版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、第一節(jié)第一節(jié) 毛細管電泳分析法毛細管電泳分析法一、簡介1、定義: 在電解質溶液中,位于電場中的帶電離子在電場力的作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象,稱之為電泳電泳。 1981年,Jorgenson和Luckas,用75m內徑石英毛細管進行電泳分析,柱效高達40萬/m,促進電泳技術發(fā)生了根本變革,迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術高效毛細管電泳高效毛細管電泳。第1頁/共36頁 2、 HPCE的優(yōu)點: (1) 毛細管中心與外界的距離很短,電泳產生的焦耳熱很快被散去,有效防止電泳條帶的擴散。 (2) 分析速度快、分離效率高 (3) 電極液用量少,不破壞生物
2、樣品,檢測靈敏度高,用激光誘導熒光檢測器靈敏度可達10-19g (4) 結構簡單,操作方便,自動化程度高。第2頁/共36頁二、毛細管電泳儀第3頁/共36頁三、主要分離模式1、毛細管區(qū)帶電泳 主要用于離子狀態(tài)存在的樣品(1)分離原理 幾個基本概念: 偶電層 (Electric Double Layer,簡稱EDL) 電滲流:在高電壓下,由于液固界面的雙電層的存在,組成擴散層的陽離子向負極移動,導致毛細管中的溶液整體向負極移動。這種現象稱為電滲流,用EOF表示,其速度表示為 eo表示。 電泳淌度:溶質在給定緩沖溶液中,單位時間在單位電場下移動的距離。用ep表示,其速度用ep表示。 第4頁/共36頁
3、n表觀淌度 ap:實際測得的電泳有效淌度和電滲流淌度的矢量和 apap= = efef+ + EOFEOFn表觀遷移速度:離子在實際分離過程中的遷移速度 ap=ap E(2)各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為: + =電滲流 + +ef 陽離子運動方向與電滲流一致; - =電滲流 - -ef 陰離子運動方向與電滲流相反; 0 =電滲流 中性粒子運動方向與電滲流一致;第5頁/共36頁2、膠束電動毛細管色譜(MECC) 主要用于電中性物質的分離 分離原理:在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑,形成膠束,被分離的物質的水和膠束兩相分配,各溶質因分配系數差異而被分離第6頁/共36頁 3、毛細管凝膠電泳(
4、CGE) 是毛細管自由溶液區(qū)帶電泳派生出的一種電泳方式 ,用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質,網狀結構,按分子的大小分離。主要用于分析蛋白質、DNA等生物大分子。第7頁/共36頁4、毛細管等速電泳5、毛細管等點聚焦電泳6、毛細管電色譜(CEC) CE與HPLC的有機結合。CEC可看成是CZE的空毛細管被色譜固定相填充、涂布或鍵和的結果,在毛細管兩端加高壓直流電壓,以電滲流代替高壓泵推動流動相。第8頁/共36頁第二節(jié)第二節(jié) 質譜(質譜(M Mass Spectrum, MS, MS) 定義:質譜法是通過將樣品轉化為運動的氣態(tài)離子并按質荷比(MZ)大小進行分離并記錄其信息的分析方法。第9頁/共36頁
5、第二節(jié)第二節(jié) 超高效液相色譜及其應用超高效液相色譜及其應用一、超高效液相色譜( ultra performance liquid chromatography, UPLC) 一種基于小顆粒填料的液相色譜技術。 n 要求:高效快速的分析n 對液相色譜技術的要求也不斷提高,單從技術角度的改進已經不行,或者說必須從理論高度對液相色譜重新認識。由此,UPLC(超高效液相色譜)概念得以提出,將HPLC的極限作為自己的起點。 第10頁/共36頁二、理論基礎n在高效液相色譜速率理論中, Van Deemter方程式的簡化表達式:n如果僅考慮固定相的粒度 對 的影響,其簡化方程式可表達為:第11頁/共36頁首
