基因工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)2

1、基因工程實(shí)驗(yàn)手冊(cè)目 錄實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的提取實(shí)驗(yàn)二、細(xì)菌基因組的提取實(shí)驗(yàn)三 DNA的限制性內(nèi)切酶解及電泳實(shí)驗(yàn)四、PCR基因擴(kuò)增及電泳實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒是一種雙鏈的共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA分子,是細(xì)胞染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子。在基因克隆的實(shí)驗(yàn)中,要把一個(gè)有用的外源基因通過(guò)重組DNA技術(shù),送進(jìn)生物細(xì)胞中去繁殖和表達(dá)。實(shí)現(xiàn)攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的工具被稱為載體,細(xì)菌質(zhì)粒是基因工程中常用的載體之一。作為基因工程的載體需具備下列條件:（1）是一個(gè)復(fù)制子,載體有復(fù)制點(diǎn)才能使與它結(jié)合的外源基因復(fù)制繁殖;(2)載體在受體細(xì)胞中能大量增殖,只有高復(fù)制率才能使外源

2、基因在受體細(xì)胞中大量擴(kuò)增；3)載體DNA鏈上有一至數(shù)個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別與切割位點(diǎn),便于外源基因的插入;(4)載體具有選擇的遺傳標(biāo)記,如抗氨芐青霉素基因(AmpR,抗新霉素基因(NeoR)等,以此判斷載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞,并據(jù)此將受體細(xì)胞從其他細(xì)胞中分離篩選出來(lái).細(xì)菌質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,一般分為兩種類型:嚴(yán)密控制型和松馳控制型。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,與染色體復(fù)制相關(guān)聯(lián),每個(gè)細(xì)胞只含有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子,如ColEI質(zhì)粒(含有產(chǎn)生大腸桿菌毒素EI基因),pBR322就是ColEI衍生的質(zhì)粒。后者在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制,具多拷貝,一般在120個(gè)以上。本實(shí)驗(yàn)分離純化的質(zhì)粒為p

3、QE30,為高拷貝質(zhì)粒。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)了解質(zhì)粒DNA的特點(diǎn),掌握堿性SDS快速法從大腸桿菌細(xì)胞中分離、提取質(zhì)粒DNA.一、實(shí)驗(yàn)原理 所有分離質(zhì)粒DNA的方法都含有以下3個(gè)步驟:細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng);細(xì)菌的收獲和裂解;質(zhì)粒DNA的純化。本實(shí)驗(yàn)以堿性SDS快速法小量制備pQE30質(zhì)粒。堿裂解法對(duì)于以前應(yīng)用的所有的大腸桿菌均卓有成效。該方法的特點(diǎn)是,加溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁(小量制備可省略不用溶菌酶),去污劑SDS可使細(xì)胞壁裂解,并使蛋白質(zhì)變性,在堿性條件下,破壞堿基配對(duì),故可使宿主的線狀染色體DNA變性,但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而彼此不分開(kāi)。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)(加入酸性試劑中和),質(zhì)粒DN

4、A鏈迅速得到準(zhǔn)確配置,重新形成完全天然的超螺旋分子。細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上,離心時(shí)易被沉淀下來(lái)而質(zhì)粒DNA則留在上清液中,乙醇沉淀后可得到質(zhì)粒DNA.如需進(jìn)一步純化,可應(yīng)用聚乙二醇沉淀法或氯化銫一溴化乙錠梯度平衡法。環(huán)狀雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型:當(dāng)其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時(shí),稱之為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(CCCDNA),這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋SC構(gòu)型;如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu),另一條出現(xiàn)有一至數(shù)個(gè)缺口時(shí),稱之為開(kāi)環(huán)DNA(OCDNA),此即OC構(gòu)型;若質(zhì)粒DNA經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后,發(fā)生雙鏈斷裂而形成線性分子(LD

