基因工程復(fù)習(xí)

1、基因工程的概念：主要是利用 DNA重組技術(shù),將生物的某個(gè)基因或一個(gè) DNA片段通過基 因載體DNA載體運(yùn)送到另一生物的活性細(xì)胞中,然后經(jīng)過克隆和行使正常功能表達(dá),從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)分子技術(shù) 從細(xì)菌到高等生物.重組DNA技術(shù)的三大根本元件：供體、受體、載體上游、下游技術(shù)：上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建即重組DNA技術(shù);而下游技術(shù)那么涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的別離純化過程.克隆的概念：從一個(gè)共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體.分子克隆的概念： 是指別離一個(gè) DNA序列,并以活體內(nèi)方式獲得許多復(fù)制品

2、的過程.細(xì)菌基因工程流程：1外源目標(biāo)基因的別離、克隆以及目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)與功能研究.2適合轉(zhuǎn)移、表達(dá)載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)重組；3外源基因的導(dǎo)入；4外源基因在宿主基因組上的整合、表達(dá)及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選；5外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生理功能的核實(shí)；內(nèi)含子：內(nèi)含子指真核生物基因中不能譯成蛋白質(zhì)的DNA片段,但可被轉(zhuǎn)錄,當(dāng)兩側(cè)序列外顯子的轉(zhuǎn)錄RNA被剪接在一起時(shí),就將內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的RNA從整個(gè)轉(zhuǎn)錄物中除去.外顯子：外顯子是指能夠譯成蛋白質(zhì)的任一間斷的基因片段,一個(gè)基因可有多個(gè)外顯子.限制：細(xì)菌為防御外來DNA入侵而將其降解的現(xiàn)象.一般由限制酶來降解外源 DNA 修飾：細(xì)菌為預(yù)防自身 DNA被降

3、解而修飾自身 DNA.一般由甲基化酶進(jìn)行修飾限制性內(nèi)切酶的概念： 是一類能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的某種特定核甘酸序列,并由此切 割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核甘酸內(nèi)切酶.限制性內(nèi)切酶的命名規(guī)那么：按屬名、種名、株名、編號(hào)來命名,假設(shè)種名頭2個(gè)字母相同,那么其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母.II型限制酶識(shí)別序列的特征： 識(shí)別序列主要為4-6bp,或更長且呈二重對(duì)稱的特殊序列.但 有少數(shù)酶識(shí)別更長的序列或簡并序列 ,切割位置因酶而異,有些是隔開的.識(shí)別回文對(duì)稱結(jié) 構(gòu).切割位點(diǎn)大多數(shù)在內(nèi)部,也有在外部的.切割所產(chǎn)生的末端的類型：匹配的黏末端、非對(duì)稱突出末端、平末端同裂酶：識(shí)別相同的序列的限制酶.同尾酶：許

4、多不同的限制酶切割 DNA產(chǎn)生的末端是相同的,且是對(duì)稱的,即它們可產(chǎn)生相 同的黏性突出末端.這些酶稱為同尾酶.星活性的概念：是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì),任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn).大腸桿菌 DNA聚合酶I的三種活性：(1)5' 一 3'聚合酶活性；(2)5' - 3'外切酶活性 ； (3) 3' 一 5'外切酶活性Klenow大片段的活性：5' 一3'的聚合酶活,3' 一5'的核酸外切酶活性逆轉(zhuǎn)錄酶的活性： 依賴于RNA的DNA聚合酶活性：可以有效地將 mRNA反轉(zhuǎn)錄成DNA , 其產(chǎn)物稱為c

5、DNA ; RNase H活性：水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA分子；依賴于 DNA 的DNA聚合酶活性.T4 DNA連接酶的活性： 可修復(fù)雙鏈 DNA上的單鏈缺口；連接 RNA-DNA 雜交雙鏈上的 DNA鏈缺口或RNA鏈缺口；連接完全斷開的兩個(gè)平頭末端DNA分子.堿性磷酸酶的活性： 在用32P標(biāo)記DNA 5'端之前,去除 5'端的磷酸； 在DNA組技術(shù)中,去除DNA片段的5'磷酸,預(yù)防載體的自身環(huán)化,提升重組子比例.質(zhì)粒的概念：是染色體外的遺傳因子,能進(jìn)行自我復(fù)制,多為超螺旋共價(jià)、閉合、環(huán)狀雙鏈 DNA ,少數(shù)線狀.質(zhì)粒的構(gòu)型：當(dāng)其兩條核甘酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)

