電化學(xué)酶生物傳感器

1、電化學(xué)酶生物傳感器電化學(xué)酶生物傳感器20142014年年5 5月于青島月于青島電化學(xué)電化學(xué)酶傳感器的原理酶傳感器的原理 電化學(xué)酶傳感器是由生物酶膜與各種電極如離子選擇電極、氣敏電極、電化學(xué)酶傳感器是由生物酶膜與各種電極如離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等電化學(xué)電極組合而成或?qū)⒚改ぶ苯庸潭ㄔ诨w電極上制氧化還原電極等電化學(xué)電極組合而成或?qū)⒚改ぶ苯庸潭ㄔ诨w電極上制成的生物傳感器。根據(jù)輸出信號的不同酶電極可分為電流型和電位型兩成的生物傳感器。根據(jù)輸出信號的不同酶電極可分為電流型和電位型兩種類型。種類型。5.2.1 5.2.1 電流型酶傳感器電流型酶傳感器 電流型酶電極傳感器將酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的物

2、質(zhì)發(fā)生電極反應(yīng)電流型酶電極傳感器將酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)發(fā)生電極反應(yīng)所產(chǎn)生的電流響應(yīng)作為測量信號，在一定條件下，利用測得的所產(chǎn)生的電流響應(yīng)作為測量信號，在一定條件下，利用測得的電流信號與被測物活度或濃度的函數(shù)關(guān)系，來測定樣品中某一電流信號與被測物活度或濃度的函數(shù)關(guān)系，來測定樣品中某一生物組分的活度或濃度。生物組分的活度或濃度。 酶的分子識別功能及其反應(yīng)過程的示意圖酶的分子識別功能及其反應(yīng)過程的示意圖 酶電極制備過程中的關(guān)鍵在于酶的固定化，固定化的目的在于保持酶穩(wěn)酶電極制備過程中的關(guān)鍵在于酶的固定化，固定化的目的在于保持酶穩(wěn)定性的同時，盡可能使酶膜與敏感元件緊密接觸，這樣酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物可定性的同

3、時，盡可能使酶膜與敏感元件緊密接觸，這樣酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物可以很快地被酶敏感元件所感知并產(chǎn)生相應(yīng)的信號。以很快地被酶敏感元件所感知并產(chǎn)生相應(yīng)的信號。 酶的固定化酶的固定化酶活性中心酶活性中心黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)FAD)Horseradish Peroxidase 亞鐵血紅素（亞鐵血紅素（Hemin)Hemin)模擬辣根過氧化物酶（模擬辣根過氧化物酶（G-G-四鏈體四鏈體-hemin -hemin 復(fù)合物）復(fù)合物）5.2.2 5.2.2 酶電極傳感器的發(fā)酶電極傳感器的發(fā)展展三代電流型酶傳感器基本原理示意圖(A)第一代，(B)第二代，(C)第三代 葡萄糖傳感器葡萄糖傳感器葡萄糖氧化酶葡萄糖氧

4、化酶 （GOx） 血液中的糖稱為血糖，絕大多數(shù)都是葡血液中的糖稱為血糖，絕大多數(shù)都是葡萄糖。體內(nèi)各組織細(xì)胞活動所需的能量大部萄糖。體內(nèi)各組織細(xì)胞活動所需的能量大部分來自葡萄糖，所以血糖必須保持一定的水分來自葡萄糖，所以血糖必須保持一定的水平才能維持體內(nèi)各器官和組織的需要。平才能維持體內(nèi)各器官和組織的需要?？崭寡强崭寡?測定值測定值 7.0 mM 高血糖高血糖 9.0 mM 糖尿糖尿由一種稱為Clark型氧電極來制備的，用透氣膜將酶包裹固定在氧電極表面。葡萄糖傳感器通常使用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD），該傳感器對葡萄糖具有選擇性響應(yīng)，其檢測原理為：第一代葡萄糖傳感器

5、第一代葡萄糖傳感器檢測氧的消耗或過氧化氫的生成 GOD612622612722C H O +O +H OC H O +H O響響 應(yīng)應(yīng)機機 理理第二代葡萄糖傳感器第二代葡萄糖傳感器- -電子媒介體型電子媒介體型電子媒介體電子媒介體是一種具有良好電化學(xué)活是一種具有良好電化學(xué)活性的相對分子質(zhì)量小的化合物，它擔(dān)性的相對分子質(zhì)量小的化合物，它擔(dān)負(fù)從酶的氧化還原中心到電極表面?zhèn)髫?fù)從酶的氧化還原中心到電極表面?zhèn)鬟f電子的作用。在催化還原過程中，遞電子的作用。在催化還原過程中，介體首先與還原性的酶反應(yīng)，然后擴介體首先與還原性的酶反應(yīng)，然后擴散到電極表面并進(jìn)行快速的電子交換散到電極表面并進(jìn)行快速的電子交換 (1