5、NA),通稱L構(gòu)型。質(zhì)粒DNAMr一般在106107之間,常以kb表示(lkb雙鏈DNA=6.6×105),如質(zhì)粒pUC19的Mr為1.8×106(2.69kb)。在瓊脂糖凝膠電泳中,不同構(gòu)型的同一種質(zhì)粒DNA,盡管M相同,仍具有不同的電泳遷移率,其中走在最前沿的是scDNA,其后依次為L(zhǎng)DNA和ocDNA。二 儀器、材料與試劑(一)儀器1. 恒溫培養(yǎng)箱2. 恒溫?fù)u床3. 臺(tái)式離心機(jī)4. 高壓滅菌鍋(二)材料1.葡萄糖2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.氫氧化鈉5.十二烷基硫酸鈉(SDS)6.乙酸鉀7.冰乙酸8.氯仿9.乙醇10.RNA酶11.氨

6、芐青霉素12.蔗糖13.溴酚藍(lán)14.酚15. 8一羥基喹琳16. 一巰基乙醇17.鹽酸(HCl)18.含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌19.吸頭、小指管(三)試劑1.溶液I50 mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCL(pH8.0)10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液II0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等體積混合3.溶液III5mol/L乙酸鉀 60 mL冰乙酸 11.5 mL水 28.5 mL4.TE緩沖液l0 mmol/L Tris-HCI1 mmol/L EDTA(pH8.0)5 70%乙醇(放-20冰箱中,用后

7、即放回)6.、膜RNA酶將RNA酶溶于10mmol/LTris-HCI(pH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/mL的濃度,于100加熱15min,緩慢冷卻至室溫,保存于-20。7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴酚蘭8.酚。三 實(shí)驗(yàn)步驟1.將2mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中,接入上述的含pQE30質(zhì)粒的大腸桿菌,37振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2.取1.5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中10000r/min離心2min.3.吸去培養(yǎng)液,使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。4.將細(xì)菌沉淀懸浮于100L溶液I中，充分混勻室溫放置10min。5.加200L溶液II(新鮮配制)，蓋緊管口，混勻內(nèi)容物，將

8、離心管放冰上5min。6.加入150L溶液III(冰上預(yù)冷)，蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上15 min。7.12000r/min離心15min將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。8.向上清中加人等體積酚:氯仿(1:1)(去蛋白),反復(fù)混勻，12000r/min，離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻后室溫放置510min. 12000r/min，離心5min.倒去上清液,把離合管倒扣在吸水紙上,吸干液體。10.加入20TE緩沖液,使DNA完全溶解,-4保存。四 實(shí)驗(yàn)安排本實(shí)驗(yàn)一天內(nèi)可做完。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可結(jié)合下一個(gè)實(shí)驗(yàn)一起觀察。五、討論1.細(xì)胞的裂解作用是分離質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)

9、操作的關(guān)鍵步驟。通常是加入溶菌酶或SDS來(lái)促使大腸桿菌細(xì)胞裂解的。如果寄主細(xì)胞沒(méi)有完全裂解,就會(huì)顯著降低質(zhì)粒DNA的回收率。理想的狀況是使每一個(gè)細(xì)胞都充分破裂到能使質(zhì)粒DNA順利溢出,而又沒(méi)有污染過(guò)多的染色體分子。2.提取過(guò)程中,除規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件外,應(yīng)盡量保持低溫,避免過(guò)酸過(guò)堿,操作中手法要溫和,防止機(jī)械剪切,盡可能避免脫氧核糖核酸酶對(duì)質(zhì)粒DNA的降解和破壞。3.采用酚/氯仿去除蛋白的效果較單獨(dú)使用酚或氯仿好。一般來(lái)講,要將蛋白質(zhì)盡量除干凈,需多次抽提,本實(shí)驗(yàn)雖只抽提一次,已能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。注意在吸取上層水相時(shí)勿吸入下層有機(jī)相混于其中。4.乙醇沉淀質(zhì)粒DNA是最常用的沉淀方法,通常采用冷乙醇(

