生化反應(yīng)曲線

1、 1 生化生化反應(yīng)曲線反應(yīng)曲線 2生化分析基本原理生化分析基本原理 生化反應(yīng)曲線生化反應(yīng)曲線內(nèi)容概況內(nèi)容概況 3羅氏生化分析系統(tǒng)產(chǎn)品線羅氏生化分析系統(tǒng)產(chǎn)品線Cobas 6000 (c501) 600T/HModular D 2400T/HModular P 800T/HCobas c311300T/HCobas c111180T/HCobas 8000 2000T/H 4cobascobas 8000 8000 模塊化組合分析系統(tǒng)模塊化組合分析系統(tǒng) 智能、高效、智能、高效、強(qiáng)勁強(qiáng)勁 5物質(zhì)對(duì)光吸收的基本定律物質(zhì)對(duì)光吸收的基本定律 Lambert- Beer定律 LambertBeer定律表達(dá)為

2、: 當(dāng)一束平行的單色光通過含有均勻吸光物質(zhì)的溶液時(shí),溶液的吸光度(A)與溶液的濃度(C)和光透過液層厚度(L)的乘積成正比。物質(zhì)對(duì)光吸收的吸光系數(shù)（e）為常數(shù)。 其數(shù)學(xué)表達(dá)式：A = e*C*L I入射光透射光I0= = =-光吸收的基本定律光吸收的基本定律= =light detector 6根據(jù)根據(jù)Lambert- BeerLambert- Beer定律來計(jì)算待測(cè)物濃度定律來計(jì)算待測(cè)物濃度如若吸光系數(shù) ( )未知，我們就需要采用定標(biāo)曲線 來計(jì)算待測(cè)物的濃度。 濃度 (amount of substance)吸光度 (amount of color)40123456706050302010C

3、alibrator/standard 標(biāo)準(zhǔn)品 (cfas)待測(cè)樣本Concx =Concx = Abs Absx x x x ConcsConcs AbssAbssConcxConcx = 待測(cè)樣本濃度ConcConcs s = 標(biāo)準(zhǔn)品濃度 AbsxAbsx = 樣本吸光度AbssAbss = 標(biāo)準(zhǔn)品吸光度此值為定值 7 Lambert-Beer 定律 適合于任何均勻非散射的介質(zhì) 生化比色分析特定蛋白透射比濁分析Lambert-Beer 定律分光光度法定量分析的依據(jù)分光光度法定量分析的依據(jù) 8Roche Hitachi PhotometerRoche Hitachi Photometer 9

4、當(dāng)相應(yīng)的比色杯每一次通過光路系統(tǒng)時(shí)，光路系統(tǒng)會(huì)測(cè)量并記錄下相應(yīng)的吸光度 光路系統(tǒng)可以測(cè)量后分光后12個(gè)波長(zhǎng)的相應(yīng)吸光度。12 有效波長(zhǎng): 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800nm 多數(shù)檢測(cè)項(xiàng)目都使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)方法。（可去除干擾物對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響）Reaction sequenceReaction sequence 10 11 12儀器讀數(shù)的原理不同儀器每個(gè)循環(huán)周期的時(shí)間間隔Modular P 1818秒秒Cobas c702 1616秒秒Cobas C501 8 8秒秒Modular D 1212秒秒C311 12

5、 12秒秒反應(yīng)轉(zhuǎn)盤不停的周期旋轉(zhuǎn)當(dāng)相應(yīng)的比色杯通過光路系統(tǒng)時(shí)，光路系統(tǒng)會(huì)測(cè)量并記錄下相應(yīng)的吸光度在不同的時(shí)間點(diǎn)加入相應(yīng)的反應(yīng)試劑 13Reaction sequenceReaction sequence 14Instrument cycleInstrument cycle 15Endpoint and rate (kinetic) assaysEndpoint and rate (kinetic) assays自動(dòng)生化分析常用的方法有自動(dòng)生化分析常用的方法有: : 終點(diǎn)法（終點(diǎn)法（End Point AssaysEnd Point Assays）：一般在整個(gè)反應(yīng)完成后再來檢測(cè)吸光度 速率法（速