6、先顆粒度越小柱效越高;其次每個顆粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速;最后,更小的顆粒度使最高柱效點向更高流速(線速度)方向移動,而且有更寬的線速度范圍。所以降低顆粒度不但提高柱效,同時也提高速度。使用更高的流速會受到色譜柱填料耐壓及儀器耐壓的限制。反之,如果不用到最佳流速,小顆粒度填料的高柱效就無法體現。另外,更高的柱效需要更小的系統(tǒng)體積(死體積)、更快的檢測速度等一系列條件的支持,否則小顆粒度填料的高柱效同樣無法充分體現。第12頁/共36頁 要真正創(chuàng)建一個全新的分離科學領域 UPLC,必須解決以下問題: 1)要解決小顆粒填料的耐壓問題,第二要解決小顆粒填料的裝填問題,包括顆粒度的分布以及色譜柱的
7、結構。 2)高壓溶劑輸送單元(超過15000psi)。 3)完善的系統(tǒng)整體性設計,降低整個系統(tǒng)的體積,特別是死體積。并解決超高壓下的耐壓及滲漏問題。 4) 快速自動進樣器,降低進樣的交叉污染。 5)高速檢測器;優(yōu)化流動池以解決高速檢測及擴散問題。 6)系統(tǒng)控制及數據管理,解決高速數據的采集、儀器的控制問題。 第13頁/共36頁三、UPLC技術與特點(1)新型色譜填料及裝填技術雜化顆粒技術(Hybrid Particle Technology HPT)Waters公司的ACQUITY UPLCTM使用了更嚴格的篩分技術使1.7祄填料的分布很窄,并且使用了全新篩板(專利申請中)及其他色譜柱硬件(柱
8、管及其連接件),在超過20000psi的壓力下裝填。第14頁/共36頁(2)超高壓液相色譜泵(3)自動進樣器為了降低死體積、減少交叉污染,自動進樣器的設計使用了許多新技術,例如針內針樣品探頭、壓力輔助進樣等等。n減少死體積,降低譜帶擴展n快速自動取樣n低擴散、低交叉污染外針刺破密封,內針插入樣品容器底部吸取樣品可達到外針刺破密封,內針插入樣品容器底部吸取樣品可達到微量取樣(微量取樣(L取樣)取樣)第15頁/共36頁(4)高速檢測器UPLC光導檢測器流通池示意圖光導檢測器流通池示意圖第16頁/共36頁四、UPLC的特點分析速度快靈敏度高分離度好超高效液相色譜的優(yōu)點第17頁/共36頁0.000.0
9、40.080.120.160.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.001. Thiourea - 0.4302. toluene - 1.0343. propylbenzene - 1.7424. butylbenzene - 2.4135. hexylbenzene - 5.058 樣品的組份數:樣品的組份數:55m顆粒度顆粒度完全分離時間:完全分離時間:6.00分鐘分鐘0.200.241. Thiourea - 0.0462. toluene - 0.0883. propylbenzene - 0.1374. butylbenze
10、ne - 0.1825. hexylbenzene - 0.360UPLCAU0.000.100.20Minutes0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.60UPLCHPLC樣品的組份數:樣品的組份數:51.7m顆粒度顆粒度完全分離的時間:完全分離的時間:0.60分鐘分鐘UPLC的速度提高了!增加了樣品的通量0.00AU第18頁/共36頁使用使用1.7m1.7m顆粒度的填顆粒度的填料增加靈敏度料增加靈敏度可看到更多的樣品信息AU0.0000.0040.0080.0120.0160.020Minutes1.701.801.902.002.10
