生長(zhǎng)及凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、生長(zhǎng)及凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究作者：肖柳英，洪暉菁，潘競(jìng)鏘，呂俊華，沈文娟【摘要】 目的利用血清藥的方法，觀察荔枝核含藥血清體外的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；并研究荔枝核對(duì)小鼠S180，EAC體內(nèi)、外細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡作用。方法小鼠 S180，EAC細(xì)胞混懸液用生理鹽水按1:1進(jìn)行稀釋制成含瘤腹水混懸液,在給藥前24 h,每只小鼠腋窩皮下接種0.2 ml。荔枝核水提液對(duì)小鼠S180，EAC抑瘤實(shí)驗(yàn)連續(xù)給藥10 d。測(cè)定腫瘤作用與細(xì)胞凋亡表達(dá)。結(jié)果荔枝核提取物30%含藥血清高中劑量和20%含藥血清高劑量對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑瘤作用， Hochest染色腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)；而流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見30%含藥血

2、清高中低劑量的促腫瘤凋亡率分別是63.3%，45.5%和23.8%，明顯高于正常血清組。荔枝核水提物能夠明顯抑制S180，EAC腫瘤的生長(zhǎng)（P0.05），荔枝核提取物對(duì)荷S180小鼠高劑量組的抑瘤率達(dá)到32.81%。對(duì)荷EAC實(shí)體瘤小鼠的腫瘤其抑瘤率達(dá)到30.62%；結(jié)論荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC體內(nèi)、外細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而表現(xiàn)抗腫瘤的作用。 【關(guān)鍵詞】 荔枝核 小鼠 S180 EAC 抑瘤作用 凋亡荔枝核為無患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn的干燥成熟種子。夏季采摘成熟果實(shí)，除去果皮及肉質(zhì)假種皮，洗凈，曬干1。荔枝及荔枝核的和藥用價(jià)值逐漸受到

3、關(guān)注,近幾年來已有多篇報(bào)道用荔枝核中藥糖尿病的經(jīng)驗(yàn)2，荔枝核具有調(diào)血脂、保肝以及抗氧化等作用3，4，特別是荔枝核的多糖成分在抗腫瘤、提高機(jī)體免疫活性方面具有較大的關(guān)注。基于以上的研究，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究荔枝核對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)、外細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響報(bào)道如下。1 材料1.1 動(dòng)物清潔級(jí) ，新西蘭雄性大白兔,購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：粵監(jiān)證字2006A001。SPF級(jí)小鼠 ，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào): 粵監(jiān)證字2006A018。1.2 儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo fora美國(guó)）；AIR TECH型醫(yī)用超凈臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；XSZ-D

4、型倒置生物顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)；熒光顯微鏡（Olympus Japan）；BIO-RAD-450型酶標(biāo)定量測(cè)試儀（美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur型Becton Dickinson）；BIO-RAD 電泳儀（美國(guó)）；Eppendorf 低溫高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)）。1.3 試藥荔枝核提取物：顆粒（顆粒生藥110），廣東一方制藥業(yè)有限公司；批號(hào)（0604229）。 環(huán)磷酰胺（CTX）：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：05010821。RPIM 1640培養(yǎng)液（GIBCO公司產(chǎn)品），批號(hào)1285082；青霉素、鏈霉素（廣州白云山天心制藥股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料

5、有限公司產(chǎn)品），批號(hào)060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生產(chǎn)）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，SIGMA公司產(chǎn)品）；二甲基亞砜（DMSO；美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品）；Hochest33258(碧云天生物技術(shù)公司)；PI染料 sigma；細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)； BAX抗體（cell signaling）； BCL-2抗體（santa cruz）；GAPDH抗體（Chemicon）；ECL發(fā)光液；pierce 批號(hào)：HI106361 ；丙烯酰胺 sigma ; 甲叉丙烯酰胺 sigma ；SDS-十二烷基磺酸鈉sigma；甘氨酸 Biorad；TWEEN-20 sigma；TRIS-B

