艾滋病、梅毒、乙肝實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)

1、艾滋病、梅毒、乙肝實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù) 岳陽市疾控中心 白志永艾滋病抗體檢測及樣品保存、運(yùn)送一、HIV抗體檢測篩查方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn)快速檢測（RT） （建議配備合格的快速檢測試劑，灰區(qū)。）二、 篩查程序初篩和復(fù)檢流程 （圖1）樣品初篩試驗(yàn)篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)復(fù)檢試驗(yàn)原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑均陽性反應(yīng)一陰一陽均陰性反應(yīng)確證試驗(yàn)報告陰性圖1 HIV抗體篩查檢測流程三、篩查試驗(yàn)結(jié)果的報告（建議用修改后報告單附表3）（例）HIV抗體篩查試驗(yàn)用附表1、2進(jìn)行報告，陰性反應(yīng)報告為“HIV抗體陰性（-）”；陽性反應(yīng)報告為“HIV

2、抗體待復(fù)檢”。四、 HIV感染產(chǎn)婦所生兒童HIV抗體檢測策略及流程 1、適用范圍HIV感染產(chǎn)婦所生嬰幼兒；已滿18個月的嬰幼兒，其母親HIV感染狀態(tài)不詳，兒童出現(xiàn)HIV相關(guān)臨床表現(xiàn)，臨床懷疑HIV感染的兒童。2、 檢測程序五、樣品的保存、運(yùn)送1、樣品的保存用于抗體和抗原檢測的血清或血漿樣品，短期（1周）內(nèi)進(jìn)行檢測的可存放于28， 一周以上應(yīng)存放于-20以下。2、樣品的運(yùn)送（例）（1）應(yīng)符合生物安全要求； (2)應(yīng)采用三層容器對樣品進(jìn)行包裝。 第一層容器：直接裝樣品，應(yīng)防滲漏。樣品應(yīng)置于帶蓋的試管內(nèi)。在試管的周圍應(yīng)墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。第二層容器：容納并保護(hù)第一層容器，可以裝若干個第一層容

3、器。要求不易破碎、帶蓋、防滲漏、容器的材料要易于消毒處理。第三層容器：容納并保護(hù)第二層容器的運(yùn)輸用外層包裝箱。外面要貼上醒目的標(biāo)簽、聯(lián)系方式，還應(yīng)易于消毒。(3) 用于抗體檢測的血清和血漿樣品應(yīng)在凍存條件下運(yùn)送。質(zhì)量控制一、 艾滋病抗體檢測的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)量控制1、試劑盒內(nèi)部對照即試劑盒提供的陽性和陰性對照血清。用于判斷實(shí)驗(yàn)的有效性，不能作為室內(nèi)質(zhì)控品使用，內(nèi)部對照結(jié)果無效，必須重新試驗(yàn)。2、室內(nèi)質(zhì)控品為非試劑盒組份的外部質(zhì)控品，是為了監(jiān)控檢測的重復(fù)性而設(shè)置的，包括強(qiáng)陽性、弱陽性和陰性質(zhì)控血清。也可以只設(shè)置一個弱陽性質(zhì)控，以該試劑盒臨界值（Cut-off）的23倍為宜。作用：判斷該批臨床樣品檢測

4、的有效性，每次實(shí)驗(yàn)必須包含室內(nèi)質(zhì)控品，其結(jié)果無效，必須重新試驗(yàn)。二、 統(tǒng)計室內(nèi)質(zhì)控的主要表示方法建立質(zhì)控圖最常用的質(zhì)控圖是Levey-Jennings利維詹寧斯質(zhì)控圖，下面以ELISA方法檢測HIV抗體為例，描述建立質(zhì)控圖步驟：1、建立質(zhì)控圖參數(shù)一般采用在不同批次檢測取得至少20個數(shù)據(jù)，以建立一個臨時性的均值和標(biāo)準(zhǔn)差 a、算術(shù)平均值（）： x = nb、標(biāo)準(zhǔn)差（s）：是描述樣品與均數(shù)之間離散程度的一個指標(biāo) s 計算公式為： （ xn - ）2 s = n-1c、變異系數(shù)（cv）： s cv = - 100 % 2、繪制質(zhì)控圖（a）在常規(guī)條件下，對同一批血清連續(xù)測定20次（天）或以上，獲得一組S