6、構(gòu)時(shí),稱之為共價(jià)閉合環(huán)形DNA(cccDNA),這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的 SC構(gòu)型；如果兩條多核甘酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu),另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí),稱之為開環(huán)DNA (ocDNA).假設(shè)質(zhì)粒DNA的雙鏈均發(fā)生斷裂而形成線形分子,那么通稱為L構(gòu)型.-互補(bǔ)的概念： 指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū) 段的 二半乳糖甘酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ).藍(lán)白斑篩選的原理：將外源基因克隆在 pUC18的lacZ'標(biāo)記基因內(nèi)部,使之滅活,此時(shí)重組子為Apr、lacZ-基因型,乳白色菌落；而非重組子那么為Apr、lacZ+基因型的藍(lán)色菌落.一個(gè)理想的載體

7、應(yīng)該具備哪些特性,入-噬菌體載體的類型.(1)能夠在宿主細(xì)胞中存在并繁殖,有功能良好的復(fù)制子和啟動(dòng)子,使插入基因復(fù)制和表達(dá)；(2)具有多種限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn),且切點(diǎn)是單一的,這樣可將多個(gè)外源 DNA片段插入其 中；(3)具有容易檢測的篩選標(biāo)記；(4)載體DNA的分子量適當(dāng),可容納較大的外源DNA片段,又可在受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增較多的拷貝；(5)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高,這樣可以使重組體可以穩(wěn)定傳代而不易喪失.插入型載體、取代型載體黏粒的結(jié)構(gòu)特征,酵母人工染色體的根本元件.黏粒含有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ColE)、抗生素抗性標(biāo)記基因(ampr)、cos位點(diǎn),可像質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和 增殖.黏粒大小一般為 57 kb,可克隆

8、大片段 DNA ,克隆的最大片段可達(dá) 45 kb.酵母染色體的端粒序列、酵母染色體的復(fù)制子、酵母染色體的著絲粒序列、酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記、大腸桿菌的復(fù)制子標(biāo)記、YAC載體的裝載量為250 - 400 kb大腸桿菌表達(dá)載體的根本元件：啟動(dòng)子、RBS、終止子、克隆位點(diǎn)、大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)、標(biāo)記基因啟動(dòng)子：是DNA中一段特定的核甘酸序列,這段核甘酸序列是RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄起始時(shí)對(duì)模板DNA的識(shí)別部位和結(jié)合部位,是轉(zhuǎn)錄過程能否起始的決定部位,其本身不轉(zhuǎn)錄.一 般位于表達(dá)基因的上游.RBS:基因外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率,而且在很大程度上還與mRNA的譯起始效率密切相關(guān).

9、 mRNA譯的起始效率主要由其 5'端的結(jié)構(gòu) 序列所決定,稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn) (RBS).SD序列：位于譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核昔酸序列 5' UAAGGAGG 3 ',即SD序歹U.終止子：基因的3'端有一特定的 DNA序列,它具有被RNA聚合酶識(shí)別并停止轉(zhuǎn)錄的功能.tac、T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)的原理.啟動(dòng)子lac及其衍生啟動(dòng)子tac都是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,在 IPTG的誘導(dǎo)下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄.T7噬菌體啟動(dòng)子只能由 T7噬菌體的RNA聚合酶識(shí)別,大腸桿菌的RNA聚合酶無法識(shí)別. 將T7 RNA聚合酶基因(T7 gene 1)置于lacUV5啟動(dòng)子之后,構(gòu)建 九噬菌體,再

10、將此噬菌體 整合到大腸桿菌基因組,得到大腸桿菌BL21(DE3);將pET表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌后,因?yàn)榇竽c桿菌的lacI基因產(chǎn)生阻遏蛋白, lacUV5啟動(dòng)子無法啟動(dòng) T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄,T7 啟動(dòng)子也就無法啟動(dòng)；如果在大腸桿菌中再引入一個(gè)帶有T7噬菌體的溶菌酶編碼基因的質(zhì)粒,如pLysS或pLysE,它們表達(dá)的T7溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性,進(jìn)一步預(yù)防 在未添加IPTG時(shí)T7啟動(dòng)子激活.利用組氨酸標(biāo)簽表達(dá)載體得到純化的目的蛋白的原理.含有His標(biāo)簽的融合蛋白可與饃離子結(jié)合,將饃離子固定在樹脂上,便可對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析別離.純化的融合蛋白再用Xa因子切割,可切除組氨酸標(biāo)簽,從