10、無(wú)水乙醇貯于-20),沉淀?xiàng)l件為-20、1h。因本實(shí)驗(yàn)為微量快速,室溫下數(shù)分鐘DNA即可沉淀,雖然DNA量少,但純度相對(duì)高(因?yàn)榈蜏亻L(zhǎng)時(shí)間雜質(zhì)也一并沉淀下來(lái)),有利于以后的酶切及電泳結(jié)果。沉淀方法也可用異丙醇,只需0.54倍體積常溫下即可將DNA完全沉淀出來(lái),這對(duì)于大體積的質(zhì)粒DNA沉淀十分有效。但缺點(diǎn)是常將鹽等亦同時(shí)沉淀出來(lái),因此需要用70%乙醇很好地洗滌。一般來(lái)講廣泛應(yīng)用的沉淀試劑還是乙醇。實(shí)驗(yàn)三 DNA的限制性內(nèi)切酶解及電泳（參考酶使用說(shuō)明書(shū)）一、實(shí)驗(yàn)原理DNA的限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù)是分子克隆和基因操作中最為基本和重要的方法之一。限制性核酸內(nèi)切酶,簡(jiǎn)稱限制性內(nèi)切酶、限制酶或內(nèi)切酶,是一類

11、能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶,主要存在于原核細(xì)胞中。限制性內(nèi)切酶有I、三類, 其中第II類酶在分子克隆和基因操作中最為有用,是常用的分子生物學(xué)工具酶,其基本特性如下:專一性地識(shí)別并切割特定的核苷酸序列,例如:EcoRI酶的識(shí)別與切割序列為:5'GAATTC3'3'CTTAAG5'2.識(shí)別的核苷酸數(shù)目多為46bp長(zhǎng)度范圍,少數(shù)酶能識(shí)別更長(zhǎng)的堿基序列,如813bp。3.識(shí)別序列大多數(shù)為二重對(duì)稱,或稱為回文序列。少數(shù)酶酶切后產(chǎn)生帶平末端的DNA片段,如HpaII、Alu I和PvuII等,但大多數(shù)酶切割產(chǎn)生的片段具有凸出的粘性末端,如EcoRI酶

12、切后產(chǎn)生5F-P粘性末端,而PstI則產(chǎn)生3'-OH粘性末端。4.有的不同來(lái)源的限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別相同的序列,甚至切割位點(diǎn)也相同,這些酶稱為同裂酶或異源同工酶,例如HpaII和MspI。有的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)不同,但對(duì)DNA切割后能產(chǎn)生相同的粘性末端,這些酶稱為同尾酶,如BamHI、BglII、MboI、XhoII等。5.限制性內(nèi)切酶一般都以鎂離子為唯一的輔助因子,并要求有一定的鹽離子濃度、酸堿度和溫度條件。限制性內(nèi)切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同,可采用單酶切、雙酶切

13、和部分酶切等不同的方法。根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同,又可分為小量酶切反應(yīng)和大量酶切反應(yīng)等。一般情況下,小量酶切反應(yīng)用于質(zhì)粒等的酶切鑒定,體積為20L,大量酶切反應(yīng)用于制備目的基因片段,體積為50100L。本實(shí)驗(yàn)安排的是EcoRI對(duì)質(zhì)粒DNA的小量酶切、Hind和SalI對(duì)質(zhì)粒DNA的雙酶切以及Sau3AI對(duì)真核細(xì)胞基因組DNA的部分酶切。二 儀器、材料與試劑(一) 儀器高速離心機(jī),冷凍離心機(jī),水浴鍋,穩(wěn)壓電泳儀,電泳槽,手提式紫外檢測(cè)儀,紫外檢測(cè)儀,EP管,吸嘴,微量進(jìn)樣器,燒杯,量筒,塑料手套,懾子,剪刀,三角瓶。(二)試劑(1)EcoRI 限制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(2)H