5、/CO值，求均數(shù)（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）, 超出2s或3s的數(shù)據(jù)不應(yīng)刪除。（b）將均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）分別在質(zhì)控框架圖中標(biāo)示出來。以S/CO值作縱座標(biāo)（Y軸），每一批次試驗(yàn)作橫座標(biāo)（x軸），繪制質(zhì)控圖。（c）從第21次起，將每次質(zhì)控血清的檢測結(jié)果依次點(diǎn)入該質(zhì)控框架圖中，檢驗(yàn)進(jìn)入質(zhì)控狀態(tài)。3、質(zhì)控規(guī)則及其使用質(zhì)控規(guī)則的使用應(yīng)檢出隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差，目前有許多質(zhì)控規(guī)則，常用的是12S和13S規(guī)則。（a）告警（12S）：當(dāng)外部質(zhì)控品的S/CO值超出+2s范圍時，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)，應(yīng)予注意，是否可以繼續(xù)檢測需要進(jìn)一步觀察。若將12S做失控標(biāo)準(zhǔn)，有較高的假失控概率，所以一般不采用。（b）失控（13S）：當(dāng)外

6、部質(zhì)控品的S/CO值超出+3s范圍時，系統(tǒng)處于失控狀態(tài)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能被接受，可能是系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差或外部質(zhì)控品 穩(wěn)定性下降所致。（c）漂移：連續(xù)幾次（35次）外部質(zhì)控品的S/CO值都落在均值的一側(cè)則稱為漂移，提示實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生了較大的變化。（d）趨勢：連續(xù)幾次（57次）外部質(zhì)控品的S/CO值幾乎按一個方向分布時稱為趨勢，通常由參數(shù)的緩慢改變引起。艾滋病實(shí)驗(yàn)室生物安全一、HIV的生物危害第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。人類免疫缺陷病毒（HIV）屬第二類病原微生物，是高致病性病原微生物。二、HIV相關(guān)檢測的生物安全級別HIV抗體檢測應(yīng)在符合級生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）要求的

7、艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。三、生物安全保證措施1、建立安全制度艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立下列安全制度 (1) 實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序（S-SOP）。(2) 意外事故處理預(yù)案，主要是生物安全意外事故。(3) 信息安全及保密制度：（例） 2、培訓(xùn)和管理3、個人保健和防護(hù)4、安全操作5、實(shí)驗(yàn)室的清潔和消毒工作完畢應(yīng)對工作臺面消毒，推薦用0.10.2%的次氯酸溶液消毒；用消毒液清洗后要干燥20min以上；操作過程中如有樣品、檢測試劑外濺，應(yīng)及時消毒。如有大量高濃度的傳染性液體濺出，在清潔之前應(yīng)先用1%的次氯酸鈉溶液浸泡，然后戴上手套擦凈。離心樣品時要使用密閉的罐和密封頭，防止離心時液體溢出或

8、在超/高速離心時形成氣溶膠。四、污染物處理1、艾滋病實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的所有廢棄物，包括不再需要的樣品、培養(yǎng)物和其它物品，均應(yīng)視為感染性廢棄物，應(yīng)置于專用的密封防漏容器中，安全運(yùn)至消毒室，經(jīng)高壓消毒后再進(jìn)行處理或廢棄。2、艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室常用的消毒方法（1 ） 物理消毒方法a 高壓蒸汽消毒，121，保持1520min; b 干燥空氣烘箱消毒（干烤消毒），140，保持23h。（2） 化學(xué)消毒方法 含氯消毒劑（次氯酸鈉，含有效氯20005000mg/L）、75%乙醇、2%戊二醛（3）艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室物品常用的消毒方法a、廢棄物缸：5000mg/L 次氯酸鈉。b、生物安全柜工作臺面和儀器表面：75%乙醇。c

