鏈和重鏈的VH和CH1功能區(qū)組成，與抗原結合不能形成凝集反應或沉淀反應。Fc段：可結晶片段。Fc段相當于IgG 的CH2和CH3功能區(qū)，無抗原結合活性，是抗體分子與效應分子和細胞相互作用的部位。Ig同種型的抗原性主要存在于Fc

17、段。胃蛋白酶水解片段：雙價 F(ab)2片段：與抗原結合可發(fā)生凝集反應和沉淀反應。 pFc： Ig的Fc段被胃蛋白酶裂解為若干小分子片段，失去生物學活性。 白喉抗毒素、破傷風抗毒素經胃蛋白酶消化后精制，因去掉Fc段而減緩發(fā)生超敏反應。 J鏈漿細胞合成； 富含半胱氨酸的一條多肽鏈；連接Ig 單體形成二聚體、五聚體或多聚體。 四、免疫球蛋白的生物學活性 識別并特異性結合抗原； IgM、IgG與抗原結合后，通過經典途徑激活補體系統，產生多種效應功能：結合細胞表面的Fc受體； 調理作用 ：抗體、補體促進吞噬細胞吞噬細菌等顆粒性抗原的作用； ADCC ：抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用。表達Fc受體的細胞

18、通過識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞； NK細胞是介導ADCC的主要細胞。 介導型超敏反應：IgE的Fc段與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的高親和力IgE Fc受體結合，促使這些細胞合成和釋放生物活性物質。穿過胎盤和粘膜： IgG是唯一能通過胎盤的免疫球蛋白； 是一種重要的自然被動免疫機制，對于新生兒抗感染具有重要意義。 五、抗體的治療應用抗腫瘤抗感染抗器官移植排斥反應治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應性疾病六、McAb藥物迅速發(fā)展的主要障礙人體免疫系統對鼠源蛋白的排斥反應。抗體人源化是解決問題的唯一途徑降低相對分子量，增加組織通透性。細胞工程雜交瘤技術鼠單抗人單抗大鼠小鼠產量高、操作比小鼠麻

19、煩 少用易操作、多用HAMA反應人人雜交瘤人B細胞、骨髓瘤細胞融合人鼠雜交瘤人B細胞、鼠骨髓瘤細胞融合EBV轉化人B細胞 單純轉化轉化后融合與鼠骨髓瘤與人鼠雜交瘤雜交瘤制備人單抗的問題：染色體易丟失、抗體分泌不穩(wěn)定 利根川進（1980）報告了B細胞分化發(fā)育過程中抗體基因結構的變化，闡明IgV區(qū)基因的重排與突變構成無限組合，推測抗體多樣性達109-1011。4.3 基因工程抗體和抗體工程 一、抗體基因多樣性二、基因工程抗體及其制備 目的：一是降低免疫原性；二是降低相對分子量，增加組織通透性。 原理：抗體同抗原結合的功能決定于抗體分子的可變區(qū)（V），異種抗原性則決定于抗體分子的穩(wěn)定區(qū)（C）。 1、

20、人-鼠嵌合抗體（chimeric antibody）：在基因水平上把鼠源性單克隆抗體的H和L鏈的V區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H鏈和L鏈的C區(qū)基因連接，即成為人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表達出完整的Chimeric Antibody. 2、改形抗體(Reshaping antibody)：Ig分子中參與構成抗原結合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補性決定區(qū) (CDR區(qū))。如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中的CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結合特異性。這種改型抗體也稱CDR移植抗體 。早期的改形抗體：簡單的CDR移植，通過點突變進

21、行“微調”即更換某個位點上的氨基酸。 第二代改形抗體：使用了鼠人嵌合FR。其目的是獲得具有高親和力的治療性抗體。 3、小分子抗體：基因工程小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子質量僅為原抗體的1/80-1/3。Fab片段抗體：VH+CH1+L。 FV抗體：VH+VL。單鏈抗體：VH-Linker-VL。單域抗體：VH或VL。最小識別單位：單個CDR區(qū)。單鏈抗體 人工合成一段DNA片段，以VL-銜接物-VH的順序連接上VL和VH的DNA序列，構成嵌合基因； 在大腸桿菌中表達，純化；單鏈蛋白具有抗體結合親和性和特異性。 單鏈抗體體積小，免疫原性較低，滲透性好，能有效地穿透致密的腫瘤

22、屏障，有利于實體瘤的診斷和治療。構建雙功能分子 -生物導彈 單鏈抗體是“導航系統”； 藥物蛋白是“炸彈” 。4、多功能抗體及其制備1）雙功能抗體：雙特異性單鏈抗體，是一種非天然性抗體，其結合抗原的兩個臂具有不同的特異性。如一個Fab片段結合腫瘤特異性抗原，另一個則結合殺傷性T細胞，識別和消滅腫瘤細胞的功能統一在一個單鏈抗體分子上。2）多功能抗體：結合性能良好的單鏈抗體的多聚體。3）抗體融合蛋白：從廣義講應屬于雙功能抗體范疇。小結：單抗研發(fā)的演變歷程鼠單抗100% 鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠/人崁合單抗(66-75 % 人源)ReoPro, RituxanRemicadeSim

