血清膽固醇的定量測定

1、實驗二實驗二 血清膽固醇的定量測定血清膽固醇的定量測定（磷硫鐵法）（磷硫鐵法）一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握磷硫鐵法測定血清中、學(xué)習(xí)并掌握磷硫鐵法測定血清中總膽固醇含量的原理及操作；總膽固醇含量的原理及操作；2、學(xué)會制備無蛋白血清、學(xué)會制備無蛋白血清 ；3、了解血清總膽固醇的正常值范圍、了解血清總膽固醇的正常值范圍及臨床意義及臨床意義 。二、實驗原理膽固醇的分子結(jié)構(gòu)3171 膽固醇主要存在于動物細胞，參膽固醇主要存在于動物細胞，參與膜的組成，質(zhì)膜中的含量比細胞器與膜的組成，質(zhì)膜中的含量比細胞器膜中的多。膽固醇也是血中脂蛋白復(fù)膜中的多。膽固醇也是血中脂蛋白復(fù)合體的成分；并與合體的成分；并

2、與粥樣硬化粥樣硬化有關(guān)，它有關(guān)，它是動脈壁上形成的粥樣硬化斑塊成分是動脈壁上形成的粥樣硬化斑塊成分之一。膽固醇也是類固醇激素和膽汁之一。膽固醇也是類固醇激素和膽汁酸的前提。酸的前提。 1784年，從膽石中提取出膽固醇。年，從膽石中提取出膽固醇?？偰懝檀嫉臏y定方法： 磷硫鐵法 化學(xué)比色法 醋酸酐法 鄰苯二甲醛法 酶學(xué)方法（試劑盒） 用無水乙醇提取血清中的膽固醇，用無水乙醇提取血清中的膽固醇，再與磷硫鐵試劑作用，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再與磷硫鐵試劑作用，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，呈色度與膽固醇含量成正比，可用比呈色度與膽固醇含量成正比，可用比色法測定血清中膽固醇含量。色法測定血清中膽固醇含量。 血清經(jīng)無水乙醇處理后蛋

3、白質(zhì)被沉血清經(jīng)無水乙醇處理后蛋白質(zhì)被沉淀，膽固醇及其脂則溶解在無水乙醇中。淀，膽固醇及其脂則溶解在無水乙醇中。在乙醇提取液中加入硫磷鐵試劑（即濃在乙醇提取液中加入硫磷鐵試劑（即濃硫酸和三價鐵溶液），膽固醇及其脂與硫酸和三價鐵溶液），膽固醇及其脂與試劑反應(yīng)形成比較穩(wěn)定的紫紅色化合物，試劑反應(yīng)形成比較穩(wěn)定的紫紅色化合物，呈色程度與膽固醇含量成正比，可于呈色程度與膽固醇含量成正比，可于560nm 波長下進行比色測定。波長下進行比色測定。 正常血清中膽固醇的含量有隨年正常血清中膽固醇的含量有隨年齡增大而增加的趨勢，其平均正常值齡增大而增加的趨勢，其平均正常值在在110220mg/100mL。 膽固醇含

4、量在膽固醇含量在400mg/100ml內(nèi)，內(nèi)，與與A值成良好線性關(guān)系。值成良好線性關(guān)系。 三、實驗器材1、人血清2、可見分光光度計3、臺式離心機（4000r/min）4、離心管5、試管6、移液管。四、實驗試劑1、10%三氯化鐵溶液：三氯化鐵溶液：10.0g FeCl36H2O 溶于濃溶于濃磷酸中，定容至磷酸中，定容至100ml；2、磷硫鐵試劑、磷硫鐵試劑(P-S-Fe 試劑試劑)：?。喝?0%三氯化鐵溶三氯化鐵溶液液1.5ml于于100ml棕色容量瓶內(nèi)，加棕色容量瓶內(nèi)，加濃硫酸濃硫酸至刻至刻度；度；3、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)貯液：準(zhǔn)確稱量膽固醇、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)貯液：準(zhǔn)確稱量膽固醇80mg，溶于，溶于無水乙醇，

5、定容至無水乙醇，定容至100ml；4、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：將貯液用無水乙醇準(zhǔn)確稀釋、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：將貯液用無水乙醇準(zhǔn)確稀釋10倍即得，此標(biāo)準(zhǔn)液含倍即得，此標(biāo)準(zhǔn)液含0.08mg/mL膽固醇。膽固醇。5、無水乙醇、無水乙醇五、操作1、膽固醇的提取膽固醇的提取 吸取血清吸取血清0.1ml置干燥離心管置干燥離心管內(nèi)，先加無水乙醇內(nèi)，先加無水乙醇0.4ml，搖勻后，搖勻后再加無水乙醇再加無水乙醇2.0ml，搖勻，搖勻，10min后離心（后離心（3000r/min-6000r/min）5min，取上清夜備用。，取上清夜備用。2、比色測定比色測定 取干燥試管取干燥試管3支，支，編號編號，分別加入，分別加入無水