11、而獲得目的蛋白.分泌表達(dá)載體與胞內(nèi)表達(dá)載體的區(qū)別.將表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或細(xì)胞周質(zhì)區(qū)中,可預(yù)防細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的降解,或使表達(dá)的蛋白正確折疊,或去除 N-末端的甲硫氨酸,從而到達(dá)維護(hù)目的蛋白活性的目的.包涵體的概念：在某些生長條件下, 大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子,它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi),或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu),這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體.穿梭載體的概念： 是能夠在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體.堿裂解法提取質(zhì)粒的原理.在pH高達(dá)12.5的堿性條件下,染色體 DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性,質(zhì)粒 DNA的大局部氫鍵也斷裂,但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全別離；

12、當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其 pH至中性時(shí),變性的質(zhì)粒 DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型, 保存在溶液中,而染色體 DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 通過離心可除去大局部細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì),質(zhì)粒 DNA尚在上清中,再用酚/氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA.Southern雜交的流程.fHUiUU ：帶相口 N苒片深的潞臟ScLrthern印跡法用攜呻漉轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至硝酸軒雄菜腰上 NA .吸附稗ONA片段的膜Southern雜交、Northern 雜交、Western雜交的異同.Southern雜交為 DNA雜交,探針為 DNA 或 RNA.檢測DNA.Northern雜交為

13、RNA雜交,探針為 DNA 或cDNA.原理、操作與 Southern相似.Western雜交為蛋白質(zhì)的免疫分析探針為抗體.Western雜交的總體過程與Southern雜交相Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持 RNA處于變性狀態(tài),DNA電泳前和 電泳中不變性.2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理 ,Southern印跡時(shí),DNA轉(zhuǎn)膜前 需進(jìn)行堿變性及中和處理. 3、靶核酸為RNA ,不需限制酶消化.受體細(xì)胞：又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞等,是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞.感受態(tài)：細(xì)胞處于能夠吸收 DNA的狀態(tài),稱為感受

14、態(tài).轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞,并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的 過程稱之為轉(zhuǎn)化.氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的原理.細(xì)菌處于0 c和低滲氯化鈣溶液中,菌細(xì)胞壁和膜通透性增加,菌體膨脹成球形,此時(shí)轉(zhuǎn)化混合物中DNA形成抗DNase羥基-磷酸鈣復(fù)合物粘附于細(xì)胞外表,經(jīng)短暫熱休克42C后,細(xì)胞膜形成許多間隙,DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)DNA芯片技術(shù)的概念：是指在固相支持物上原位合成寡核甘酸探針,或者直接將大量的 DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物外表,然后與標(biāo)記的樣品雜交,通過對(duì)雜 交信號(hào)的檢測分析即可得出樣品的遺傳信息.PCR的原理、示意圖.首先待擴(kuò)增DNA ?模板加熱變性解鏈,

15、隨之將反響混合物冷卻至某一溫度,這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火,再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸.這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè) PCR循環(huán),PCR就是在適宜條件下的這種循環(huán)的不 斷重復(fù).退火用物變性與退火一延伸,變性與退火一延伸重復(fù)PCR體系各成分的作用.緩沖液：緩沖液中含有一種二彳陽離子,用于激活DNA聚合酶的活性中央,一般使用Mg2+ ,有時(shí)使用 Mn2+ .dNTP: dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的 Mg2+濃度下降,影響 DNA聚合酶的活性.引物：在多數(shù)試驗(yàn)中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各1mM ,即1pmol/ml.濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反響特

16、異性下降.模板：模板的數(shù)量會(huì)直接影響擴(kuò)增的效果.單、雙鏈DNA均可.不能混有蛋白酶、 核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類.DNA聚合酶：PCR反響中使用的 DNA聚合酶是耐高溫的, 在90 c以上的高溫仍能有活性.也正是高溫DNA聚合酶的應(yīng)用才使得 PCR技術(shù)得以推廣.Taq酶與Pfu酶的異同.Tth DNA 聚合酶來自嗜熱菌.Pfu DNA 聚合酶來自劇烈熱球菌.Tth DNA 聚合酶可在高溫下做RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄和引物延伸反響,預(yù)防RNA反轉(zhuǎn)錄過程中形成的二級(jí)結(jié)構(gòu).Pfu DNA聚合酶具有理想的擴(kuò)增保真度,具有極高的熱穩(wěn)定性,是目前使用最廣泛的具有3'一 5外切活性的