23、ulect人源化單抗(90-95 % 人源)Zenapax, Mylotarg, Herceptin, CampathSynagis100% 人源 用SCID小鼠制備人單抗SCID小鼠移植入人淋巴細胞 （人鼠嵌合模型）抗原免疫雜交瘤技術基因工程人單抗人抗體鼠將小鼠Ig基因滅活然后轉入人Ig基因，生產出人單抗遺傳工程鼠 最理想的單克隆抗體：100%人源；人類免疫系統自然產生。 全人抗體面臨的關鍵問題：抗體分泌細胞的保持。 25年來的全人抗體的嘗試鼠骨髓瘤不適合與人B細胞融合 穩(wěn)定性差 抗體產量低 非洲淋巴細胞瘤病毒 (EBV) 保存抗體分泌細胞細胞株不穩(wěn)定抗體的產量低不能特異性地保存抗體分泌細胞

24、很難獲得人類骨髓瘤細胞株 全人抗體技術的最新突破 成功建立人骨髓瘤細胞系Karpas707H ，人源抗體進入新的里程用 途：能穩(wěn)定的保持人B細胞分泌抗體的能力發(fā)明人：英國劍橋大學的Dr Karpas教授意 義：1 在整體水平上研究人類產生的抗體 2 開創(chuàng)人類抗體基因組學的研究評 價：1 諾貝爾獎得主Dr Milstein 推薦發(fā)表在PNAS2 世界權威雜志“科學”發(fā)表了新聞評述3 劍橋大學開了新聞發(fā)布會 基因工程抗體，即按不同的需要，將抗體的基因進行加工、改造和重新裝配，然后再導入到適當的受體細胞內進行表達的抗體分子，這也就是第三代抗體。基因工程抗體具有的優(yōu)點 通過基因工程技術的改造，可降低甚

25、至消除人體對抗體的排斥反應；基因工程抗體的分子量較小，可部分降低抗體的鼠源性，更加有利于穿透血管壁，進入病灶的核心部位；根據疾病的類型和部位，制備新型抗體；可采用原核細胞、真核細胞和植物等多種表達方式，大量表達抗體分子，大大降低生產成本。 自1986年以來，北京安波特基因工程技術有限公司連續(xù)承擔四個五年期國家科技部“863”抗體類生物治療腫瘤藥物研究項目；目前已取得了國際、國內首次發(fā)表的14項領先研究成果；申請了四項專利。 四、噬菌體抗體庫技術phage antibody library定義： 通過PCR將全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因克隆出來，并在噬菌體表面表達、分泌，經篩選后獲得特異性抗體。

26、 1、在噬菌體中表達免疫球蛋白基因的原理 大腸桿菌絲狀噬菌體M13、fd、f1等，屬于絲桿噬菌體科、絲桿噬菌體屬，含一個單鏈環(huán)狀DNA分子；DNA外螺旋狀排列著5種外殼蛋白：蛋白位于絲狀噬菌體的管狀部分；蛋白、和分別位于兩端。常將外源基因與外殼蛋白的基因連接，形成融合蛋白。 2、重組噬菌體生產抗體從小鼠或人的B細胞中分離出mRNA；反轉錄成cDNA；設計兩對特殊的引物，通過PCR將編碼重鏈和輕鏈的cDNA擴增出來；用特定的限制性內切酶酶解擴增出來的cDNA片段；cDNA片段克隆進入絲狀噬菌體質粒載體中，與單鏈絲狀噬菌體外殼蛋白或的基因連接形成融合基因；經過輔助噬菌體感染后，抗體功能片段與外殼蛋

27、白一起表達在重組絲狀噬菌體的表面；通過免疫親和層析的方法或用ELISA的方法，篩選出抗原特異性抗體。 3、組合抗體文庫技術 重鏈和輕鏈的cDNA都有各不相同的限制性內切酶酶切位點； 將每一序列（大量不同的抗體基因）都定向克隆進一單獨的絲狀噬菌體載體并在裂解循環(huán)中表達；形成一個可以用以篩選特異抗原結合活性的組合絲狀噬菌體文庫。 哺乳動物的B細胞可以產生約106-108個不同的抗體；一個噬菌體文庫含有相同數量級的克?。灰蚨粋€抗體組合文庫可以包括任何一種哺乳動物B細胞產生的各種抗體分子；對混合文庫中的克隆可以進行人工突變。 4、噬菌體抗體文庫技術的優(yōu)點省去了單克隆抗體制備過程中許多費時費力的過程；