14、indIII 限制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(3)NruI 限制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(4)Sau 3AI限制性內(nèi)切酶(附10×酶切緩沖液)。(5)DNA的HindIII酶切樣品,作為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。(6)無(wú)菌水:量取50mL重蒸水于100mL三角瓶中,1.034×105Pa滅菌20mino分裝于幾只滅菌過(guò)的EP管中,貯存-20備用。(7)0.2%溴酚藍(lán)、50%蔗糖上樣緩沖液。(8)1mg/mL溴化乙錠溶液。(9)電泳緩沖液。(10)瓊脂糖。(三)材料純化的PCMV-M 質(zhì)粒DNA。三 實(shí)驗(yàn)步驟(參考酶使用說(shuō)明書(shū))(一) PCMV-M

15、質(zhì)粒DNA的EcoRI小量酶解1.在無(wú)菌Ep管中用微量進(jìn)樣器依次加入下列試劑無(wú)菌水7LEcoRI10×緩沖液2LPBR322質(zhì)粒DNA10L(含0.21gDNA)EcoRI限制性內(nèi)切酶1L(5U/L)總體積20.L2.離心2s,收集并混勻反應(yīng)液。3.37水浴1.52h。4.取出Ep管,吸取12L進(jìn)行電泳分析,以DNA HindIII酶切標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量為對(duì)照，電泳鑒定DNA酶解效果。如酶解不完全,可繼續(xù)37水浴,或加入適量限制性內(nèi)切酶后繼續(xù)反應(yīng)。5.經(jīng)電泳觀察酶切反應(yīng)完全后,將上述反應(yīng)液置65水浴中1015min,中止酶切反應(yīng),保存于一20備用。(二)HindIII和Sal I對(duì)pB

16、R322質(zhì)粒DNA的雙酶切1.在無(wú)菌Ep管中周微量進(jìn)樣器依次加入下列試劑無(wú)菌水15LHindIII 10×緩沖液2L質(zhì)粒DNA2L(含12gDNA)HindIII限制性內(nèi)切酶1L(5U/L)總體積20L2.離心2s,收集并混勻反應(yīng)液。37水浴1h。3.加入1L1molANaCl,稍加混勻后再加入1L&門(mén)限制性內(nèi)切酶.4.離心2s,收集并混勻反應(yīng)液。37水浴1h.5.以DNA HindIII酶切標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量為對(duì)照,電泳分析鑒定DNA酶解效果。(三)限制性內(nèi)切酶的部分酶解1.在0.5mLEP管中,建立以下混合體系進(jìn)行基因組DNA酶解:10×Sau3AI緩沖液 5L提

17、取的基因組DNA20L(2560g)無(wú)菌重蒸水75L總計(jì)100L2.將上述混合物于55水浴15min,充分分散基因組DNA片段。3.將反應(yīng)混合物分裝于5支Ep管中,其中管1為30L,管2管4各為20L,管5為10L。冰浴放置。4.按310U/gDNA的量加入Su3AI于管1,輕彈管壁混勻,短暫離心2S收集反應(yīng)物,冰上放置。5.從管1中吸取10L反應(yīng)物轉(zhuǎn)至管2,迅速混勻后,冰上放置。6.依次從管2吸取10L反應(yīng)物至管3,管3至管4,管4至管5,連續(xù)稀釋后,各管體積均為20L。7.37保溫20min,68水浴58min,使Sau 3AI內(nèi)切酶失活,置于冰上.8.從每管20L酶解產(chǎn)物中各取4L在0.

