實驗光學顯微鏡的使用及顯微繪圖

1、細胞生物學實驗光學顯微鏡的使用及顯微繪圖細胞膜的滲透性觀察液泡系的超活染色與觀察FeulgenDNA定性、定量測定樣品減數(shù)分裂的觀察植物染色體標本的制備動物染色體標本的制備考馬斯亮藍染色顯示細胞骨架細胞凝集反應及細胞吞噬細胞融合染色體分帶技術(shù)2022/7/111實驗 1光學顯微鏡的使用及顯微繪圖 2022/7/112一、目的要求（1）熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和各部件性能。（2）掌握低倍鏡/高倍鏡的正確使用方法，掌 握油鏡的使用方法。（3）掌握顯微繪圖的基本方法（4）了解細胞的基本結(jié)構(gòu)，動物、植物和微 生物細胞的基本共性和特性2022/7/113二、儀器設備及材料1. 光學顯微鏡/顯微照相系統(tǒng)（帶油浸物

2、鏡）2. 目鏡測微尺及鏡臺測微尺3. 香柏油、二甲苯4. 永久裝片、擦鏡紙2022/7/114普通生物顯微鏡2022/7/115顯微照相系統(tǒng)2022/7/116三、顯微鏡的構(gòu)造1機械部分 支持和調(diào)節(jié)光學系統(tǒng)Charge-coupled Device2022/7/117三、顯微鏡的構(gòu)造2光學系統(tǒng)2022/7/118三、顯微鏡的構(gòu)造3顯微鏡的能力 顯微鏡的能力是質(zhì)量和性能的標志。能力包括分辨率、放大率、焦點深度和視場寬度等，其中最重要的是分辨率。R：分辨率（分辨的兩個點的最短距離）， R值愈小，分辨率越大。：照明光線的波長(可見光平均波長 約550nm）。N.A.：物鏡的鏡口率n：物鏡和被檢物體之

3、間介質(zhì)的折射率：物鏡的鏡口角（從物鏡光軸上的物點所發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑邊緣所張的角度）。2022/7/119表1 在550nm光波下不同物鏡的分辨距離 放大倍數(shù)（）1040100鏡口率（N.A.）0.280.651.25分辨距離（d）1m0.42m0.22m2022/7/1110科勒照明優(yōu)點：視場照明均勻，樣品不受熱，不產(chǎn)生耀眼眩光，影像清晰。 1893年德國杰出的學者August Kohler提出柯勒照明法。其具體做法：在光源與聚光器之間，加放一光源聚光鏡和視場光闌，光源聚光鏡把光線集成光錐，使光源燈成像于聚光器的孔徑光闌平面處。同時，聚光器又使視場光闌成像在樣品平面處。由此充分地

4、利用了照明光源，使點狀的光源達到較大的照明，從而使樣品得到均勻的照明，并防止了高溫。這對顯微攝影和鏡檢觀察至關重要。 2022/7/1111四、油鏡的原理油鏡（油浸系物鏡，通常有黑圈或Oil的標志），以香柏油或石蠟油為介質(zhì)。這類油的折射率與玻璃的折射率大致相同。光線從被檢物體直接射入物鏡，其間因折射或反射而引起的光線損失很小，所以可以充分利用鏡口角，顯著提高物鏡的分辨率。油鏡（鏡口率一般在1.25左右）的分辨率在0.2m左右，這就是光學顯微鏡的分辨極限。表1 幾種物質(zhì)的折射率介質(zhì)空氣水石蠟油香柏油加拿大樹膠光學玻璃折射率（n）1.0031.331.471.5151.5151.542022/7/

5、1112五、顯微鏡的使用方法使用顯微鏡的要領就是從低倍物鏡開始觀察，先粗調(diào)后細調(diào)。 在低倍物鏡下找到要觀察的東西后，再逐步加大物鏡倍數(shù)，仔細觀察。2022/7/1113低倍鏡的使用 （1）檢查：各部件有無損壞，如發(fā)現(xiàn)問題，立即報告教師請求處理。（2）準備：將顯微鏡放于前方略偏左側(cè)以便觀察。打開電源開關，觀察底座的光路中是否有光亮。慢慢調(diào)節(jié)同一旋鈕，光線應逐步增強。轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)鈕，將載物臺下降使物鏡與載物臺距離略拉開。再旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，將低倍鏡4 X對準載物臺中央的通光孔（可聽到“咔噠”聲）。（3）放標本片：標本片標簽面向上，用標本夾夾好，把要觀察的部分移到通光孔的正中央。（4）調(diào)節(jié)焦距：邊從目鏡

6、中觀察，邊調(diào)節(jié)粗聚焦旋鈕，使載物臺緩慢上升，直至視野中出現(xiàn)物像為止。如物像不太清晰，可轉(zhuǎn)動細調(diào)節(jié)鈕，使物像更加清晰。（5）換10 X 物鏡觀察。此時，只須稍稍調(diào)節(jié)細調(diào)節(jié)旋鈕即可。2022/7/1114低倍鏡的使用 2022/7/1115如果按上述操作步驟仍看不到物像時，可能由以下原因造成： 轉(zhuǎn)動調(diào)節(jié)鈕太快，超過焦點。應按上述步驟重新調(diào)節(jié)焦距。 物鏡沒有對正，應對正后再觀察。 標本沒有放到視野內(nèi)，應移動標本片尋找觀察對象。 光線太強，尤其觀察比較透明的標本片或沒有染色的標本時， 易出現(xiàn)這種現(xiàn)象，應將光線調(diào)暗一些后，再觀察。低倍鏡的使用 2022/7/1116高倍鏡的使用 如按上述操作仍看不到物像