6、)能夠快速地與還原性的酶反應(yīng)；能夠快速地與還原性的酶反應(yīng)； (2)具有可逆的異相反應(yīng)動力學(xué)行為；具有可逆的異相反應(yīng)動力學(xué)行為； (3)生成氧化型介體的過電位低而且與生成氧化型介體的過電位低而且與pH無關(guān)；無關(guān)； (4)它的氧化或還原形態(tài)都是穩(wěn)定的；它的氧化或還原形態(tài)都是穩(wěn)定的； (5)還原型介體不與氧發(fā)生反應(yīng)；還原型介體不與氧發(fā)生反應(yīng)； (6)在應(yīng)用中無毒化作用。在應(yīng)用中無毒化作用。圖圖511 一些常見的媒介體的化學(xué)結(jié)構(gòu)一些常見的媒介體的化學(xué)結(jié)構(gòu)(a)四硫富瓦烯四硫富瓦烯(TTF)，(b) 四氰苯醌二甲烷四氰苯醌二甲烷(TCNQ)，(c) 二茂鐵，二茂鐵，(d) N-甲基苯基吡唑酮鎓甲基苯基吡

7、唑酮鎓(NMP+)，(e) 麥多那藍(lán)麥多那藍(lán)常見的媒介體的化學(xué)結(jié)構(gòu)常見的媒介體的化學(xué)結(jié)構(gòu) 2+2+D-glucose + GOX (FAD) gluconolactone + GOD(FADH )GOD(FADH )+2FcGOX (FAD)+2Fc+2H2Fc2Fc +2e測試片測試片第三代葡萄糖傳感器第三代葡萄糖傳感器-直接電子傳遞型直接電子傳遞型22222 +2glucose + GOx(FAD) gluconic acid + GOr(FADH ) GOr(FADH ) + O GOx(FAD) + H O GOx(FAD) + 2e + 2H GOr(FADH ) 三代電化學(xué)酶傳感器

8、總結(jié)三代電化學(xué)酶傳感器總結(jié)- -以葡萄糖檢測為例以葡萄糖檢測為例檢測對象檢測對象敏感物質(zhì)（酶）敏感物質(zhì)（酶）換能器（電極）換能器（電極）葡萄糖葡萄糖麥芽糖麥芽糖蔗糖蔗糖半乳糖半乳糖乳酸乳酸尿酸尿酸尿素氮尿素氮膽固醇膽固醇磷脂質(zhì)磷脂質(zhì)氨基酸氨基酸丙酮酸丙酮酸乙醇乙醇葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶淀粉酶淀粉酶轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶+變旋光酶變旋光酶+葡萄糖酶葡萄糖酶半乳糖酶半乳糖酶乳酸氧化酶乳酸氧化酶尿酸酶尿酸酶尿酶尿酶膽固醇氧化酶膽固醇氧化酶磷脂酶磷脂酶氨基酸酶氨基酸酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸脫氫酶乙醇氧化酶乙醇氧化酶O2, H2O2, PtPtO2PtO2O2H2O2, O2O2, H2O2PtO2, H2O2O2

9、O2常見的電流型酶電極傳感器常見的電流型酶電極傳感器 2 肌酸和肌酸酐電化學(xué)傳感器肌酸和肌酸酐電化學(xué)傳感器222222H OH OH OOHCHOH O 肌酸酐水解酶脒基肌酸水解酶肌氨酸氧化酶肌酸酐肌酸肌酸肌氨酸脲肌氨酸甘氨酸 圖517 肌酸微傳感器對肌酸的響應(yīng) 圖516 肌酸和肌酸酐電化學(xué)微傳感器3. 電流型膽固醇傳感器（膽固醇測試儀）電流型膽固醇傳感器（膽固醇測試儀） 血清中總膽固醇血清中總膽固醇 (total cholesterol ， TC) 包括游離膽固包括游離膽固醇醇 (free cholesterol ， FC) 和膽固醇酯和膽固醇酯 (cholesterol ester ， C

10、E) 兩部分。在血清中以游離態(tài)存在的膽固醇約占總膽固兩部分。在血清中以游離態(tài)存在的膽固醇約占總膽固醇 的醇 的 2 7 % 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 。 中國正常人血清的總膽固醇量約為中國正常人血清的總膽固醇量約為:3.05.20mmol/L。血。血液中膽固醇含量過高，表示膽固醇代謝可能發(fā)生障礙。冠液中膽固醇含量過高，表示膽固醇代謝可能發(fā)生障礙。冠狀動脈粥樣硬化患者的血清膽固醇含量往往偏高。因此臨狀動脈粥樣硬化患者的血清膽固醇含量往往偏高。因此臨床化驗上測定血清膽固醇含量將有助于診斷某些疾病。床化驗上