28、 使Ab的制備由細胞水平進入到基因水平，為解決人源單克隆抗體的制備提供了新的途徑；重、輕鏈的隨機組合提高了抗體的多樣性。 5、Ab蛋白的附著型和分泌型表達在絲狀噬菌體的外殼蛋白基因和外源抗體蛋白基因之間引入一個琥珀突變密碼子UAG； 當絲狀噬菌體感染有琥珀突變抑制的大腸桿菌株(如SupE)時，UAG密碼子被解讀為G1u，Ab蛋白就以融合蛋白的形式附著于噬菌體表面；在非琥珀突變抑制的大腸桿菌菌株中表達時，UAG密碼子被解讀為終止密碼子，Ab蛋白以可溶性蛋白的形式被分泌到細菌體外。 6、抗體的表達系統 哺乳動物細胞表達哺乳動物細胞是真核細胞；具有對表達的蛋白進行正確的加工和翻譯后修飾的能力；可以將

29、抗體分泌表達。 細菌表達生產抗體分子片段最為有效的系統 表達的抗體分子不能糖基化、組裝錯誤、不能形成正確的二硫鍵等易形成不溶且不具活性的蛋白包涵體酵母、植物細胞、昆蟲細胞7、隨機多肽文庫 又稱人工合成抗原決定簇文庫 人工合成構建編碼隨機肽段(一般在69肽之間)的基因； 噬菌體展示 ,構建一個多肽文庫； 從文庫中篩選能夠模擬某些生物大分子生物功能與活性的短肽小分子。 EPO模擬小肽 隨機合成8肽文庫；通過ELISA的方法，用EPO受體篩選； EPO模擬肽段的功能完全可以模擬EPO分子。 抗原抗體特異性結合，在體內和體外均可呈顯某種反應。在體內，可表現為溶菌、殺菌、促進吞噬或中和毒素等作用，故抗體

30、類藥物可用于治療。在體外，由于抗原性狀和反應條件不同，可發(fā)生凝集或沉淀等可見反應，故可用已知抗體來鑒定抗原，做病原學診斷和血型測定，稱為血清學鑒定。一、抗體診斷試劑 抗體診斷藥物基本分為三類：血清學鑒定用的和免疫標記技術用的抗體制劑，以及體內導向診斷藥物。4.4 抗體藥物1、血清學鑒定用的抗體類試劑（1）鑒定病原菌用的抗體試劑 A、常用診斷血清的品種和用途 B、診斷血清的制備步驟 a、制備細菌抗原：細菌接種-培養(yǎng)-收集菌苔-制成菌液。 b、免疫動物和制備抗體血清：動物：家兔、馬、羊、豚鼠。免疫途徑：靜脈、腹腔、皮下。接種次數3-7次，每次間隔3-4d，末次注射后6-8d取血樣測效價，達到要求，

31、即可采血，離心分離血清。 C、診斷血清的診斷方法：直接凝集反應。（2）HBsAg的反向被動血凝診斷試劑A、試劑制備原理：紅細胞經甲醛處理后，在酸性條件下能吸附蛋白質，當純化的抗HBs血清吸附其上時便具有抗體活性，若待測樣品中存在有HBsAg時，則發(fā)生特異性結合而使血細胞發(fā)生凝集。B、制備步驟：先用HBsAg免疫豚鼠-獲得抗HBs血清-硫酸銨鹽析/柱層析-取其 IgG -在pH4.0醋酸緩沖液中致敏醛化血細胞-洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀釋液稀釋至一定濃度，分裝即成。C、診斷方法：在V型血凝板上進行，陰性樣品不凝集，少許血細胞沉積于V型孔底部，呈尖點狀；陽性樣品血細胞凝集成塊狀。（3）妊

32、娠診斷試劑 婦女妊娠后，血液和尿液中的HCG(絨毛膜促性腺激素)含量增高，在3個月內可達到高峰。此時檢測尿液中的HCG，就可確定是否懷孕。（4）抗ABO血型系統血清2、免疫標記技術用的抗體類試劑 給抗體標記放射性核素、熒光素或酶活性，能將抗原抗體反應放大，使常規(guī)不能觀察的反應得以顯現，可對微量抗原進行定性定量測定，靈敏度提高。結合顯微鏡技術，還可對抗原物質作出組織內或細胞內的定位測定。除臨床診斷外，還能為探討發(fā)病機制提供手段。（1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素,如異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明（RB200）、藻紅素（PE）等標記抗體蛋白，即成熒光抗體。用熒光抗體浸染含有抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體就與抗原結合，在熒光顯微鏡下成為發(fā)光的可視物，從而達到診斷和定位的目的。 （2）免疫酶抗體診斷試劑：酶標診斷試劑 a、HBsAg酶標診斷試劑 b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶標診斷試劑 c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶標診斷試劑 d、測定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶標 診斷試劑 e、AFP（甲胎蛋白）酶標診斷試劑 f、CEA（癌胚抗原）酶標診斷試劑（3）放射免疫用抗體診斷試劑 把放射性核素分析的高靈敏性與抗原抗體反應的特異性兩大特點結合起來建立的檢測技術。能測出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物質。A、HB