人神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠中樞膽堿能神經(jīng)元損傷后作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、    人神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠中樞膽堿能 神經(jīng)元損傷后作用的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】目的研究人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(HNGF)對(duì)大鼠中樞膽堿能神經(jīng)元軸突切斷后的保護(hù)作用。方法向雙側(cè)海馬傘切斷所致的癡呆大鼠腦室內(nèi)注入HNGF，采用穿梭箱訓(xùn)練，檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)狀況，對(duì)腦內(nèi)隔-斜帶復(fù)合體(S-DB)中隔區(qū)(MS)膽堿能神經(jīng)元采用膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(CHAT)免疫組化法觀(guān)察其存活狀態(tài)。結(jié)果HNGF組大鼠術(shù)后兩周內(nèi)穿梭箱回避次數(shù)高于對(duì)照組(P0.01)，回避潛伏期短于對(duì)照

2、組(P0.01)。免疫組化及像分析顯示，其膽堿能神經(jīng)元存活狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論HNGF對(duì)大鼠中樞膽堿能神經(jīng)元損傷具有短期保護(hù)作用；減緩軸突切斷引起的退行性變，對(duì)癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)有促進(jìn)作用?！娟P(guān)鍵詞】神經(jīng)生長(zhǎng)因子膽堿能神經(jīng)元損傷 Experimental study for the effect of human nerve growth factor on the septal cholinergic neurons after axotomy in the adult rat brainCHENG GangGe,ZHANG Ji, WANG Jazheng,et al.Departm

3、nt of Neurosurgry, General Air Force Hospital,Beijing 100036【Abstract】ObjectiveTo study the protective effect of human nerve growth factor on the septal cholinergic neurons suffering from axotomy in adult rats.MethodsAdult rats with bilateral transections of fimbria received intra-ventricular infusi

4、on of HNGF or saline.The acquisitions of active avoidance conditioned response were investigated after frimbia lesions to examine the function on recovery of study and memory.The choline acelytransferase immunoreactive neurons in the septal complex were visualized to observe their survival state.Res

5、ultsThe rats with HNGF treatment acquired the active avoidance conditioned responses more rapidly than those suffering from the same injury but with saline(P<0.01),both in avoid numbers and latency time.The immunocyto chemistry and the image analysis showed that the survival state of cholinergic

6、neurons with HNGF was better than those with saline.ConclusionsHNGF can not only protect the lesioned neurons and significantly reduce axotomy-induced degenerative changes of these cholinergic neurons in the septal complex but also promote behavioral recovery of the lesioned dimentia rat in the shor

7、t period of postoperation.【Key words】Human nerve growth factorCholinergic neurons injury近年研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)基底前腦膽堿能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，是促進(jìn)神經(jīng)元存活和功能修復(fù)的重要因素。在治療與中樞膽堿能神經(jīng)元損傷或退行性變有關(guān)的疾病方面具有潛力。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)，從形態(tài)學(xué)和行為學(xué)研究其對(duì)癡呆鼠的作用，為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。報(bào)告如下：材料和方法1. 動(dòng)物分組：Wister 雄性大鼠80只，體重200250克。首先檢測(cè)動(dòng)物記憶能力，每天上午9時(shí)行主動(dòng)回避穿梭箱訓(xùn)練1(儀器：SOF-700LS Shuttlc Box

8、 Avoidcncc 美國(guó))，1次/天。連續(xù)5天，記錄回避次數(shù)，潛伏期。燈亮為條件刺激，電擊時(shí)間5S，電流1.5mA，共30次。按動(dòng)物記憶力應(yīng)均衡的原則隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(Sham)組n=26,對(duì)照組(Control)組n=27，HNGF組n=27。2. 癡呆鼠模型建立2：將HNGF組和Control 組大鼠經(jīng)復(fù)方氯胺酮麻醉，固定在腦立體定位儀上。剪去頭皮，形成以前囟為中心，直徑1.0cm的圓型頭皮缺損，顯露顱骨，定位海馬傘切斷坐標(biāo)：前囟后1.9mm，中線(xiàn)旁1mm。將自制寬為4mm的扁刀自顱骨表面，垂直向下切入5mm，左右各一次，即完成海馬傘切斷。Sham組刀向下23mm，只切斷相應(yīng)部位皮

