高效液相色譜-HPLC

1、一高效液相根底知識2021.03.2920212021年樣品檢測組操作技能培訓年樣品檢測組操作技能培訓 色譜法原理與分類 HPLC的組成 HPLC的應用 HPLC色譜圖名詞術語 HPLC定量分析原理高效液相色譜根底知識 什么是色譜法 色譜法溯源 Tswett茨維特)的實驗 色譜法原理 色譜法的分類色譜法原理及分類 色譜法是一種現(xiàn)代的別離分析方法 1906年正式命名(見諸文獻) 20世紀30年代開始廣泛研究和應用 高效液相色譜法的廣泛應用始于20世紀70年代什么是色譜法 100多年前俄國植物學家Tswett(茨維特)別離植物色素時采用的實驗方法 他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃

2、管,再參加石油醚使其自由流下,結果色素中各組份互相別離形成各種不同顏色的譜帶 Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他的實驗方法，即現(xiàn)在的 Chromatography(色譜法)色譜法(Chromatography)溯源 一根長玻璃管填充碳酸鈣的顆粒 將碾碎之植物葉片的提取液灌入柱中 隨著石油醚提取液向下流過柱子，現(xiàn)出展寬的色帶 別離出不同的化合物 Chromato - 顏色 Graphy - 圖象Tswett茨維特)的實驗 是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解,分配,吸附等化學作用性能的差異,當兩相作相對運動時,使各組分在兩相中反復屢次受到上述各作用力而到達相互別

3、離 兩相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase) 有一相是流動的,稱為流動相(Mobile Phase),流動相又叫洗脫劑,溶劑色譜法原理 相(Phase):物理化學術語,特指在某一系統(tǒng)中,具有相同成 分及相同物理、化學性質的均勻物質局部。各相 之間有明顯可分的界面色譜別離原理 按流動相的物態(tài)分:氣相色譜 (Gas Chromatography, GC)用氣體作為流動相(又叫載氣)液相色譜 (Liquid Chromatography, LC)用液體作為流動相(又叫洗脫劑)色譜法的分類 按固定相的形態(tài)分: 平面色譜 o 紙色譜 o 薄層色譜 柱色譜色譜法的分類色譜法的分

4、類示意圖 高效液相色譜法HPLC(High Performance Liquid Chromatography )是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜,基于儀器方法的高效能別離手段: o High 高 o Performance 性能 o Liquid 液體的 o Performance 色譜什么是HPLC？ 特點：高壓、高效、高速、高靈敏度特點：高壓、高效、高速、高靈敏度 1. 1. 高效別離高效別離 ： n =105 / n =105 /米米 2. 2. 高速高速 ：使用高壓泵，出峰時間幾分鐘到幾十分鐘：使用高壓泵，出峰時間幾分鐘到幾十分鐘 3. 3. 高靈敏度高靈敏度 ：檢測下限：檢測下限：10-9

5、-10-13g10-9-10-13g最小檢測量最小檢測量 4. 4. 自動化程度高：儀器分析、電腦控制、色譜工作站自動化程度高：儀器分析、電腦控制、色譜工作站 5. 5. 應用范圍廣應用范圍廣 ：可測有機物：可測有機物75%-80%75%-80% 適用：高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化適用：高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化 試樣的高效別離試樣的高效別離HPLC特點 按流動相和固定相的相對極性分: 正相色譜(Normal Phase Chromatography)o 固定相的極性大于流動相 反相色譜(Reversed Phase Chromatography)o 固定相的極性小于流動相 有機化合物的極性分子

6、間作用力(靜電引力,偶分子間作用力(靜電引力,偶竭力,色散力,氫鍵力)綜合表現(xiàn)的一種表述液相色譜法的分類有機化合物極性例如 按別離過程的機理分按別離過程的機理分: : 1 1 吸附色譜吸附色譜(Absorption Chromatography)(Absorption Chromatography) 根據(jù)樣品組分對活性固定相外表吸附親和力的不同實現(xiàn)別離根據(jù)樣品組分對活性固定相外表吸附親和力的不同實現(xiàn)別離2 2 分配色譜分配色譜(Partition Chromatography)(Partition Chromatography) 別離基于樣品組分在固定相和流動相中的溶解度別離基于樣品組分在固定