11、測定血清膽固醇含量將有助于診斷某些疾病。測定膽固醇的原理測定膽固醇的原理4-膽甾烯酮膽甾烯酮 基于蛋白質(zhì)直接電子轉(zhuǎn)移的全膽固醇傳感器基于蛋白質(zhì)直接電子轉(zhuǎn)移的全膽固醇傳感器以殼聚糖為載體將血紅蛋白、膽固醇以殼聚糖為載體將血紅蛋白、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶固定在玻碳電極氧化酶、膽固醇酯酶固定在玻碳電極表面，在不使用任何電子媒介體的條表面，在不使用任何電子媒介體的條件下，利用血紅蛋白和電極之間的直件下，利用血紅蛋白和電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，制備成高選擇性的全膽接電子轉(zhuǎn)移，制備成高選擇性的全膽固醇生物傳感器，用于測定血清中的固醇生物傳感器，用于測定血清中的總膽固醇含量。總膽固醇含量。 對膽固醇響應(yīng)的線

12、對膽固醇響應(yīng)的線性范圍為性范圍為10110mg /dL ，檢測限為，檢測限為5 m g / d L ， 響 應(yīng) 時 間 為， 響 應(yīng) 時 間 為 6 0 s 。電流響應(yīng)電流響應(yīng)響應(yīng)機理響應(yīng)機理4. 乳酸電化學(xué)傳感器乳酸電化學(xué)傳感器乳酸傳感器的制備具體方法如下，先在玻碳電極上滴加一滴用氟聚酯乳酸傳感器的制備具體方法如下，先在玻碳電極上滴加一滴用氟聚酯(Nafion)調(diào)制的介體四硫富瓦烯調(diào)制的介體四硫富瓦烯(TTF)漿液，晾干后再用牛血清白蛋白漿液，晾干后再用牛血清白蛋白和戊二醛將乳酸氧化酶固定在該電極表面修飾層上面，即構(gòu)成乳酸傳和戊二醛將乳酸氧化酶固定在該電極表面修飾層上面，即構(gòu)成乳酸傳感器。其

13、反應(yīng)如下：感器。其反應(yīng)如下：2+2+ L-+LOD FAD+LOD FADH LOD FADH + 2TTFLOD FAD + 2TTF + 2H2TTF2e2TTF 乳酸 乳酸氧化酶丙酮酸5. 5. 尿酸電化學(xué)傳感器尿酸電化學(xué)傳感器 尿酸是核酸中嘌呤分解代謝的產(chǎn)物，正常值為尿酸是核酸中嘌呤分解代謝的產(chǎn)物，正常值為27mg/dL，尿酸測，尿酸測定對于診斷痛風(fēng)十分有幫助。通過檢測尿酸酶催化反應(yīng)的反應(yīng)物和定對于診斷痛風(fēng)十分有幫助。通過檢測尿酸酶催化反應(yīng)的反應(yīng)物和生成物，進(jìn)而可以用來測定尿酸的含量。在分子氧的存在下，尿酸生成物，進(jìn)而可以用來測定尿酸的含量。在分子氧的存在下，尿酸經(jīng)尿酸氧化酶氧化成尿囊

14、素、過氧化氫和二氧化碳，反應(yīng)式如下所經(jīng)尿酸氧化酶氧化成尿囊素、過氧化氫和二氧化碳，反應(yīng)式如下所示：示：6. 嘌呤電化學(xué)傳感器嘌呤電化學(xué)傳感器各種生物嘌呤如黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷都可以利用電流型酶電各種生物嘌呤如黃嘌呤、次黃嘌呤、肌苷都可以利用電流型酶電極進(jìn)行檢測。例如當(dāng)魚死后其組織中的腺嘌呤核苷三磷酸極進(jìn)行檢測。例如當(dāng)魚死后其組織中的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)迅迅速降解為肌苷單磷酸速降解為肌苷單磷酸(IMP)，IMP進(jìn)一步經(jīng)酶分解導(dǎo)致了次黃嘌呤進(jìn)一步經(jīng)酶分解導(dǎo)致了次黃嘌呤(Hx)積累，因此次黃嘌呤濃度大小可以作為魚類新鮮程度的指示積累，因此次黃嘌呤濃度大小可以作為魚類新鮮程度的指示劑。采用電流型傳感器檢測各種生物嘌呤的酶反應(yīng)中消耗氧或產(chǎn)劑。采用電流型傳感器檢測各種生物嘌呤的酶反應(yīng)中消耗氧或產(chǎn)生 過 氧 化 氫 ， 其 酶 催 化 反 應(yīng) 式 如 下 所 示 。生 過 氧 化 氫 ， 其 酶 催 化 反 應(yīng) 式 如 下 所 示 。7. 電流型有機磷農(nóng)藥殘留傳感器電流型有機磷農(nóng)藥殘留傳感器Choline Acetate H2O ineAcetylcholAChE2ChO222222AcetylcholineH OAcetateCholineCholineOBetaine aldehydeH OH OO2e2H 1 1）抑制型）抑制型 12 2）抑制型）抑制型 2有