6、ASE sigma;TRIS sigma ;脫脂奶粉sigma ;NC膜minipore; WHATMAN濾紙 whatman。2 方法2.1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線2.1.1 離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.1.2 在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2.2 含藥血清的制備按李儀奎等5方法制備含藥血清：將體重約1.5 kg的健康雄性新西蘭大白兔10只隨機(jī)分為荔枝核顆粒劑高、中、低劑量組和環(huán)磷酰胺（陽性對(duì)照）組，另設(shè)生理鹽水（空白對(duì)照）組，共5組，每組2只。荔枝核顆粒劑高、中、低劑量組給藥劑量分別為168，84，42 gkg-1d-1，環(huán)磷酰胺組給藥劑量為42.4 gkg-1d-1，空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水。各組動(dòng)物每天灌胃給藥或生理鹽水

7、，2次/d，每次間隔12 h，灌藥前4h禁食不禁水，連續(xù)3 d，末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥鈉麻醉，頸動(dòng)脈采血，4下靜置4 h，3 000 rmin-1離心15 min，無菌分離血清經(jīng)56，30 min滅活處理后，0.20 m微孔濾膜過濾除菌，置20保存?zhèn)溆谩?.3 MTT法檢測(cè)含藥血清對(duì) HepG2細(xì)胞的抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞HepG2細(xì)胞，以3104 ml-1的細(xì)胞濃度在96孔板上每孔接種100 l，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后，以不同濃度組含藥血清體積比分別為10%，20%，30%作用于細(xì)胞，每組濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72h后分別測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，重復(fù)3次取平均值采用,結(jié)果見圖1;實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果表明：荔枝核提取物30%含藥血清高、中劑量和20%含藥血清高劑量對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑瘤作用。2.4 Hochest33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡將無菌的鋪有多聚賴氨酸蓋玻片置于六孔板內(nèi)，以4105 ml-1細(xì)胞接種24 h后， 加入含藥血清作用72h后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min后，去固定液，用PBS洗3遍，5 min/次，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，邊晃動(dòng)邊染色?？勾銣缫悍馄螅脽晒怙@微鏡下觀察，拍片；結(jié)果見表1；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：其抑瘤作用機(jī)理可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，如圖1可見，Hochest染色腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡

9、形態(tài)。 表1 荔枝核提取物含藥血清作用HepG2細(xì)胞72h的OD值(略)2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以4105 ml-1到25 ml玻璃培養(yǎng)瓶，待其貼壁生長(zhǎng)24 h后，加藥72 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，用冷PBS洗滌兩次，將細(xì)胞重懸于70%的冰乙醇固定24 h，離心棄乙醇，PBS洗滌1次，滴加已配好的200lml-1 Rnase 0.5 ml，放置4 h以上，離心棄上清液，PBS洗滌1次，加0.5ml碘化丙錠（PI），過夜，離心棄PI，再用PBS洗滌1次，立即上機(jī)；結(jié)果見圖2和表2; 而流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見30%含藥血清高中低劑量的促腫瘤凋亡率分別

10、是63.3%，45.5%和23.8%，明顯高于正常血清組。2.6 腫瘤模型的建立2.6.1 小鼠S180，EAC移植性腫瘤模型6無菌抽取接種7 d后小鼠腹水,加生理鹽水稀釋使細(xì)胞密度達(dá)到2106ml-1于每只小鼠右前肢腋窩處皮下常規(guī)接種一腫瘤細(xì)胞懸液0.2 ml，制成局灶性實(shí)體瘤模型。2.6.2 動(dòng)物分組及處理接種24 h后,隨機(jī)分成空白組、陽性對(duì)照組（CTX）、荔枝核高中低劑量組，每組10只?？瞻捉M以0.1ml（10 g）-1灌胃給以生理鹽水，陽性對(duì)照組CTX 25 mgkg-1d-1，荔枝核高劑量組62 gkg-1d-1，荔枝核中劑量組31 gkg-1d-1，荔枝核低劑量組15.5 gkg