7、相和流動相中的溶解度( (分配系數(shù)分配系數(shù)) )不同不同3 3 離子交換色譜離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)(Ion Exchange Chromatography)根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異別離根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異別離, ,簡稱離子色譜簡稱離子色譜(IC)(IC)4 4 體積排除色譜體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography)(Size Exclusion Chromatography) GPC(Gel Permeation Chromatography) GPC(Gel Permeation Chroma

8、tography) 固定相是疏水性凝膠固定相是疏水性凝膠, ,流動相是有機溶劑流動相是有機溶劑 GFC(Gel Filtration Chromatography) GFC(Gel Filtration Chromatography) 固定相是親水性凝膠固定相是親水性凝膠, ,流動相是水溶液流動相是水溶液液相色譜法的分類 由五大局部組成：由五大局部組成： 溶劑輸送系統(tǒng)貯液器，高壓泵溶劑輸送系統(tǒng)貯液器，高壓泵 進樣系統(tǒng)進樣閥等進樣系統(tǒng)進樣閥等 別離系統(tǒng)色譜柱等別離系統(tǒng)色譜柱等 檢測系統(tǒng)檢測器等檢測系統(tǒng)檢測器等 記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)HPLC的組成1. 高壓輸液泵高壓輸液泵為了獲得高

9、柱效而使用粒度很小的固定相為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相10m，液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕等特性等特性高壓輸液泵：高壓輸液泵：恒壓泵流量隨阻力變化重現(xiàn)性差恒壓泵流量隨阻力變化重現(xiàn)性差恒流泵多用：往復式恒流泵多用：往復式 注射式注射式 作用：將流動相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。作用：將流動相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。性能：有足夠的壓力性能：有足夠的壓力 輸出流

10、量恒定，可調輸出流量恒定，可調 輸出壓力平穩(wěn)輸出壓力平穩(wěn) 泵室體積小泵室體積小 泵體抗腐蝕、耐酸泵體抗腐蝕、耐酸梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置作用：將兩種或兩種以上溶劑按一定程序連作用：將兩種或兩種以上溶劑按一定程序連續(xù)改變配比，以改變流動相極性、離子強度、續(xù)改變配比，以改變流動相極性、離子強度、 PHPH值、提高別離效率。值、提高別離效率。 低壓梯度洗脫常壓混合，高壓進柱，低壓梯度洗脫常壓混合，高壓進柱，1 1個個泵。泵。 高壓梯度洗脫高壓混合，高壓進柱，高壓梯度洗脫高壓混合，高壓進柱，2 2個個泵。泵。 安捷倫泵：小視頻色譜學堂：泵高效液相色譜儀流動相脫氣的目的高效液相色譜儀流動相脫氣的目的1

11、1、使色譜泵輸液均勻準確，減小脈動。、使色譜泵輸液均勻準確，減小脈動。2 2、提高保存時間和色譜峰面積的重現(xiàn)性。、提高保存時間和色譜峰面積的重現(xiàn)性。3 3、防止氣泡引起尖峰。、防止氣泡引起尖峰。4 4、使基線穩(wěn)定，提高信噪比。、使基線穩(wěn)定，提高信噪比。5 5、降低溶劑的紫外吸收本底。、降低溶劑的紫外吸收本底。6 6、減少死體積。、減少死體積。7 7、防止填料氧化。、防止填料氧化。視頻視頻 ：脫氣目的：脫氣目的 在線脫氣機在線脫氣機在線脫氣機2. 進樣裝置進樣裝置進樣視頻：安捷倫進樣視頻：島津3. 別離系統(tǒng)別離系統(tǒng) 包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。 色譜柱一般

12、用內部拋光的不銹鋼制成。其內徑為色譜柱一般用內部拋光的不銹鋼制成。其內徑為2 6mm，柱長為，柱長為10 50cm，柱形多為直形，內部充滿，柱形多為直形，內部充滿310 mm高效微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫高效微粒固定相。柱溫一般為室溫或接近室溫 勻漿法填充柱：勻漿法填充柱： 將填料制成懸浮液，在高壓泵的作用下壓入裝有洗將填料制成懸浮液，在高壓泵的作用下壓入裝有洗脫脫 液的色譜柱。理論塔板數(shù)可達液的色譜柱。理論塔板數(shù)可達8萬萬/米米4. 4. 檢測器檢測器 要求要求: : 靈敏度高，噪音低，線形范圍寬，響應快靈敏度高，噪音低，線形范圍寬，響應快, ,對溫度和流速的變化不敏感對溫度和流速