17、PCR酶.A/T克隆的原理.Taq DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性,可在 DNA片段的3 '末端添加一個(gè)核甘酸,通 常為A.因此,Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的產(chǎn)物可與 T-載體進(jìn)行粘端互補(bǔ)連接,到達(dá)高效克 隆的目的.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR :利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析.Sanger雙脫氧鏈終止法測序的原理.在模板指導(dǎo)下,DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3'-OH末端,使引物延長,合成出新 的互補(bǔ)的DNA鏈,如果參加雙脫氧三磷酸核甘 ddNTP,由于雙脫氧核糖的 3'位置上缺少一

18、個(gè)羥基,故不能同后續(xù)的 dNTP形成磷酸二酯鍵,即形成一種全部具有相同 5'-引物端和 以ddNMP殘基為3'端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物. 由于雙脫氧核甘酸在每個(gè) DNA 分子中摻入的位置不同,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個(gè)核甘酸的單鏈DNA,從而讀取DNA核甘酸序列.易錯(cuò)PCR的概念：是指通過改變PCR反響條件來調(diào)整 PCR反響中突變的頻率,降低聚合 酶固有的突變序列傾向性,提升突變譜的多樣性,使得錯(cuò)誤堿基隨機(jī)地以一定的頻率摻入到擴(kuò) 增的基因中,從而得到隨機(jī)突變的 DNA群體,最后用適宜的載體克隆突變基因.重疊延伸PCR誘變的原理.對(duì)于兩個(gè)具有局部重疊序列的DN

19、A片段,在經(jīng)過變性和復(fù)性后,兩個(gè) DNA片段之間通過同源序列形成局部雜合的雙鏈,在DNA聚合酶作用下,雜合雙鏈可互為引物和模板,引導(dǎo)DNA的合成,從而形成雜合 DNA雙鏈.基因組文庫：指將某生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的DNA片段,再與適宜的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落 或噬菌斑.cDNA文庫：以mRNA為模板,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化,在體外反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ,與適當(dāng)?shù)妮d體 連接后轉(zhuǎn)化受體菌,那么每個(gè)細(xì)菌含有一段 cDNA,并能繁殖擴(kuò)增,這樣包含著細(xì)胞全部 mRNA 信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的 cDNA文庫.如何估計(jì)一個(gè)完整基

20、因組文庫應(yīng)包含克隆的數(shù)目.ln(1 -f)利用公式N代表一個(gè)基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個(gè)數(shù)；p 表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的概率;的長度和基因組 DNA總長的比值.基因組DNA文庫的構(gòu)建流程、示意圖.f 表示重組克隆平均插入片段舉例說明如何通過表型篩選法得到包含目的基因的陽性克隆.在宿主菌如大腸桿菌中表達(dá)目的基因,使宿主產(chǎn)生新的表型或使宿主恢復(fù)其突變基因的 表型來篩選目的基因.含淀粉酶的基因,參加碘,藍(lán)白色圈分子遺傳標(biāo)記的概念：是指利用分子生物學(xué)的方法來區(qū)分不同的個(gè)體或群體,并且可以穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)或性狀,是生物個(gè)體或群體間遺傳差異的客觀表征.廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳 的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì).與遺傳作圖相比,物理作圖有何優(yōu)點(diǎn)？遺傳學(xué)圖譜分辨率有限,精確度較低.物理圖是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)來直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實(shí)際位置.分辨率與精確度都比遺傳作圖高.反向遺傳學(xué)的概念：獲得基因組序列之前研究基因功能是從表型開始,確定限制表型相關(guān)基因及其序列,但獲得基因組序列之后那么需要從未知功能的基因序列開始,確定它對(duì)應(yīng)的功能和相關(guān)的表型,即反向遺傳學(xué).蛋白質(zhì)組：指由一個(gè)細(xì)胞,一個(gè)組織或一種生物的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì).報(bào)告基因：是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定、常用于判斷外源基因是夠成功地導(dǎo)入體細(xì)