7、時，可能由下列原因造成：觀察的部分不在視野內(nèi)，應在低倍鏡下尋找到后，移到視野中央，再換高倍鏡觀察。標本片放反了，應把標本片放正之后，再按上述步驟操作。焦距沒調(diào)好，應仔細調(diào)節(jié)焦距。如需要更換標本片時，應該先把載物臺下降，然后把標本片移到載物臺前方，再取下。（1）依照低倍鏡操作步驟，先用低倍鏡找到清晰物像。（2）將需要觀察的部分移到視野的中央。（3）眼睛從側(cè)面注視物鏡，用手移動轉(zhuǎn)換器，換高倍鏡40X。（4）眼睛向目鏡內(nèi)觀察，同時微微上下轉(zhuǎn)動細調(diào)節(jié)鈕，直至視野內(nèi)看到清晰的物像為止。此時應把聚光器的孔徑光闌適當調(diào)大，使之與物鏡的鏡口率相匹配。光源的強度也應調(diào)高。2022/7/1117油鏡的使用應先調(diào)低

8、倍鏡、高倍鏡找到要觀察的物像，然后再用油鏡觀察，操作如下：（1）先用低倍鏡觀察標本，然后更換高倍鏡，把待觀察的部分移到視野中央。（2）把載物臺下降約1.5厘米，再把油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。（3）在蓋玻片上所要觀察的位置滴一小滴香柏油。（4）細心擰動粗調(diào)焦螺旋，使載物臺慢慢上升。這時要仔細觀察物鏡前端與標本之間的距離，先使物鏡前端與油滴接觸，然后再慢慢使載物臺上升，至物鏡前端接近而沒有碰到蓋玻片為止。這步操作要特別小心，防止油鏡壓碎標本或損壞油鏡（油鏡的工作距離約0.2mm）。（5）眼睛要看目鏡中，擰動細調(diào)焦螺旋，使載物臺慢慢下降到能看清標本。這步操作要特別注意不要把細調(diào)焦螺旋的方向擰錯，以防壓碎標本

9、。（6）看清標本后，把聚光器下的孔徑光闌開到它的口徑與視場的直徑恰好一樣大，使聚光器的鏡口率與物鏡的鏡口率相配合。如果聚光器的鏡口率小于物鏡的鏡口率，則物鏡的鏡口率就不能充分發(fā)揮。（7）觀察完畢后，下降載物臺，把油鏡轉(zhuǎn)離光軸，立即作清潔工作。先用干的擦鏡紙擦一、二次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴濕的擦鏡紙擦兩次，最后再用干擦鏡紙擦一次。擦拭時要順鏡頭的直徑方向，不要沿鏡頭的圓周擦。擦拭要細心，動作要輕，不可用力擦。如果聚光器上有滴油也要同樣清潔。載玻片上的油可用“拉紙法”擦凈，即把一小張擦鏡紙蓋在載玻片油滴上，在紙上滴一些二甲苯，趁濕把紙往外拉，這樣連續(xù)作34次，即可干凈。2022/7/111

10、8六、顯微鏡使用的注意事項 1搬動顯微鏡時，要一手握鏡臂，一手扶鏡座，兩上臂緊靠身體。切勿一手斜提或前后擺動，不要發(fā)生太大震動，以防鏡頭或其他零件跌落。2觀察標本時，顯微鏡離實驗臺邊緣應保持一定距離(5cm)，以免顯微鏡翻倒落地。3使用時要嚴格按步驟操作，熟悉顯微鏡各部件性能，掌握粗、細調(diào)節(jié)鈕的轉(zhuǎn)動方向與載物臺升降關系。轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)鈕向下時，眼睛必須注視物鏡頭。4觀察帶液體的臨時標本時要加蓋玻片，以免液體污染鏡頭。5粗、細調(diào)節(jié)鈕要配合使用，細調(diào)節(jié)鈕不能單方向過度旋轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)焦距時，要從側(cè)面注視載物臺，以免壓壞標本和鏡頭。6禁止隨意擰開或調(diào)換目鏡、物鏡和聚光器等零件。7顯微鏡光學部件有污垢，可用擦鏡

11、紙或綢布擦凈，切勿用手指、粗紙或手帕去擦，以防損壞鏡面。8凡有腐蝕性和揮發(fā)性的化學試劑和藥品，如碘、乙醇溶液、酸類、堿類等都不可與顯微鏡接觸，如不慎污染時，應立即擦干凈。9使用油鏡觀察樣品后，隨即用二甲苯將油鏡鏡頭和載玻片擦凈，以防其他的物鏡玻璃上沾上香柏油。二甲苯有毒，使用后馬上洗手。10實驗完畢，要將玻片取出，用擦鏡紙將鏡頭擦拭干凈后移開，不能與通光孔相對。切不可把顯微鏡放在直射光線下曝曬。2022/7/1119七、生物顯微繪圖 對標本進行鏡檢后，對一些要重點掌握的內(nèi)容，需要及時繪圖記錄觀察結(jié)果。生物繪圖不同于一般的美術(shù)繪圖，要求將所觀察標本的外形和內(nèi)部結(jié)構(gòu)準確地描繪，然后對各部分分別加以注字說明。2022/7/1120生物繪圖方法1科學性和準確性2布局好3線條均勻劃一4圓點襯陰，以示深淺。5圖注用鉛筆，用平行線引出。6寫明題目、圖題和放大倍數(shù)。2022/7/11212022/7/112