18、5%瓊脂糖凝膠中電泳,低電壓下緩慢電泳516h,判斷不同酶解產(chǎn)物的大小范圍.四 實(shí)驗(yàn)安排本實(shí)驗(yàn)僅需半天到一天。五、討論1.實(shí)驗(yàn)安排:本實(shí)驗(yàn)僅需半天到一天,安排單酶切反應(yīng)和部分酶切反應(yīng)時(shí),同時(shí)進(jìn)行雙酶切反應(yīng)中第一種酶的消化。第一種酶反應(yīng)結(jié)束后,補(bǔ)充適當(dāng)?shù)腘aC1,再加入第二種酶進(jìn)行反應(yīng),此后可進(jìn)行單酶切和部分酶切反應(yīng)的電泳鑒定,直至雙酶切反應(yīng)完全。也可僅安排單酶切反應(yīng)或雙酶切反應(yīng)。部分酶切實(shí)驗(yàn)放到基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建時(shí)進(jìn)行。2.對(duì)于雙酶切反應(yīng),如果兩種限制性內(nèi)切酶反應(yīng)條件相同或相似,可以同時(shí)加入兩種酶進(jìn)行酶切,但反應(yīng)體積應(yīng)稍大些,以免保存酶的甘油濃度過(guò)高,影響酶的活性;如果酶的反應(yīng)條件相差較大,

19、一般先進(jìn)行第一種酶的酶切反應(yīng),消化結(jié)束后采用乙醇沉淀法,回收線性化的DNA,再建立第二種酶的酶解反應(yīng)體系,繼續(xù)酶切。如果兩個(gè)酶的反應(yīng)條件只是溫度上的差別,可以先加一種酶進(jìn)行酶解,然后加入另一種酶在相應(yīng)的溫度條件下反應(yīng)。如果兩個(gè)酶的緩沖液中鹽濃度相差較大,也可如本實(shí)驗(yàn)一樣,先進(jìn)行低離子濃度酶的酶解反應(yīng),待酶解完全后,補(bǔ)加氯化納及相差的化學(xué)成分或調(diào)節(jié)pH值,再加入第二種酶繼續(xù)酶解或先進(jìn)行較小體積的酶切反應(yīng),然后再用第二種酶要求的緩沖液稀釋后進(jìn)行第二種酶的反應(yīng)。3.酶切時(shí)加樣順序一般為水、緩沖液、DNA及酶液。其中水的體積可變,由反應(yīng)體系中其余各成分定量后確定。吸取酶液時(shí),要在冰浴上操作并從溶液表明

20、吸取,以防止吸嘴沾去過(guò)多的酶液,取液后蓋緊蓋子,立即放回-20冰箱,防止限制性內(nèi)切酶的失活。4.限制性內(nèi)切酶一般保存在50%甘油的緩沖液中。當(dāng)酶切反應(yīng)混合物中甘油的含量超過(guò)5%,將會(huì)抑制酶的活性或產(chǎn)生酶的星號(hào)活力,因此酶的用量體積一般不超過(guò)反應(yīng)總體積的10%。5.DNA的質(zhì)量是影響酶切效果的因素之一。DNA中包括DNase在內(nèi)的蛋白雜酶等會(huì)使DNA降解,并且隨著酶切時(shí)間的增長(zhǎng),降解越嚴(yán)重。雜質(zhì)DNA或RNA會(huì)與酶發(fā)生非專一性的結(jié)合而使酶活相對(duì)減少,甚至?xí)?dǎo)致切不動(dòng)目的DNA片段。樣品中酚、氯仿、乙醇和EDTA等有機(jī)或無(wú)機(jī)溶劑則能抑制酶的活性,量大時(shí)甚至使酶失活,因此DNA樣品的質(zhì)量要有所保證。

21、實(shí)驗(yàn)四 PCR基因擴(kuò)增及電泳1985年,美國(guó)PE-Cetus公司的人類遺傳研究室Mullis等人發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),使人們夢(mèng)寐以求的體外無(wú)限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。開(kāi)始是使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段來(lái)擴(kuò)增人基因組中的特異片段,但該酶不耐熱。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(Thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶,將此酶命名為T(mén)aqDNA多聚酶(Taq DNA polymerase