6、率法（Rate assaysRate assays） ：一般在反應(yīng)的過程中監(jiān)測(cè)吸光度的變化情況 16終點(diǎn)分析法終點(diǎn)分析法時(shí)間吸光度A 1tS+R1 基于基于 被測(cè)物質(zhì)在反應(yīng)過程中被測(cè)物質(zhì)在反應(yīng)過程中到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)，根據(jù)該點(diǎn)吸光度的大小求出被測(cè)物濃度，稱為終點(diǎn)法根據(jù)該點(diǎn)吸光度的大小求出被測(cè)物濃度，稱為終點(diǎn)法。 終點(diǎn)法的計(jì)算：終點(diǎn)法的計(jì)算： 從從時(shí)間時(shí)間- -吸光度曲線吸光度曲線來看，到達(dá)反來看，到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化。在達(dá)。在達(dá)到終點(diǎn)時(shí)任取一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)底到終點(diǎn)時(shí)任取一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)底物和產(chǎn)物的量都不再變化。物和產(chǎn)物的量都不再變

7、化。吸光度A 1S+R1吸光度 17 兩點(diǎn)終點(diǎn)法（兩點(diǎn)終點(diǎn)法（2-point end2-point end） 一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法 （1-point end1-point end）一點(diǎn)終點(diǎn)單試劑（一點(diǎn)終點(diǎn)單試劑（1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent）一點(diǎn)終點(diǎn)雙試劑（一點(diǎn)終點(diǎn)雙試劑（1-point endpoint assay two reagents1-point endpoint assay two reagents） 三點(diǎn)終點(diǎn)法（三點(diǎn)終點(diǎn)法（3 3- -point endpoint end）

8、終點(diǎn)分析法（終點(diǎn)分析法（Endpoint assaysEndpoint assays） 18兩點(diǎn)終點(diǎn)法兩點(diǎn)終點(diǎn)法 在被測(cè)物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時(shí)，選擇第一在被測(cè)物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時(shí)，選擇第一個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果。此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果。 19去除了樣本的本底采用兩個(gè)測(cè)量點(diǎn) 針對(duì)兩個(gè)或多個(gè)試劑的項(xiàng)目第一個(gè)讀數(shù)點(diǎn)一般選在添加最后一個(gè)試劑之前第二個(gè)讀數(shù)點(diǎn)一般選在加入最后一個(gè)試劑之后且已經(jīng)達(dá)到了反應(yīng)終點(diǎn)兩點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)兩點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)C + D (顯色產(chǎn)物)+ B1 (試劑1) +

9、 B2 (試劑 2)A A (樣本)Endpoint assaysEndpoint assays 20兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線兩點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線Cobas c702Cobas c702Endpoint assaysEndpoint assaysSample+R1Mp1 abs before addition of R3Mp2 abs at reaction end 21兩點(diǎn)讀數(shù)的時(shí)間點(diǎn):第19點(diǎn)測(cè)量包含了樣本和試劑1的本底 sample + reagent 1 第 38點(diǎn)在加入所有試劑后，反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn) sample + reagent 1+ reagent 2兩點(diǎn)終點(diǎn)法的應(yīng)用參數(shù)兩點(diǎn)終點(diǎn)法的應(yīng)用

10、參數(shù) Cobas c702 Cobas c702測(cè)量的兩個(gè)讀數(shù)點(diǎn)方法類型總反應(yīng)時(shí)間（min）2Point Endpoint assay application settings2Point Endpoint assay application settings 22RF-II C4 C3 ASL CRPL IGG IGA IGM兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例Endpoint assaysEndpoint assays 23一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法A單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法例如:CHOL/TG. 在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間- -吸光度曲線上吸光度不再吸光度曲線上吸光度不再

11、改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值，用于計(jì)算結(jié)果。改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值，用于計(jì)算結(jié)果。B雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法Mg(雙試劑) 24單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（1-point endpoint assay one reagent1-point endpoint assay one reagent） 不包含樣本的本底 僅進(jìn)行一個(gè)點(diǎn)的測(cè)量檢測(cè)項(xiàng)目舉例：甘油三酯（TG）Endpoint assaysEndpoint assaysA (樣本) C + D (顯色產(chǎn)物)+ B (試劑) 25單單試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線1-point endpoint assay 1-p

12、oint endpoint assay oneone reagents reagentsEndpoint assaysEndpoint assays 26 不包含樣本的本底 僅進(jìn)行一點(diǎn)測(cè)量應(yīng)用項(xiàng)目舉例： Magnesium不采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法主要是樣本和R1體積相加仍180uL(最小反應(yīng)體積，無法測(cè)量）雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（雙試劑一點(diǎn)終點(diǎn)法的特點(diǎn)（1-point endpoint assay two reagents1-point endpoint assay two reagents）C + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A A (sa