11、2.202.302.402.502.601.7 mAU0.0000.0100.0200.0300.0400.050Minutes0.001.002.003.004.005.006.007.008.00AU0.0000.0100.0200.0300.0400.0505.0 m0.024恒定柱長時;UPLC的靈敏度提高1.7倍(170%)!第19頁/共36頁 示例:第20頁/共36頁第三節(jié)第三節(jié) 手性手性HPLCHPLC技術與應用技術與應用一、手性藥物拆分的高效液相色譜法分類 1. 間接法拆分對映異構體即衍生化試劑法(CDR) 2. 直接法拆分對映異構體 手性固定相法(手性固定相法(CSP) 手性
12、流動相添加劑法(手性流動相添加劑法(CMP) 采用非手性固定相采用非手性固定相第21頁/共36頁二、拆分原理及特點1. CDR(R) SE +(R) SA (R) SE (R) SA (S) SA (R) SE (S) SA n手性衍生化特點:1.需要高光學純度的手性衍生化試劑;2.反應繁瑣費時;3.衍生化反應速率重現性較差4.只需使用價格便宜、柱效較高的非手性柱5.衍生化過程可同時純化樣品第22頁/共36頁2. 手性流動相拆分法(CMP) 又稱手性添加劑法,這種拆分法是在流動相中加入手性試劑,利用手性試劑與各對映體結合的穩(wěn)定常數不同,以及藥物與結合物在固定相上分配系數的不同來進行分離。此法不
13、需昂貴的手性柱,亦無須進行柱前衍生,手性添加劑可視要求而更換,使用比較方便。 其中主要應用的有:配體交換型手性添加劑、環(huán)糊精添加劑、手性離子對添加劑。 第23頁/共36頁3. 手性固定相拆分法(CSP) 利用手性固定相與對映體消旋物相互作用,其中一個與手性固定相生成不穩(wěn)定的短暫的對映體復合物,使兩種異構體在色譜柱上的保留時間不同,從而得到分離。 用于色譜分離的手性固定相已經被大量研究,已有100多種液相色譜固定相被商業(yè)化。目前所研究的高效液相色譜手性固定相有 7大類。 其中主要應用的有:Pirkle型CSP、環(huán)糊精CSP、手性聚合物CSP、蛋白質CSP 。 第24頁/共36頁CSPCSP種類種
14、類作用機理作用機理應用應用Pirkle型型CSP 主要有主要有 -堿型(帶推電子取代基)堿型(帶推電子取代基)手性固定相、手性固定相、-酸型(帶吸電子取代酸型(帶吸電子取代基)手性固定相,以及氨基酸類手性基)手性固定相,以及氨基酸類手性固定相固定相氨基酸、氨基酸、 乙內酰脲、乙內酰脲、 內酰脲、內酰脲、 胺類、胺類、 醇類及硫醇類藥物對映醇類及硫醇類藥物對映體體拆分拆分環(huán)糊精環(huán)糊精CSP 環(huán)糊精的手性識別主要來自環(huán)內腔環(huán)糊精的手性識別主要來自環(huán)內腔對芳烴或脂對芳烴或脂 肪烴類側鏈的包容作肪烴類側鏈的包容作用,用, 以及環(huán)外殼上的羥基與藥物對以及環(huán)外殼上的羥基與藥物對映體分子發(fā)生氫鍵作用映體分子
15、發(fā)生氫鍵作用一環(huán)糊精:適用于大多數藥物一環(huán)糊精:適用于大多數藥物一環(huán)糊精:適用于相對分子質一環(huán)糊精:適用于相對分子質 量小于量小于200的藥物的藥物一環(huán)糊精:適用于較大相對分一環(huán)糊精:適用于較大相對分 子質量藥物子質量藥物手性聚合物手性聚合物CSP一類:天然的多糖衍生物一類:天然的多糖衍生物纖維素和纖維素和直鏈淀粉直鏈淀粉另一類:高分子化合物另一類:高分子化合物 對醇、酸、酮、酯、含對醇、酸、酮、酯、含P或或S的的藥物有良好的手性識別能力。藥物有良好的手性識別能力。蛋白質蛋白質CSP 可識別藥物對映體在蛋白質的結合可識別藥物對映體在蛋白質的結合位點而達到手性分離位點而達到手性分離 可直接分離許