9、層。3. 給藥與訓(xùn)練：海馬傘切斷后隨即安裝腦室內(nèi)導(dǎo)管，方法參照龍大宏等2方法。HNGF組隨即注入10l(10g,2.5U)HNGF(從人胎盤(pán)中提取，南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所提供。)，術(shù)后第5，10天分別再給5l。給藥速度2l/min，注藥后，插入內(nèi)芯，以防藥液外滲；Sham和Control 組同法注入生理鹽水。術(shù)后肌注青霉素5天，以防感染，第5天行穿梭箱訓(xùn)練，一次/天，歷時(shí)12天直到第16天為止。記錄回避次數(shù)、潛伏期。4. 免疫細(xì)胞化學(xué)染色：所有大鼠于術(shù)后第17天處死。免疫組化法參照董新文方法3。切片頭端始于胼胝體交叉的起始水平，尾端至前連合交叉前緣，片厚40m，每隔0.2mm取一張切片，作CH

10、AT免疫組化染色。從頭端開(kāi)始，各取一個(gè)系列切片中的5個(gè)切面，為S-DB復(fù)合體的代表平面。5. 形態(tài)計(jì)量學(xué)：3 (1)計(jì)數(shù)：對(duì)每只動(dòng)物隔-斜帶核(S-DB)復(fù)合體的五個(gè)代表平面中的內(nèi)側(cè)隔核(MS區(qū))的CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)，方法為在顯微鏡下記錄有細(xì)胞核和至少一個(gè)突起的神經(jīng)元。MS區(qū)CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元相對(duì)總數(shù)是五個(gè)平面CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元個(gè)數(shù)之和。(2)像分析：測(cè)定每組第3張切片中MS區(qū)CHAT陽(yáng)性細(xì)胞面積、吸光度。6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)做t檢驗(yàn)。結(jié)果1. HNGF對(duì)癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響：見(jiàn)表1。 表1術(shù)后各組歷時(shí)12天Shuttlebox總平均回避次數(shù)，潛伏期(±s)組別n回避次數(shù)

11、潛伏期(S)SHAM2622±43.68±0.56HNGF 2719±4?4.14±0.85?CONTROL276±4?6.02±0.40?*P0.01，*P0.01 2. HNGF對(duì)膽堿能神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響：見(jiàn)表2。 Sham組和HNGF組S-DB復(fù)合體CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元分布范圍較廣，左右兩側(cè)大致相等。MS兩側(cè)CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元結(jié)合形成倒“V”形，靠近中線(xiàn)細(xì)胞中等大小，中線(xiàn)外側(cè)的細(xì)胞較小，細(xì)胞多呈橢圓形，突起較小。Control組S-DB復(fù)合體CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量分布明顯減少，細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)，突起明顯減少，出現(xiàn)軸突的斷裂。討論1

12、. NGF是神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，由靶細(xì)胞分泌，被神經(jīng)元末梢吸取，對(duì)維持神經(jīng)元的生長(zhǎng)、發(fā)育起重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中(CNS)NGF 的效應(yīng)神經(jīng)元是隔區(qū)、斜束核和基底核的膽堿能神經(jīng)元，其軸突投射到皮層和海馬，構(gòu)成膽堿能通路，其功能與學(xué)習(xí)和記憶關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)證實(shí)CNS中注入NGF后，可由海馬逆行運(yùn)輸?shù)絻?nèi)側(cè)隔區(qū)和斜束核，從新皮層逆行到基底核，使這些腦區(qū)的膽堿能神經(jīng)元的cAMP、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(CHAT)活性均增高，表明NGF對(duì)腦膽堿能神經(jīng)元的正常發(fā)育和功能維持有明顯的效應(yīng)。海馬傘切斷后造成隔區(qū)膽堿能神經(jīng)元NGF來(lái)源喪失，膽堿能神經(jīng)元變性壞死，此時(shí)向腦內(nèi)輸注外源性NGF能減少膽堿能神經(jīng)元的喪失2，

13、4。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)HNGF對(duì)雙側(cè)海馬傘切斷的大鼠腦內(nèi)S-DB復(fù)合體中膽堿能神經(jīng)元表2HNGF對(duì)MS區(qū)CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元計(jì)數(shù)、面積、吸光度的影響(±s)組別n計(jì)數(shù)面積(m2)吸光度SHAM26743±57120.81±42.530.19 ±0.03HNGF 27716±30(96%)?118.29±44.870.18±0.02CONTROL27314±41(43%)?81.56±40.310.09±0.02*P0.01，?*P0.01，*P0.01 具有保護(hù)作用；對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的改善有促進(jìn)作用。在

14、術(shù)后516天連續(xù)Shuttlebox 訓(xùn)練中HNGF組的平均回避次數(shù)高于對(duì)照組，且隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，HNGF組平均回避次數(shù)上升快于對(duì)照組，平均潛伏期下降快于對(duì)照組，且較之縮短。說(shuō)明HNGF對(duì)癡呆鼠的學(xué)習(xí)獲取能力和記憶保持能力的提高有促作用。從細(xì)胞形態(tài)學(xué)來(lái)看，HNGF組CHAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，為Sham組的96%；而Control組僅為43%。HNGF組膽堿能神經(jīng)元的面積明顯大于對(duì)照組，Control組細(xì)胞明顯萎縮，突起減少，吸光度小于HNGF和Sham組，表明HNGF可減少膽堿能神經(jīng)元的CHAT含量的下降，其細(xì)胞存活質(zhì)量?jī)?yōu)于對(duì)照組。從行為學(xué)和形態(tài)學(xué)方面為HNGF的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)