11、-1d-1。灌胃給藥1次/d，連續(xù)9 d，于第10天，將各組小鼠稱體重后處死,完整剝離瘤塊并稱重，按照公式:(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)100%/對(duì)照組平均瘤重,抑瘤率。結(jié)果（見表34）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：荔枝核提取物對(duì)荷EAC實(shí)體瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有一定的抑瘤作用，主要是高劑量組表現(xiàn)明顯，其抑瘤率達(dá)到30.62%；對(duì)荷S180小鼠高劑量組的抑瘤率達(dá)到32.81%。2.7 Western blot 方法 檢測(cè)bcl-2 ,bax含量的表達(dá)7按試劑盒說明，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。2.7.1 蛋白電泳SDS聚丙烯酰胺凝膠的配制：12%分離膠： 雙蒸水 3.35 ml; 1.5

12、mol/L Tris ( pH=8.8 ) 2.5 ml; 30%丙烯酰胺 4 ml；10%SDS 0.1 ml；10%過硫酸胺 50 l；TEMED 5 l (臨用前加入)；5%濃縮膠： 雙蒸水 3.4 ml; 0.5 mol/L Tris ( pH=6.8 ) 0.625 ml；30%丙烯酰胺 0.850 ml；10%SDS 0.05 ml；10%過硫酸胺 50 l；TEMED 5 l (臨用前加入)。2.7.2 操作步驟按說明書裝好電泳槽及玻璃板，同時(shí)做2塊膠，一塊染色，一塊轉(zhuǎn)膜；確定所需凝膠的體積，按分離膠的配方依次混合各種成分，一旦加入TEMED后馬上開始聚合，故應(yīng)該立即旋動(dòng)混合物；

13、 迅速在2塊玻璃板的間隙中小心注入丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠的所需空間，并快速在膠的上方加滿雙蒸水，放置30min后用濾紙小心吸凈雙蒸水，用筆記錄分離膠的上緣；按濃縮膠的配方制備濃縮膠，加入TEMED后，立即快速旋動(dòng)混合物；在已聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子，小心避免混入氣泡，室溫下放置15 min；小心拔出梳子，按電泳裝置的要求進(jìn)行安裝，加樣70 ug/孔；電泳，濃縮膠中以80 V電泳約15 min，在溴酚藍(lán)跑到接近分離膠時(shí)改電壓為120 V，再繼續(xù)電泳約75 min；電泳結(jié)束后，小心把膠從2塊玻璃中剝離出來，放入考馬斯藍(lán)染色液中，30 min后拿出，放入脫

14、色液中直至背景褪色，蛋白條帶清晰為止。表2 荔枝核含藥血清對(duì) HepG2細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果（略）表3 荔枝核提取物對(duì)小鼠EAC實(shí)體瘤生長(zhǎng)抑制作用(略) 2.7.3 蛋白的電轉(zhuǎn)移、抗體孵育和顯影轉(zhuǎn)膜：戴手套切6張濾紙和1張NC膜，大小與凝膠完全一致，并置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30 min。將3層濾紙、NC膜、凝膠、3層濾紙的順序排好，使之完全對(duì)齊，精確重疊，層間不留氣泡，并用鉛筆在一角做標(biāo)記。按黑色板夾子海綿墊3層濾紙凝膠NC膜3層濾紙海綿墊透明夾子的順序固定好，按紅黑方向放置于轉(zhuǎn)移槽中，往槽中加滿轉(zhuǎn)移緩沖液，接通電源，4，80 V轉(zhuǎn)移120 min，然后中止電源，取出NC膜進(jìn)行雜交，并將凝膠轉(zhuǎn)至考

15、馬斯亮蘭染料中進(jìn)行染色，檢測(cè)蛋白是否轉(zhuǎn)移完全。轉(zhuǎn)印完畢將NC膜分為3塊，分別用TBST洗膜3次，10 min/次； 封閉：用含有5%脫脂奶粉TBST 封閉放置于脫色搖床上，室溫反應(yīng)120 min，并用TBST緩沖液將NC膜洗3次，10 min/次；一塊用一抗anti-bcl-2，（1100TBS-5%milk-0.1%Tween20稀釋），一塊用anti-bax（二抗用羊抗兔），一塊用anti-GAPDH（二抗用羊抗鼠）（11000TBS-5%milk-0.1%Tween20稀釋）4孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，10 min/次；分別用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠二抗Ig

