葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶共固定化

1、葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶的共固定化摘要：酶的共固定化是在原有的單酶固定化技術(shù)的基礎(chǔ)上,將單酶體系改為雙酶或多酶體系,或?qū)⒚竿o酶及其他與酶有相互作用的活性物質(zhì)共同固定化在同一介質(zhì)中形成偶聯(lián)反應(yīng)體系的過程。因?yàn)橐骖櫜煌傅牟煌钸mpH值、最適溫度、共固定比例以及固定化次序等問題,所以酶的共固定相對單酶固定化要復(fù)雜得多。葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過氧化物酶(HRP)是常用的兩種酶，前者多提取自黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)物，而后者則來自天然植物辣根，兩種酶在很多領(lǐng)域都有極為廣泛的應(yīng)用。本文主要概述這兩種酶的共固定化方法及對共固定化酶(HRP是主酶,GOX提供H2O2是輔助酶)催化苯甲硫醚不對稱氧化成苯甲亞

2、砜的反應(yīng)的應(yīng)用。酶的共固定化酶催化反應(yīng)具有專一性強(qiáng)、效率高、作用條件溫和等特點(diǎn)，因而在生物技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)，醫(yī)藥化工，食品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。然而，酶制劑由于造價(jià)昂貴，將其以游離酶的形式用于生產(chǎn)過程，存在穩(wěn)定性差，難以回收利用，產(chǎn)物分離難度高等缺點(diǎn)，天然游離酶已經(jīng)越來越不能勝任規(guī)模化生產(chǎn)的要求，也難以同傳統(tǒng)化工和發(fā)酵產(chǎn)業(yè)相抗衡。酶的固定化不僅可以解決酶的回收，下游產(chǎn)物污染問題，還可以提高酶的穩(wěn)定性，并在一定程度上加強(qiáng)了酶對高溫，酸，堿乃至有機(jī)溶劑等條件的承受能力，拓寬了酶的應(yīng)用范圍，增強(qiáng)了酶的應(yīng)用價(jià)值。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase，GOX)，屬氧化還原酶類，產(chǎn)自真

3、菌和某些昆蟲（如蜜蜂）。葡萄糖氧化酶分子量為160kDa，由兩個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基的分子量為80kDa，并且，每個(gè)亞基的上分別通過非共價(jià)鍵結(jié)合著一分子的輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。輔酶FAD在酶反應(yīng)過程中起著電子傳遞體的作用。葡萄糖氧化酶的等電點(diǎn)（PI）為4.2，能選擇性地在有分子氧的條件下，將-D-葡萄糖氧化為1,5-葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫，產(chǎn)物過氧化氫的積累，會(huì)對GOX的活性起到產(chǎn)物抑制作用。所以要保持GOX的活性，往往需要及時(shí)地去除或者消耗掉產(chǎn)生的過氧化氫。辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase,HRP,E.C.11.1.1.7）是一種植物過氧化物

4、酶，提取自常年生香草植物辣根（Horseradish）。辣根，又名西洋葵菜，作為一種香料作物在世界各地溫和地區(qū)都有種植，來源非常廣泛。所以，辣根過氧化物酶也是來源最為廣泛，價(jià)格相對低廉的酶制劑。辣根過氧化物酶（HRP）在過氧化氫（或其他過氧化物）存在下，能通過一個(gè)二質(zhì)子二電子過程催化芳香族化合物，酚類化合物，吲哚，胺類和磺酸鹽等還原性底物的氧化，其中AH是即還原性底物，A為自由基。在HRP催化反應(yīng)中，自由基的形成暗示了HRP在植物胞內(nèi)中可能所起的作用。這些功能可能包括一些交聯(lián)反應(yīng)，如：酪氨酸交聯(lián)形成雙酪氨酸，交聯(lián)酚類單體形成軟木脂，氧化偶合酚類化合物等。當(dāng)遇到一些外部因素時(shí)，過氧化物酶的交聯(lián)反

5、應(yīng)就有可能啟動(dòng)，如：植物組織受到創(chuàng)傷。當(dāng)失水或有病原體入侵時(shí)，此類植物就會(huì)合成一種保護(hù)性的聚合物屏障來減少傷害，如：軟木脂等。作為過氧化物酶典型代表，HRP經(jīng)常被用于研究過氧化物酶分子的結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)，更是被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、生物轉(zhuǎn)化、相關(guān)酶檢測、發(fā)光檢測、免疫測定、廢水處理、臨床化學(xué)、環(huán)境化學(xué)和食品工業(yè)等領(lǐng)域，目前針對其在各個(gè)領(lǐng)域的生物傳感器的研究更是為我們展現(xiàn)出其廣闊的應(yīng)用前景。葡萄糖氧化酶（GOX）和辣根過氧化物酶（HRP）共固定葡萄糖氧化酶（GOX）和辣根過氧化物酶（HRP）共固定是最常見的共固定化體系，葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶最適pH范圍相近，同為糖蛋白，含糖量也相近