13、的變化不敏感 檢測器類型檢測器類型1.1.紫外可見吸收檢測器紫外可見吸收檢測器(UVD)(UVD)2.2.熒光檢測器熒光檢測器(FD)(FD)3.3.蒸發(fā)光檢測器蒸發(fā)光檢測器ELSDELSD3.3.示差折光檢測器示差折光檢測器(RID)(RID)4.4.電化學檢測器電化學檢測器(ED)(ED)5.5.化學發(fā)光檢測器化學發(fā)光檢測器(CD)(CD)1. 紫外紫外可見光度檢測器：可見光度檢測器： 固定波長：固定波長：254nm ， 低壓汞低壓汞燈。燈。 可調波長：可調波長：190800mm， 鎢燈，氘燈。鎢燈，氘燈。 光電二極管矩陣檢測器：光電二極管矩陣檢測器： 190700nm。 石英窗石英窗接色

14、譜柱接色譜柱UV光電倍增管光電倍增管廢液廢液 光電二極管矩陣檢測器特點：光電二極管矩陣檢測器特點： 靈敏度高、分辨率好、方便、快速、準確，可掃描得三維靈敏度高、分辨率好、方便、快速、準確，可掃描得三維流出曲線流出曲線 紫外檢測器的應用：紫外檢測器的應用： 對紫外有吸收的組分，且吸光度與濃度成正比。對紫外有吸收的組分，且吸光度與濃度成正比。 紫外檢測器的特點：紫外檢測器的特點： 靈敏度高靈敏度高 最小檢測濃度最小檢測濃度10-9g/ml 線性范圍寬線性范圍寬 對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫 應用范圍廣應用范圍廣折光計由測量池和參比池組成示差折光計折光計由測量

15、池和參比池組成示差折光計因因 n nf fT T，故需精密恒溫，故需精密恒溫0.0010.001靈敏度低于靈敏度低于UVUV檢測器，且不適合于梯度洗脫檢測器，且不適合于梯度洗脫用于無紫外吸收的化合物，如糖類用于無紫外吸收的化合物，如糖類 2. 2. 熒光檢測器：多波長熒光檢測器濾光片熒光檢測器：多波長熒光檢測器濾光片 熒光分光檢測器光柵分光熒光分光檢測器光柵分光 氘燈作激發(fā)光源，波長范圍氘燈作激發(fā)光源，波長范圍250250600nm600nm 應用：組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物應用：組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物質，且熒光強度與濃度成正比。質，且熒光強度與濃度成正比。 特點：靈敏

16、度更高特點：靈敏度更高 檢測限檢測限10-1210-1210-13g/ml10-13g/ml靈敏靈敏度比度比UVUV檢測器高檢測器高2323個數(shù)量級個數(shù)量級 選擇性好選擇性好 對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫 所需試樣量少，適于痕量分析所需試樣量少，適于痕量分析 應用范圍廣應用范圍廣 3 3、電化學檢測器、電化學檢測器 電導、庫侖、極譜、安培、電位等檢測器。電導、庫侖、極譜、安培、電位等檢測器。 伏安計、安培計、庫侖計和電導計等伏安計、安培計、庫侖計和電導計等, , 首選安培計首選安培計 可用于在工作電極的工作電壓范圍能復原或氧化的物質可用于在工作電極的工作

17、電壓范圍能復原或氧化的物質 電極外表易中毒電極外表易中毒 溫溫 度：度：10103030；相對濕度：相對濕度：8080； 最好是恒溫、恒濕最好是恒溫、恒濕遠離高電磁干擾、高振動設備，有良好的通風設施遠離高電磁干擾、高振動設備，有良好的通風設施HPLC的日常維護與保養(yǎng)的日常維護與保養(yǎng)HPLC的日常操作條件：的日常操作條件： 1 Alliance液相色譜系統(tǒng)日常維護：開機程序 2 Alliance液相色譜系統(tǒng)日常維護：開機程序HPLC的日常操作的日常操作選擇流動相時應注意的幾個問題：選擇流動相時應注意的幾個問題：1盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜

18、質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。2防止流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞防止流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化硅固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化硅固定相等。相等。3試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。淀并在柱中沉積。4流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。檢測器時，流動相不應有紫外吸收。 手柄位在手柄位在LoadLoad位置時，用微量進樣針將樣品從