16、G-HRP，室溫緩慢震蕩1 h后，TBST洗膜3次，每次10min；將Westernblot化學(xué)熒光試劑A，B各500 l等量混合后，于暗房，均勻加至膜上反應(yīng)3 min，X光片曝光，凝膠圖像分析儀掃描圖像。表4 荔枝核提取物對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)抑制作用(略) 通過Western blot分析，結(jié)果見圖34，荔枝核對(duì)小鼠S180EAC細(xì)胞生長(zhǎng)其抑瘤作用主要是通過促進(jìn)促凋亡蛋白bax的表達(dá)，減少抑制凋亡蛋白bcl2的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而表現(xiàn)抗腫瘤作用。1 3 結(jié)果荔枝核提取物30%含藥血清高中劑量和20%含藥血清高劑量對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑瘤作用，（見表1），其抑瘤作用機(jī)

17、理可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，如圖1可見，Hochest染色腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)；而流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見30%含藥血清高中低劑量的促腫瘤凋亡率分別是63.3%，45.5%和23.8%，明顯高于正常血清組。 荔枝核提取物對(duì)荷EAC實(shí)體瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有一定的抑瘤作用，主要是高劑量組表現(xiàn)明顯，其抑瘤率達(dá)到30.62%；對(duì)荷S180小鼠高劑量組的抑瘤率達(dá)到32.81%。通過Western blot分析，其抑瘤作用主要是通過促進(jìn)促凋亡蛋白bax的表達(dá)，減少抑制凋亡蛋白Bcl 2的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而表現(xiàn)抗腫瘤作用。4 討論 本實(shí)驗(yàn)利用荔枝核對(duì)S180，EAC實(shí)體瘤經(jīng)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),結(jié)果一致，表

18、明荔枝核對(duì)S180，EAC實(shí)體瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)有一定的抑瘤作用（P0.050.01），結(jié)果（見表14），與報(bào)道一致6。荔枝核“行氣散結(jié)，祛寒止痛。用于寒疝腹痛，睪丸腫痛”也證實(shí)動(dòng)物體內(nèi)荔枝核對(duì)小鼠S180，肝癌有一定的抑制腫瘤作用6。Purmova等8研究表明，荔枝以及人參、柴胡、大豆、黃芪等皂苷對(duì)心臟功能發(fā)揮直接作用或有助于相關(guān)疾病，如抑制心肌或肝臟脂質(zhì)過氧化物的形成及影響心肌或肝臟酶的功能，調(diào)整血液凝固、降低膽固醇和血糖水平，或刺激免疫系統(tǒng)、推斷皂苷是一組有希望防治心臟和系統(tǒng)疾病的天然化合物。荔枝核水提液既能降低正常小鼠的血糖又能降低四氧嘧啶(ALX)所致小鼠的高血糖9。鐘鳴等10觀察了荔

19、枝口服液對(duì)ALX-DM大鼠降血糖作用25 gkg-1灌胃2周后，病鼠空腹血糖水平明顯下降至接近正常對(duì)照組，與3 gkg-1的甲苯磺丁脲相當(dāng);空腹血清胰島素含量高于服藥前和模型組1倍,但僅為正常對(duì)照組的三分之一,說明荔枝口服液在一定程度上能提高糖尿病大鼠血清胰島素的含量。這可能與荔枝核抗氧化、保護(hù)或促進(jìn)受損胰腺細(xì)胞修復(fù)作用有關(guān)。肖柳英等11實(shí)驗(yàn)證明，荔枝核（41.6和20.8 gkg-1）能明顯降低卡介苗加脂多糖致免疫性肝炎以及硫代乙酰胺(TAA)和四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)急性肝損傷模型小鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性和丙二醛（MDA）含量，提高血清超氧化