22、)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR反應(yīng)更易于自動(dòng)化,繼而PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR熱循環(huán)儀,使該技術(shù)的自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)于1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。而PCR技術(shù)也成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。一 實(shí)驗(yàn)原理多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)，由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等3步反應(yīng)組成一個(gè)周期，多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程：?jiǎn)捂淒NA模板在一小段互補(bǔ)聚核苷酸引物引導(dǎo)下，利用DNA聚合酶的酶促反應(yīng)按

23、53方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。在待擴(kuò)增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸引物,經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后,DNA擴(kuò)增2n倍。1.變性:加熱使模板DNA在高溫下(94)變性,雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈,即變性階段。2.退火:使溶液溫度降至5060,模板DNA與引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合,即退火階段。3.延伸:溶液反應(yīng)溫度升至72,耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,在引物的引導(dǎo)下,利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸(dNTP),按5'3'方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA,即引物的延伸階段。上述3步為一個(gè)循環(huán), 從理論上講,每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍,新形成的

24、鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板,經(jīng)過(guò)2530個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106109倍。PCR能快速靈敏特異地?cái)U(kuò)增目的基因或DNA片段，成為分子生物學(xué)和基因工程的有效手段，可用于基因的分離克隆核苷酸序列分析基因表達(dá)調(diào)控的研究遺傳病和傳染病的診斷致病機(jī)制的探索和法醫(yī)鑒定等諸多方面。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成:DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgC12、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱Tag聚合酶。二 儀器、材料與試劑(一)儀器1.PCR熱循環(huán)儀 2.瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（二)材料1.DNA模板2.4種dNTP3.引物1、引物24.Taq酶5.瓊脂糖6.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物7.吸頭、80.2mlPCR管

25、(三)試劑1. 10×緩沖液500mmol/LKCl100mmol/LTris-HCl(pH8.3,室溫)15mmol/LMgC120.1% 明膠2. 4×dNTP1mmol/L dATP1mmol/L dCTP1mmol/L dGTP1mmol/L dTTP3. Tag酶 1U/L4. DNA模板 lng/mL5. 引物1 引物2 （引物溶液濃度 10pmo1/L）三 實(shí)驗(yàn)步驟1. 在0.5mLEppendorf管內(nèi)配制25L反應(yīng)體系反應(yīng)物 體積/LddH20 1110×PCR緩沖液 2.52.5mmol/LdNTP 2.025mmol/LMgC12 1.5引物

26、1 1.0引物2 1.0模板DNA 5Tag酶 1混勻,加25L石蠟油。2.按下述程序進(jìn)行擴(kuò)增94預(yù)變性 2 min94變性 45sec57退火 1min72延伸 45sec重復(fù)步驟30次:72延伸 3min4 保存3.瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果 配制1%瓊脂糖凝膠,取8L擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。保持電流4OmA。電泳結(jié)束后,用EB染色15min,紫外燈下觀察結(jié)果。四 實(shí)驗(yàn)安排 本實(shí)驗(yàn)1天內(nèi)可完成，上午做PCR反應(yīng)，下午做電泳檢測(cè)五 討論1.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:模板核酸的制備;引物的質(zhì)量與特異性;酶的質(zhì)量;PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板:模板中含有

27、Taq酶抑制劑;在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多,或吸人盼;模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,有可能是模板核酸提取過(guò)程出了毛病,可使用陽(yáng)性對(duì)照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一

28、致,如一條引物有條帶,一條引物無(wú)條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度: Mg2+千濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20L、30L、50L或100L,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,在做小體積如20L后,再做

29、大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。物理原因:變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率,退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。2.假陽(yáng)性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源

30、性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列O靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌O所用離心管及進(jìn)樣吸頭等均應(yīng)一次性使用O必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性,可互相拼接,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式PC