9、、溢出物：5000mg/L次氯酸鈉。d、污染的臺面和器具：2000mg/L 次氯酸鈉,也可以用過氧化氫或過氧乙酸。器械可用2%戊二醛消毒。艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理一、范圍艾滋病檢測實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理包括質(zhì)量保證、質(zhì)量控制和質(zhì)量評價二、質(zhì)量保證1、人員培訓(xùn)檢測技術(shù)人員需經(jīng)過上崗培訓(xùn)和在崗持續(xù)培訓(xùn)。篩查實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員至少每2年1次。2、環(huán)境條件艾滋病抗體篩查實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及其建筑、設(shè)施、設(shè)備必須符合全國艾滋病檢測工作管理辦法的要求。HCV，HBV及梅毒等血清學(xué)檢測在滿足實(shí)驗(yàn)室管理要求和保證生物安全的條件下，可以與HIV檢測共享空間和設(shè)備，應(yīng)避免交叉污染。3、樣品采集、運(yùn)送和處理4、檢測方法和試劑的選擇5

10、、設(shè)備維護(hù)與校準(zhǔn)6、實(shí)驗(yàn)耗材7、文件和文件管理8、標(biāo)準(zhǔn)操作程序 （SOP）篩查實(shí)驗(yàn)室SOP文件包括：（1）樣品的接收、登記、處理、保存和運(yùn)輸；（2）檢測方法和步驟；（3）試劑使用和保存；（4）儀器的使用維護(hù)和校準(zhǔn)；（5）質(zhì)量控制要求及程序；（6）結(jié)果解釋與報告；（7）保密程序；（8）實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)、相關(guān)文件記錄與保存；（9）不確定樣品追蹤和處理；（10）實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)及實(shí)驗(yàn)室的清理和消毒；（11）標(biāo)題和編號；（12）編寫和修訂日期；（13）編寫和修訂人員姓名；（14）方法、目的和應(yīng)用范圍；（15）檢測設(shè)備；（16）試劑及有效期；（17）安全防護(hù)相關(guān)步驟；（18）結(jié)果的解釋和報告；（19）附錄，包括

11、相關(guān)的附加文件如標(biāo)準(zhǔn)表格、設(shè)備和試劑盒說明書等。9 、實(shí)驗(yàn)原始記錄表（附表4）10、 結(jié)果報告11、 樣品登記和保存三、質(zhì)量控制四、質(zhì)量評價包括內(nèi)部質(zhì)量評價和外部質(zhì)量評價。1、內(nèi)部質(zhì)量評價2、外部質(zhì)量評價篩查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加省級職能工作考核和PT。3、職能工作考核現(xiàn)場評價內(nèi)容，篩查實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場評價應(yīng)包括：實(shí)驗(yàn)室人員組成及其職責(zé)分工；實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、布局、恒溫設(shè)施；儀器設(shè)備及其使用、校準(zhǔn)記錄；質(zhì)量保證文件、實(shí)驗(yàn)室SOP文件及原始記錄；實(shí)驗(yàn)室的安全防護(hù)措施，安全用品及安全規(guī)程；消毒與污物處理方法及設(shè)施；HIV檢測資料數(shù)據(jù)庫的建設(shè)、存檔、備份、安全和保密；樣品保存和安全；開展的HIV檢測項目和檢測試劑等。梅毒

12、、乙肝檢測要點(diǎn)一、梅毒螺旋體感染人體后出現(xiàn)兩種抗體，特異體抗體和非特異性抗體。特異性抗體(TPHA)：為lgM，這種抗體一旦產(chǎn)生，終身是陽性。靈敏度高、特異性強(qiáng)非特異性抗體（反應(yīng)素 RPR）：為lgA與lgM的混合物，隨病情發(fā)展而變化?？膳c正常生物組織中的類脂抗原發(fā)生非特異性結(jié)合。 二、梅毒特異性抗體檢測：用于證實(shí)試驗(yàn)，即使患者已經(jīng)經(jīng)過充分的治療，IgG抗體仍保持陽性 所以不能用以觀察療效、復(fù)發(fā)及再感染。方法有：TP-ELISA酶聯(lián)免疫法、TPPA。梅毒非特異性抗體檢測：用于梅毒診斷療效觀察和對復(fù)發(fā)或再感染的監(jiān)測。方法有：性病實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（又稱VDRL試驗(yàn)）、快速血漿反應(yīng)素(RPR)試驗(yàn)、梅毒甲