19、位置時，用微量進樣針將樣品從進樣孔注射進入定量環(huán)中進樣孔注射進入定量環(huán)中( (定量環(huán)充滿后，多余定量環(huán)充滿后，多余樣品從放空孔排出樣品從放空孔排出) ) 手柄轉動至手柄轉動至InjectInject位置時，閥與液相流路接通，位置時，閥與液相流路接通，由泵輸送的流動相沖洗定量環(huán)，將樣品進入色由泵輸送的流動相沖洗定量環(huán)，將樣品進入色譜柱中進行分析譜柱中進行分析 工作原理：工作原理： 手柄轉動要快速手柄轉動要快速：手柄處于手柄處于LoadLoad和和InjectInject之間時，由于之間時，由于暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉到進樣位，過暫時堵住了流路，流路中壓力驟增，再轉到進樣位，過高的壓力

20、在柱頭上引起損壞，應盡快轉動閥，不能在中高的壓力在柱頭上引起損壞，應盡快轉動閥，不能在中途停留途停留 局部裝液法：進樣量最多為定量環(huán)體積的局部裝液法：進樣量最多為定量環(huán)體積的7575 要求每次進樣體積準確、相要求每次進樣體積準確、相同同 完全裝液法：進樣量最少為定量環(huán)體積的完全裝液法：進樣量最少為定量環(huán)體積的3 3至至5 5倍倍 將定量環(huán)內殘留的溶液完全置換樣品，到達將定量環(huán)內殘留的溶液完全置換樣品，到達所要求的精密度及重現(xiàn)性所要求的精密度及重現(xiàn)性兩種裝液方法兩種裝液方法: : 樣品必須過濾樣品必須過濾：用用0.45(0.22)0.45(0.22)m m的濾膜過濾的濾膜過濾 防止微粒阻塞進樣閥

21、防止微粒阻塞進樣閥 減少對進樣閥的磨損減少對進樣閥的磨損 進樣結束沖洗進樣器進樣結束沖洗進樣器： 用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗，用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動相沖洗， 在進樣閥的在進樣閥的LoadLoad和和InjectInject位置反復沖洗位置反復沖洗 再用無纖維紙擦凈注射器針頭的外側再用無纖維紙擦凈注射器針頭的外側 使用流動相盡量要清潔使用流動相盡量要清潔 進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗 流動相交換時要防止沉淀流動相交換時要防止沉淀 防止泵內堵塞或有氣泡防止泵內堵塞或有氣泡 每次分析結束后，要反復沖洗進樣口，防止樣品的交每次分析結束后，要反復沖洗

22、進樣口，防止樣品的交叉污染叉污染2. 泵的保養(yǎng)泵的保養(yǎng) 在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動色譜柱在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動色譜柱 當色譜柱和色譜儀聯(lián)結時，閥件或管路一定要清洗干凈當色譜柱和色譜儀聯(lián)結時，閥件或管路一定要清洗干凈 要注意流動相的脫氣要注意流動相的脫氣 防止使用高粘度的溶劑作為流動相防止使用高粘度的溶劑作為流動相 進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量進樣樣品要提純；嚴格控制進樣量2. 色譜柱的保養(yǎng)色譜柱的保養(yǎng) 每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品 每天分析測定結束后，都要用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗刻旆治鰷y定結束后，都要用適當?shù)娜?/p>

23、劑來清洗柱 假設分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封假設分析柱長期不使用，應用適當有機溶劑保存并封閉閉 在分析前應先平衡色譜柱，差不多后，再開檢測器；在分析前應先平衡色譜柱，差不多后，再開檢測器； 在分析完成后馬上關閉檢測器在分析完成后馬上關閉檢測器3. 3. 紫外燈的保養(yǎng)紫外燈的保養(yǎng) “分析型液相色譜目的:得到數(shù)據(jù)-定性及定量分析 靈敏度的要求 樣品的復雜性 樣品量的要求 精度及準確度的要求 容易使用HPLC的應用 “制備型液相色譜目的:得到純品-別離及純化 化合物的穩(wěn)定性 樣品的復雜性 制備量的要求 純度的要求，及純度的鑒定 方法的平安性 色譜圖(Chromatogram) : 色譜

24、柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應信號對時間的曲線圖,其縱坐標為信號強度,橫坐標為時間HPLC色譜圖名詞術語色譜峰(Peak):):色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應信號峰底(Peak Base):):峰的起點與終點之間連接的直線峰高(Peak Height):):峰最大值到峰底的距離峰面積(Peak Area):):峰與峰底之間的面積,又稱響應值色譜圖名詞術語:基線基線(Baseline):(Baseline):在正常操作條件下,僅由流動相所產(chǎn)生的響應信號基線飄移基線飄移(Baseline Drift):(Baseline Drift):基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲基線噪聲(N)N)(B