31、R方法來(lái)減輕或消除。3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體;二是與Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn),酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物;減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶;降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù);適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性,65左右退火與延伸)。4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂

32、抹帶或片狀帶或地毯樣帶,其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過(guò)高, Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有:減少酶量,或調(diào)換另一來(lái)源的酶;減少dNTP的濃度;適當(dāng)降低Mg2+濃度;增加模實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化帶有外源DNA片段的重組體分子在體外構(gòu)建之后,需要導(dǎo)人適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞進(jìn)行繁殖,才能夠獲得大量的單一的重組體DNA分子。將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑,包括轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電擊穿孔等多種不同的方式。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類的原核細(xì)胞和酵母這樣的低等真核細(xì)胞,而顯微注射和電擊穿孔則主要應(yīng)用于高等動(dòng)植物的真核細(xì)胞。在基因操作

33、中,轉(zhuǎn)化一詞嚴(yán)格地說(shuō),是指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲和表達(dá)質(zhì)粒載體DNA分子的過(guò)程,而轉(zhuǎn)染一詞則是專指感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達(dá)噬菌體DNA分子的過(guò)程。但二者從本質(zhì)上講沒(méi)有什么根本的區(qū)別,無(wú)論是轉(zhuǎn)化還是轉(zhuǎn)染,其關(guān)鍵的因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞,以提高膜的通透性,從而使外源DNA分子能夠容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。所以習(xí)慣上,人們往往也通稱轉(zhuǎn)染為廣義的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株(常用R-、M-表示)。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊的方法處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,為能容許外源DNA分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞。在一定條件下,將帶有外源DNA分子

34、的重組體與感受態(tài)細(xì)胞混合保溫,使DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞的DNA分子通過(guò)復(fù)制和表達(dá),實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,從而使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化體,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí),加深理解轉(zhuǎn)化在分子生物學(xué)研究中的意義和應(yīng)用,并掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、外源質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體等方法。一、實(shí)驗(yàn)原理用物理或化學(xué)的方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌(Escherichia)DH5菌株為受體細(xì)胞,用CaCl2試劑處理受體菌,當(dāng)細(xì)菌經(jīng)過(guò)冰冷的CaCl2溶液處理后,細(xì)菌細(xì)胞在0和低滲

35、狀態(tài)下,膨脹成球形,然后與質(zhì)粒pIIC19DNA混合,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面,經(jīng)42短暫熱沖擊處理后,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。當(dāng)加入適宜培養(yǎng)基恢復(fù)細(xì)胞特性并在平板上培養(yǎng)生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后,細(xì)胞分裂增殖,被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中,重組子基因得到表達(dá)。pUC19質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因,因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉素的特性,用AmpR表示。這樣在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上,只有轉(zhuǎn)化體才能存活,而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無(wú)抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化體經(jīng)過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)后,可將轉(zhuǎn)入的外源DNA分子分離提取出來(lái),進(jìn)行電泳、電鏡觀察,并制作限制性內(nèi)切

36、酶切割圖譜、分子雜交及DNA測(cè)序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。二 儀器、材料與試劑(一) 儀器1.超凈工作臺(tái)2.低溫離心機(jī)3.恒溫?fù)u床4.恒溫箱5.-70冰箱6.恒溫水浴器(二)材料1.氯化鈣(CaCL2)2.膜蛋白胨3.酵母提取物4.氯化鈉(NaCL)5.氨芐青霉素6.大腸桿菌DH57.pQE30質(zhì)粒8.50mL離心管9.吸頭、小指管10.試管、培養(yǎng)血、錐形瓶等(三)試劑1.0.1mol/LCaCL溶液2.LB液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基,應(yīng)在950mL去離子水中加入:膜蛋白胨(bactoptone) 10g酵母提取物(bacto-yeastextract) 5gNaCL l0g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解,用NaoH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至總