實驗七親和層析純化和SDSPAGE鑒定目蛋白質(zhì)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1實驗七親和層析純化和實驗七親和層析純化和SDSPAGE鑒定目鑒定目蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)第1頁/共38頁第2頁/共38頁n外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、細(xì)多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體胞表面受體n核酸核酸-互補序列（互補序列（Oligo-dT）第3頁/共38頁親和層析原理親和層析原理第4頁/共38頁第5頁/共38頁第6頁/共38頁第7頁/共38頁第8頁/共38頁第9頁/共38頁第10頁/共38頁第11頁/共38頁n每組取每組取3-5 mL上清液，上柱純化。上清液，上柱純化。第12頁/共38頁 GSH-Sepharose 4B第13頁/共38頁第14頁/共38頁樣緩沖液，混勻后在沸水中樣緩沖液，

2、混勻后在沸水中加熱加熱3 min。第15頁/共38頁 1 2 3 M 1 2 3 M 樣品加樣品加30 uL30 uLMarkerMarker加加10 uL10 uL第16頁/共38頁加水定容到加水定容到5000 mL。第17頁/共38頁0.15366 g，50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。中。第18頁/共38頁第19頁/共38頁第20頁/共38頁 logMW=K-bm實驗原理實驗原理第21頁/共38頁第22頁/共38頁緩沖液離子成分、緩沖液離子成分、pH、凝膠、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性。濃度及電位梯度的不連續(xù)性。第23頁/共38頁1. 凝膠孔徑的不連續(xù)性凝膠孔徑

3、的不連續(xù)性（2種孔徑）種孔徑）2. 緩沖液離子成分及緩沖液離子成分及pH值的不連續(xù)性值的不連續(xù)性（2種種緩沖體系，緩沖體系，3種種pH）：濃縮膠，）：濃縮膠，pH6.8，蛋白，蛋白質(zhì)分子的遷移率比質(zhì)分子的遷移率比Cl- 低，比低，比Gly高。高。濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)第24頁/共38頁3. 電位梯度不連續(xù)性：電位梯度不連續(xù)性：快離子（快離子（ Cl- ）后面）后面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly）前面形成）前面形成低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之低電位梯度區(qū)，高電位梯度和低電位梯度之間的地方，形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動間的地方，形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界面，蛋

4、白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個狹的界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個狹小的中間層。小的中間層。濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)第25頁/共38頁第26頁/共38頁試劑名稱試劑名稱加液量加液量ddH2O2.5 mL30% Acr-Bis（29:1）3.0 mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10% SDS75 uLTEMED（加速劑）（加速劑）10 uL10% AP（催化劑，最后加）（催化劑，最后加）75 uL總體積總體積7.5 mL第27頁/共38頁試劑名稱試劑名稱加液量加液量ddH2O3.4 mL30% Acr-Bis（29:1）0.86mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）（最后加）50 uL總體積總體積5.0 mL第28頁/共38頁第29頁/共38頁10. 觀察膠中的蛋白質(zhì)條帶。觀察膠中的蛋白質(zhì)條帶。第30頁/共38頁 純化前純化前 純化后純化后 MarkerMarker第31頁/共38頁第32頁/共38頁第33頁/共38頁水，用水，用1.0 mol/L HCl調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH到到8.8，用蒸餾水稀釋到，用蒸餾水稀釋到100 mL。第34頁/共38頁5. 10 %（W/V）過硫酸銨）過硫酸銨（現(xiàn)用現(xiàn)（現(xiàn)用現(xiàn)配）配）第35頁/共38頁uL上樣緩沖液。上樣緩沖液。第