25、aseline Noise):(N)N)(Baseline Noise):由各種因素所引起的基線波動譜帶擴展譜帶擴展(Band Broadening):(Band Broadening):由于縱向擴散,傳質阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象色譜圖名詞術語:保存時間保存時間(tR)(Retention time):(tR)(Retention time):組分從進樣到出現(xiàn)峰最大組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間值所需的時間死時間死時間(t0)(Dead time):(t0)(Dead time):不被固定相滯留的組分不被固定相滯留的組分, ,從進從進樣到出現(xiàn)峰最大值所

26、需的時間樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間保存體積保存體積(VR)(Retention volume):(VR)(Retention volume):組分從進樣到出現(xiàn)峰最組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積大值所需的流動相體積死體積死體積(V0)(Dead volume):(V0)(Dead volume):不被固定相滯留的組分不被固定相滯留的組分, ,從進從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積色譜圖名詞術語: 等度在整個運行過程中溶劑組成保持不變如(60:40 甲醇/水)HPLC 實驗的根本類型-等度 梯度在運行過程中溶劑組成變化漸變或臺階式變化如 100% H20

27、/ 0% MeOH 到 0% H2O/100% MeOHHPLC 實驗的根本類型-梯度 這些是導出理論和定義所必需的根本測量這些是導出理論和定義所必需的根本測量洗脫體積和峰寬 簡單說來簡單說來, ,別離度即是兩峰相對于其峰寬分開得有多別離度即是兩峰相對于其峰寬分開得有多遠遠別離度(R)的定義式 計算別離度的實例計算別離度的實例: :別離程度的量度 k k 是樣品與填料作用強度的直接量度是樣品與填料作用強度的直接量度保存因子(k):保存能力的量度 是兩個化合物在同一套色譜系統(tǒng)上保存差異的數(shù)值是兩個化合物在同一套色譜系統(tǒng)上保存差異的數(shù)值表述表述別離因子():峰別離程度的量度 理論塔板數(shù)或柱效是一個

28、數(shù)值,它表示作為保存時間函數(shù)的峰展寬的量度 用于評價色譜柱的性能(中國2021版藥典)理論塔板數(shù)(N):別離效率的量度色譜峰對稱性的測量方法中國藥典要求對儀器進行適用性試驗, 即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適應性溶液對色譜系統(tǒng)進行試驗和調整,要到達規(guī)定的要求 色譜系統(tǒng)的適應性實驗通常包括理論板數(shù)、別離度、重復性和拖尾因子四個指標 要求:理論塔板數(shù)N: 大于規(guī)定值(按半峰寬法計算)別離度R: 應大于1.5重復性: 連續(xù)進樣5次,峰面積的相對標準偏差不大于2.0%拖尾因子T: 應在0.95-1.05之間中國藥典對系統(tǒng)適用性的規(guī)定 在定性的根底上定量,需有純物質作為標準物 液相色譜定量是相對定量的方法:

29、即由量的純標樣推算混合物中被測物的量 液相色譜法定量的依據(jù)是:被測組分的量與響應值(峰高或峰面積)成正比液相色譜定量分析原理 用“標樣的保存時間(Rt)確認被測組份鑒別需定量的色譜峰(定性) 定性鑒別每個要定量的色譜峰首先用標樣確定欲定量之色譜峰的保存時間(Rt)通過比較保存時間,找到未知樣中各色譜峰所對應的組份 色譜定性是用與標樣比較保存時間的方法 因此要明確：保存時間相同，可能是同樣的組份保存時間不同，肯定不是同樣的組份鑒別需定量的色譜峰(定性) 標準參加法 同時用其它方法 1其它色譜方法(改變機理,如:用不同的色譜柱) 2其它檢測器 o PDA, 光譜圖比較、譜庫檢索 o MS，質譜圖解析、譜庫檢索 3其它儀器方法進一步確實認(定性)確認定量峰的一致性PDA 純度角原理PDA 純度角測定結果 標準曲線法,分為外標法和內標法:-外標法:液相色譜中用得最多-內標法準確，但是麻煩在標準方法中用得最多常用的定量方法液相色譜定量分析的步驟外標法定量(1)外標法定量(2)外標法定量(3) 外 標 法 按 各 品 種 項 下 的 規(guī) 定 ，精 密 稱 量 取對照品和供試品，配 制 成 溶 液