6、，它們存在著如圖1所示的反應(yīng)偶聯(lián)關(guān)系：葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶都是糖蛋白，其豐富的糖基，會(huì)在室溫下與異氰酸基團(tuán)發(fā)生如上所示的反應(yīng)，將酶共價(jià)結(jié)合于聚氨酯泡沫上；反應(yīng)體系中的水與異氰酸基團(tuán)反應(yīng)生成CO2氣體，使得聚合物形成多孔海綿狀。該反應(yīng)極適合糖基化酶的固定。在此雙酶共固定體系中，葡萄糖氧化酶充當(dāng)?shù)氖窃?，H2O2供體的角色，通過添加葡萄糖替代直接添加H2O2，以消除H2O2局部濃度過高導(dǎo)致的辣根過氧化物酶失活的弊端。因此，在雙酶系統(tǒng)中，辣根過氧化物酶是主體，因此，選定HRP的濃度不變，通過改變GOX的量來找到能使HRP達(dá)到最大酶活，從而為進(jìn)一步的固定化研究提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)活力比為1的時(shí)

7、候，HRP只表現(xiàn)出了部分活性，這可能是GOX產(chǎn)生H2O2不能及時(shí)擴(kuò)散到HRP表面；隨著比值的增加，HRP表現(xiàn)出越來越高的活性，在HRP顯然，在活力比為2.5的時(shí)候，HRP能發(fā)揮出最大活力；然而超過3以后，酶活性反而出現(xiàn)了一定程度的下降，這應(yīng)該是過高的H2O2濃度開始在一定程度上影響了酶活性。葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶共固定化的應(yīng)用共固定化GOD和HRP主要應(yīng)用于生物傳感器。GOD分別和多種過氧化物酶共固定于聚氨酯泡沫上催化手性物質(zhì)合成的研究表明，這些體系通過GOD氧化葡萄糖產(chǎn)生H2O2為過氧化物酶提供氧化劑，原位氧化模式使得過氧化物酶不易失活，比起原有的流加模式，設(shè)備簡單且易于操作，還可實(shí)現(xiàn)

8、連續(xù)化操作，這為HRP在這方面的應(yīng)用也提供了借鑒。手性亞砜是一類重要化合物，主要有以下幾種用途： 可以作為手性輔劑和中間體用于合成復(fù)雜的手性天然產(chǎn)物； 作為手性配體或手性催化劑用于多種不對稱催化反應(yīng)； 作為手性藥物用于治療胃潰瘍的質(zhì)子泵抑制劑等。目前合成手性亞砜的主要方法為酶法手性合成和化學(xué)法不對稱催化。化學(xué)法合成因?yàn)橥枰尤氚嘿F的手性誘導(dǎo)劑或其他難以回收的活性物質(zhì)，且催化速率較低，所以仍然存在很多弊端。酶催化手性合成具有作用條件溫和，催化效率高，不需要添加手性誘導(dǎo)劑等特點(diǎn)，相對化學(xué)方法更為環(huán)保，但是以游離酶為催化劑，酶易失活，不易回收，無法應(yīng)用于生產(chǎn)。固定化酶就可以很好的解決這個(gè)問題。辣

9、根過氧化物酶可以催化芳基烷基硫醚氧化為對應(yīng)得亞砜，單一固定化辣根過氧化物酶催化氧化亞砜化反應(yīng)需要以過氧化氫為氧化劑，但是辣根過氧化物酶對過氧化氫濃度極其敏感，高濃度的過氧化氫會(huì)將其氧化成沒有催化活性的中間態(tài)；此外，過氧化氫的腐蝕性，使得其存儲(chǔ)和運(yùn)輸比較麻煩。采用雙酶共固定技術(shù)，首先，可以通過控制雙酶比例，通過加入葡萄糖來代替過氧化氫，雙酶偶聯(lián)作用可以保持反應(yīng)體系中比較穩(wěn)定的過氧化氫濃度，保持了酶的活性和手性選擇性；其次，固定化系統(tǒng)為酶在有機(jī)相中反應(yīng)提供了可能，可以解決作為底物的硫醚難溶于水相的問題；第三，固定化酶可以反復(fù)使用，為實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)提供可能。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)關(guān)于共固定葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶催化手性亞砜的合成的研究，不論對于雙酶共固定技術(shù)的進(jìn)一步探索還是實(shí)現(xiàn)酶法催化手性物質(zhì)合成的實(shí)際應(yīng)用，都有非常重要的意義。參考文獻(xiàn)：1. 陳培策，葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶共固定化催化手性苯甲亞砜的合成研究，浙江工業(yè)大學(xué)碩士論文，2.2.3 2.葉鵬 , 張劍波 , 陳嵩 , 等 . 固定化辣根過氧化物酶催化去除五氯酚 J . 北京大學(xué)學(xué)報(bào) , 2005, 41( 6) : 9183. 陳培策 , 張朝暉 , 謝雪鳳，共固定化辣根過氧化物酶的最新研究進(jìn)展，材料導(dǎo)報(bào)綜述篇，2010.5.24（5）：75-774. 洪偉杰 , 張朝暉 , 蘆國營