16、多藥物,如硫噴可直接分離許多藥物,如硫噴妥因、妥因、 心得怡及阻滯劑等心得怡及阻滯劑等第25頁/共36頁CSP的特點1.適用范圍廣2.制備分離方便3.定量分析的可靠性高4.價格昂貴第26頁/共36頁第四節(jié)第四節(jié) 色譜色譜- -質譜聯用技術質譜聯用技術主要問題有兩大方面:1、如何實現接口,降低壓力使色譜柱的出口與質譜的進樣系統(tǒng)連接,達到兩部分速度的匹配;2、除去色譜中大量的流動相分子。第27頁/共36頁 分子分離器連接 (主要用于填充柱)從氣相色譜來的載氣和樣品離子經一小孔加速噴射入噴射腔中,小分子的載氣由于擴散速度較快,被真空泵抽除,而被測物分子量大將在慣性作用下繼續(xù)直線運動而進入捕捉器。 直
17、接連接法(主要用于毛細管柱)在色譜柱和離子源之間用長約50cm,內徑0.5mm的不銹鋼毛細管連接,色譜流出物經過毛細管全部進入離子源,這種接口技術樣品利用率高。 開口分流連接該接口是放空一部分色譜流出物,讓另一部分進入質譜儀,通過不斷流入清洗氦氣,將多余流出物帶走。此法樣品利用率低。一、氣相一、氣相- -質譜聯用(質譜聯用(GC-MSGC-MS)第28頁/共36頁二、液相色譜二、液相色譜- -質譜聯用質譜聯用(LC-MS)(LC-MS)n關鍵是LC 和MS 之間的接口裝置。n目前廣泛使用的是大氣壓電離(Atmosphere pressure Ionization,API)源包括: A. 電噴霧
18、電離(Electrospray Ionization,ESI)源 B.大氣壓化學電離(Atmospheric Pressure Chemical Ionization,APCI)第29頁/共36頁電噴霧電離源(電噴霧電離源(ESI)ESI)電噴霧離子化分為三個過程:形成帶電液滴溶劑蒸發(fā)和液滴碎裂形成氣相離子毛細管2-4kV離子從液滴表面蒸發(fā)出來-+-+-含各種離子的液滴-+-+-+-+-隨著液滴的揮發(fā),電荷密度增大, 離子集中到液滴表面+-+-+-+-+-+-第30頁/共36頁第31頁/共36頁大氣壓化學電離源大氣壓化學電離源(APCI)(APCI)第32頁/共36頁APCI和ESI的不同點n離子產生的方式離子
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 2025年化療藥物供應合同
- 2025年宇宙探索擔保協(xié)議
- 2025年商鋪抵押借款轉換托管協(xié)議
- 2025年度木地板施工與室內裝修一體化合同4篇
- 2025年壁球館特許經營合同
- 2025年體育館用水合同
- 二零二五版水資源合理化利用建議書范本3篇
- 2024云南公務員考試行測真題(行政執(zhí)法類)
- 2025版委托代理企業(yè)交稅及稅收籌劃與申報合同6篇
- 2024經濟合同范本
- 城市微電網建設實施方案
- 企業(yè)文化融入中華傳統(tǒng)文化的實施方案
- 9.1增強安全意識 教學設計 2024-2025學年統(tǒng)編版道德與法治七年級上冊
- 《化工設備機械基礎(第8版)》全套教學課件
- 人教版八年級數學下冊舉一反三專題17.6勾股定理章末八大題型總結(培優(yōu)篇)(學生版+解析)
- 2024屆上海高考語文課內古詩文背誦默寫篇目(精校版)
- DL-T5024-2020電力工程地基處理技術規(guī)程
- 初中數學要背誦記憶知識點(概念+公式)
- 駕照體檢表完整版本
- 農產品農藥殘留檢測及風險評估
- 農村高中思想政治課時政教育研究的中期報告
評論
0/150
提交評論