13、苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST）、世界衛(wèi)生組織推薦用RPR等方法進(jìn)行過篩試驗(yàn)，出現(xiàn)陽性者再用TPHA等方法進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。 三、梅毒滴度測定使用儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀 轉(zhuǎn)速：100轉(zhuǎn)/min 室溫四、乙肝定性：檢測方法同艾滋病篩查。五、乙肝定量：乙肝病毒DNA檢測特點(diǎn)：靈敏度高、易出現(xiàn)假陽性、數(shù)據(jù)波動大 要點(diǎn)：合理分區(qū)、防止污染。附表1HIV抗體篩查報告REPORT OF HIV ANTIBODY SCREENING TESTING秘密 編號：SECRET NO.：送檢單位FROM送檢日期DATE年 月 日送檢樣品SPECIMEN全血 血漿 血清唾液 尿 其它：_送檢人群POPULATION姓名NA

14、ME年齡 AGE 性別GENDER職業(yè)OCCUPATION國籍NATIONALITY民族ETHNICS婚姻狀況MARRIAGE文化程度EDUCATION身份證號ID NUMBER聯(lián)系電話PHONE現(xiàn)住址ADDRESS_省_市_縣_鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）_村_（門牌號）戶籍地址PERMANENT ADDRESS_省_市_縣_鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）_村_（門牌號）檢測方法METHODS檢測結(jié)果RESULTS檢測日期TESTING DATE備注NOTE酶免實(shí)驗(yàn)（ELISA）陽性 陰性 化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）陽性 陰性 顆粒凝集實(shí)驗(yàn)（PA） 陽性 陰性 快速實(shí)驗(yàn)（RT） 陽性 陰性 其它實(shí)驗(yàn)：

15、_陽性 陰性 初篩結(jié)論CONCLUTIONHIV抗體待復(fù)檢 陰性 檢測者OPERATOR復(fù)核者REOPERATOR簽發(fā)者HEAD報告日期DATE年 月 日篩查單位或?qū)嶒?yàn)室（公章）INSTITUTION OR LABORATORY （OFFICIAL SEAL）備注NOTEPRINTED BY CHINESE CENTER FORDISEASE CONTROL AND PREVENTION 中國疾病預(yù)防控制中心制訂附表2HIV抗體復(fù)檢檢測單秘密編號送檢單位送檢日期 年 月 日送檢樣品血（全血 血漿 血清） 唾液 尿送檢人群姓名性別年齡職業(yè)國籍民族既往病史現(xiàn)住址_省_市_縣（區(qū)）_鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道）

16、_村_（門牌號）戶籍地址_省_市_縣（區(qū)）_鄉(xiāng)（鎮(zhèn)、街道） _村_（門牌號）初篩復(fù)檢（第一次）復(fù)檢（第二次）檢測方法ELISA PA 化學(xué)發(fā)光 RT 其它實(shí)驗(yàn)：_ ELISA PA 化學(xué)發(fā)光 RT 其它實(shí)驗(yàn)：_ ELISA PA 化學(xué)發(fā)光 RT 其它實(shí)驗(yàn)：_ 檢測日期 年 月 日 年 月 日 年 月 日試劑廠家批 號有效日期檢測結(jié)果陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陰性 復(fù)檢結(jié)論 HIV抗體待確證 陰性 檢測者審核者送檢單位（公章）： 備注：電話:郵編:中國疾病預(yù)防控制中心制訂附表3HIV抗體復(fù)檢檢測單 樣品受理號： 編號：送檢單位送檢日期 年 月 日送檢樣品血清 送檢人群姓名性別年齡 職業(yè)婚姻民族身份證號現(xiàn)住址電話戶籍地址初篩復(fù)檢（第一次）復(fù)檢（第二次）檢測方法ELISAELISA ELISA檢測日期 年 月 日年 月 日年 月 日試劑廠家批 號有效日期ELISA法OD值空白 陰性對照均值 陽性對照 臨 界 值 送檢標(biāo)本復(fù)檢結(jié)論HIV抗體待確證檢測者審核者送檢單位（公章）： 電話: 郵編:備注：岳陽市疾病預(yù)防控制中心 YYCDC附表4ELISA法原始記錄（HIV抗體檢測）樣品數(shù)量： 標(biāo)本類型：血清使用試劑： HIV 1/2 生產(chǎn)廠家：有 效