15、依據(jù)。2. 學(xué)習(xí)與記憶是動(dòng)物和人賴(lài)以生存所不可缺少的重要腦功能，而突觸起著至關(guān)重要的作用，學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中有關(guān)的突觸發(fā)生了某些變化，導(dǎo)致突觸連接的增強(qiáng)和傳遞效應(yīng)的提高。隔-海馬通路與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，切斷后造成動(dòng)物癡呆1，2，4。有人2將NGF注入癡呆鼠腦內(nèi)，可使癡呆鼠損傷側(cè)海馬齒狀回分子層內(nèi)突觸的數(shù)量和形成得到修復(fù)，從而促進(jìn)了大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的恢復(fù)。推測(cè)這種作用是由于NGF促進(jìn)去神經(jīng)支配區(qū)的膽堿能纖維數(shù)量增加，使新的突觸不斷形成的結(jié)果。此外NGF還能促進(jìn)單個(gè)軸突末梢形成較多的突觸，這有助于神經(jīng)元損傷后功能的迅速恢復(fù)。在突觸傳遞過(guò)程中遞質(zhì)起著關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)HNGF可減少損傷后膽堿能神經(jīng)

16、元CHAT含量的下降，有助于合成和釋放乙酰膽堿(ACH)，可能與癡呆鼠記憶功能的改善有關(guān)2，4，5。Tuszynski等6報(bào)道了重組人NGF注入靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物腦室可防止單側(cè)穹窿橫切造成的膽堿能神經(jīng)元變性，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，且MS區(qū)CHAT、NGF受體標(biāo)記的強(qiáng)度增加。3. NGF在治療神經(jīng)損傷動(dòng)物模型中獲得的成功，預(yù)示臨床應(yīng)用具有廣闊前景。我們認(rèn)為在加強(qiáng)基礎(chǔ)研究的同時(shí)，應(yīng)逐步擴(kuò)大臨床應(yīng)用。目前NGF臨床主要用于治療腦脊髓外傷和基底前腦膽堿能神經(jīng)元退行性變所致的早老性癡呆(Alzheimer's disease)，并取得了一些成果 。Olson7首次報(bào)道NGF早老性癡呆的臨床實(shí)驗(yàn)，一位69歲的癡呆

17、患者經(jīng)3個(gè)月的腦室內(nèi)輸注NGF后，皮層腦血流量、腦電和語(yǔ)言記憶測(cè)試都明顯改善。但是，也應(yīng)看到NGF的臨床仍有許多問(wèn)題待解決。首先，人的NGF來(lái)源甚少，不能滿(mǎn)足臨床需要，因此，利用基因工程大規(guī)模的生產(chǎn)成為開(kāi)展應(yīng)用的必要前提。其次，NGF不能透過(guò)血腦屏障，故設(shè)計(jì)合理的給藥途徑，解決通過(guò)血腦屏障和長(zhǎng)期穩(wěn)定釋放是一關(guān)鍵課題。近年來(lái)進(jìn)行了基因工程化細(xì)胞移植和聚合物膠囊化細(xì)胞移植有望解決這一難題。本實(shí)驗(yàn)僅從形態(tài)學(xué)及行為學(xué)就HNGF對(duì)受損的中樞膽堿能神經(jīng)元和癡呆大鼠的短期作用進(jìn)行了研究，其長(zhǎng)期療效及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。作者單位：100036北京空軍總醫(yī)院神經(jīng)外科(程鋼戈)；北京解放軍總醫(yī)院神經(jīng)外科(張紀(jì)

18、、段國(guó)升、周定標(biāo)、雪梅、朱萍)；北京解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院三所(汪家政、趙楠)參考文獻(xiàn)1Casamenti F,Dipatre PL,Bartolini L,et al.Unilateral and bilateral nucleus basalis lesions:differences in neurochemical and behavoural recovery. Neuroscience,1988,24:209-215.2龍大宏，姚志彬，何蘊(yùn)韶, 等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子促進(jìn)老年癡呆鼠學(xué)習(xí)記憶恢復(fù)和海馬突觸重建.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，1996，12：131-136.3董新文.大鼠隔-斜帶復(fù)合體中含小白蛋白和含膽堿乙酰化酶的神經(jīng)元.解剖學(xué)報(bào)，1994，25：6-11.4Heftei F.