13、mple) 27 1st entry: 方法類型 2nd entry:總分析時(shí)間 3rd - 6th entry:測(cè)量點(diǎn) 一點(diǎn)終點(diǎn)法應(yīng)用參數(shù)（一點(diǎn)終點(diǎn)法應(yīng)用參數(shù)（1 Point Endpoint assay1 Point Endpoint assay）Utility - Application - AnalyzeUtility - Application - Analyze 28 TRIGL CHO 一一點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例點(diǎn)終點(diǎn)法分析項(xiàng)目舉例Endpoint assaysEndpoint assays 29例如例如, ,多項(xiàng)同測(cè)組合試劑盒多項(xiàng)同測(cè)組合試劑盒,CHO,CHO與與TGTG同一測(cè)定

14、同一測(cè)定 即雙終點(diǎn)法即雙終點(diǎn)法, ,在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)在一個(gè)通道內(nèi)一次進(jìn)行兩項(xiàng)反應(yīng)相關(guān)的終點(diǎn)法測(cè)定的終點(diǎn)法測(cè)定. .三點(diǎn)終點(diǎn)法三點(diǎn)終點(diǎn)法 30上升 increasing 或 下降decreasing終點(diǎn)法反應(yīng)的方向（終點(diǎn)法反應(yīng)的方向（Reaction DirectionReaction Direction） 31 速率法速率法 吸光度tt2t1t3t4A1A2A3S+R時(shí)間A 1 利用線性反應(yīng)期，計(jì)算出單位時(shí)間的吸光度變化A/min，來計(jì)算酶的活性。單位時(shí)間的吸光度變化量是一致的 在酶促反應(yīng)過程中在酶促反應(yīng)過程中, ,在反應(yīng)速度恒定期在反應(yīng)速度恒定期( (線性反應(yīng)期線性反應(yīng)期)

15、)來連續(xù)觀察和記錄一定來連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或代謝產(chǎn)物變化速度的化學(xué)方法反應(yīng)時(shí)間內(nèi)底物或代謝產(chǎn)物變化速度的化學(xué)方法. . 32速率速率A A法法 （Rate ARate A）兩點(diǎn)速率法（兩點(diǎn)速率法（2-point Rate2-point Rate）速率法（速率法（Endpoint assaysEndpoint assays） 33 速率速率A A法法A 單試劑速率法例如:ACPAFUB 雙試劑速率法 例如:ALTASTCK 在較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi),每隔一定時(shí)間讀取一次吸光度值,至少讀取4點(diǎn),得到3個(gè)A,求出單位時(shí)間的反應(yīng)速率 A/min . .通過最小二乘法（least squar

16、es method） 34Rate A assay Modular PRate A assay Modular PReag. at R3 timingLast mp1st. mpSample Reag. at R1 timingRate assaysRate assays 35GOT/ASTGGTGPT/ ALT LipaseALPGLDHAmylaseLDHCHECKMB 速率速率A A 法法- -分析項(xiàng)目舉例分析項(xiàng)目舉例EnzymesRate assaysRate assays 36 2 2點(diǎn)速率法點(diǎn)速率法 2點(diǎn)速率法尿素氮 指在時(shí)間指在時(shí)間- -吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)

17、初始吸光吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦度亦非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的單位時(shí)間吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算。非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的單位時(shí)間吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算。 372-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assaysC + D (product)+ B1 (reagent 1) + B2 (reagent 2)A A (sample)Enzyme 38采用一種或多種試劑檢測(cè)兩個(gè)測(cè)量點(diǎn)檢測(cè)固定的間隔時(shí)間內(nèi)兩點(diǎn)的吸光度變化。 換算成 Abs/min參與計(jì)算在加入最后最后一個(gè)試劑之后進(jìn)行吸光度檢測(cè)。兩點(diǎn)速率法的特點(diǎn)兩點(diǎn)速

18、率法的特點(diǎn)2-point Rate assay2-point Rate assayRate assaysRate assays 392-point Rate assay Modular P2-point Rate assay Modular PRate assaysRate assays 40AmmoniaAcid phosphataseNon-prostatic phosphataseUrinary/CSF protein BicarbonateUreaRate assaysRate assays2 2點(diǎn)速率點(diǎn)速率 法法- -分析項(xiàng)目舉例分析項(xiàng)目舉例 41Reaction DirectionReaction Direction上升decreasing 或 下降increasing 生化反應(yīng)曲線生化反應(yīng)曲線 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57Thank you for your attentionRoche Diagnostics (Shanghai) Limited Shanghai 200031ChinaThis presentation is our intellectual property. Without our written consent, it shall neither be copied