20、物歧化酶（SOD）活性和總蛋白、白蛋白含量。荔枝核提取物能改變實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病（T2DM）伴胰島素抵抗（IR）模型大鼠血糖、血脂、胰島素、胰島素敏感指數(shù)（ISI）、痩素、腫瘤壞死因子-（TNF- ）等指標(biāo)，糾正T2DM伴IR大鼠胰島素抵抗相關(guān)脂肪細(xì)胞因子，改善糖、脂代謝紊亂，增強(qiáng)胰島素敏感性12。徐慶等13檢測(cè)荔枝核提取物A，B，C，D，E和F（200和100 mgL-1）對(duì)HePG2，2，15細(xì)胞HBsAg與HBeAg表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，荔枝核提取物A，B，C，D，E和F在200和100 mgL-1濃度下對(duì)HBsAg和HBeAg表達(dá)均有抑制作用，其中以E成分作用最強(qiáng)，在200 mgL-1濃

21、度下，實(shí)驗(yàn)第3天對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率分別為50%和20%，實(shí)驗(yàn)第9天分別達(dá)到90%和84.3%, 證明荔枝核提取物體外有較強(qiáng)的抗乙肝病毒作用。肖柳英等14觀察荔枝核對(duì)治療48例慢性乙型肝炎療效臨床研究，用荔枝核治療6個(gè)月，觀察肝功能、肝纖維化、B超等指標(biāo)結(jié)果，治療4周后治療組乏力、納差、腹脹、肝區(qū)不適等有改善。治療12周后，ALT，A，TBiL有改善，AST，G有明顯的改善，治療24周后，HA，LN，PC，IV-C有明顯的改善，并有降低血脂，膽固醇、甘油三酯的作用。 荔枝核中具有藥理活性的主要有效部位是黃酮類化合物和總皂苷。黃酮、異黃酮及皂苷是具有多種生物活性和藥理作用的化合物，它

22、們的作用涵蓋了清除自由基、抗氧化、抗感染 、抗過敏、抗菌 、抗病毒、抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松、抗血栓、抗致癌物質(zhì)、抑制增生、保護(hù)肝臟、保護(hù)心血管等多個(gè)方面，對(duì)治療和預(yù)防腫瘤 、衰老、心血管疾病具有重要意義15，16。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)是利用血清藥的方法，觀察荔枝核含藥血清體外的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；通過建立小鼠S180，EAC移植性腫瘤模型，觀察其體內(nèi)抑制腫瘤的作用，采用分子生物學(xué)的方法初步探討荔枝核誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC體內(nèi)、外細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而表現(xiàn)抗腫瘤的作用。利用荔枝核繼續(xù)深入開展有效成分研究,作為腫瘤抑制劑應(yīng)用于腫瘤臨床治療的

23、輔助劑提供有意義的依據(jù)。是否能用于治療抗腫瘤其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。【文獻(xiàn)】 1國(guó)家藥典委員會(huì).藥典，部S.北京:化學(xué)出版社,2005：169.2American Diabetes Association Roport of the expert committee ondiagnsis and classification of dabetes mellitusJ.Diabetes Care,1997,20(7)：1183. 3潘競(jìng)鏘,劉惠純,劉廣南,等.荔枝核降血糖、調(diào)血脂和抗氧化的實(shí)驗(yàn)研究J.廣東藥學(xué),1999,9(1):47.4肖柳英,潘竟鏘,饒衛(wèi)農(nóng),等.荔枝核顆粒對(duì)小鼠肝損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中華中醫(yī)藥雜志,2005,20(1):42.5李儀奎,吳健宇.血清藥理實(shí)驗(yàn)中采血時(shí)間的通法方案J.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1999,15(6)：569.6肖柳英,張 丹，馮昭明，等.荔枝核對(duì)小鼠抗腫瘤作用研究J.中藥材，2004，27（7）：517.7王海燕，蔡 兵，崔承彬，等.蔓荊子活性成分Vitexicarpin誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制J.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（1)：27.8Purmova J, Ooletal L. Phytotherapeutic aspects of diseases