6、乙醇無水乙醇1.0ml（空白管），膽固醇標(biāo)（空白管），膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)溶液1.0ml（標(biāo)準(zhǔn)管），上述乙醇提（標(biāo)準(zhǔn)管），上述乙醇提取液取液1.0ml（樣品管），各管皆加入磷（樣品管），各管皆加入磷硫鐵試劑硫鐵試劑1.0ml，搖勻，搖勻，10min后，分后，分別轉(zhuǎn)移至比色杯內(nèi)，用可見分光光度別轉(zhuǎn)移至比色杯內(nèi)，用可見分光光度計在計在560nm處比色。處比色。 管號/試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管無水乙醇1.0ml膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液1.0ml乙醇抽提液1.0ml磷硫鐵試劑1.0ml1.0ml1.0mlA560 注：注：磷硫鐵試劑須磷硫鐵試劑須沿管壁沿管壁緩緩加入，緩緩加入，與乙醇液分成兩層，立即迅速振與乙醇液分成兩

7、層，立即迅速振搖搖20次，放置次，放置10分鐘（冷卻至室分鐘（冷卻至室溫）后，于溫）后，于560nm進行比色，以進行比色，以空白管調(diào)零讀取各管吸光度?？瞻坠苷{(diào)零讀取各管吸光度。六、計算100ml血清中膽固醇的質(zhì)量（血清中膽固醇的質(zhì)量（mg） A1C0 m= 0.04100 A0注意事項：1、顏色反應(yīng)與加磷硫鐵試劑混合時的產(chǎn)熱顏色反應(yīng)與加磷硫鐵試劑混合時的產(chǎn)熱程度有關(guān)，因此，所用試管程度有關(guān)，因此，所用試管口徑和厚度要口徑和厚度要一致一致；加磷硫鐵試劑必須與乙醇分成兩層，；加磷硫鐵試劑必須與乙醇分成兩層，然后混合，不能邊加邊搖，否則顯色不完然后混合，不能邊加邊搖，否則顯色不完全；磷硫鐵試劑要全；

8、磷硫鐵試劑要加一管混合一管加一管混合一管，混合，混合的手法、程度也要一致；混合時試管發(fā)熱，的手法、程度也要一致；混合時試管發(fā)熱，注意注意勿使試管內(nèi)液體濺出勿使試管內(nèi)液體濺出，以免損傷衣服、，以免損傷衣服、皮膚和眼睛。皮膚和眼睛。2、所用試管和比色杯所用試管和比色杯均須干燥均須干燥，濃硫，濃硫酸的質(zhì)量很重要，放置日久，往往因酸的質(zhì)量很重要，放置日久，往往因為吸收水分，而使顏色反應(yīng)降低。為吸收水分，而使顏色反應(yīng)降低。3、空白管應(yīng)接近無色，如帶橙黃色，、空白管應(yīng)接近無色，如帶橙黃色，表示乙醇不純，應(yīng)用去醛處理。表示乙醇不純，應(yīng)用去醛處理。移液槍的使用移液槍的使用吸嘴的安裝吸嘴的安裝 散裝吸嘴安裝 盒

9、裝吸嘴安裝注意事項 錯誤操作：在將槍頭套上移液槍時，很多錯誤操作：在將槍頭套上移液槍時，很多人會使勁地在槍頭盒子上敲幾下。這樣會人會使勁地在槍頭盒子上敲幾下。這樣會導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件（如彈簧）因敲擊導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件（如彈簧）因敲擊產(chǎn)生的瞬時撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)產(chǎn)生的瞬時撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住，嚴重的情況會將白致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住，嚴重的情況會將白套筒折斷。套筒折斷。 正確操作：將移液器垂直插入槍頭中，稍正確操作：將移液器垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動即可使其緊密結(jié)合。微用力左右微微轉(zhuǎn)動即可使其緊密結(jié)合。設(shè)定容量設(shè)定容量注意事項 1、移液器要在規(guī)定的容量內(nèi)使

10、用，、移液器要在規(guī)定的容量內(nèi)使用，切勿超切勿超量程量程使用，否則會卡住內(nèi)部機械裝置而損使用，否則會卡住內(nèi)部機械裝置而損壞了移液器。壞了移液器。 2、調(diào)整容量時，如果從大到小時，可以直、調(diào)整容量時，如果從大到小時，可以直接調(diào)到想要的容量；如果從小到大時，一接調(diào)到想要的容量；如果從小到大時，一定要調(diào)超三分之一圈，然后再調(diào)回來，這定要調(diào)超三分之一圈，然后再調(diào)回來，這樣做可以使彈簧完全放開樣做可以使彈簧完全放開,而且移液器總是而且移液器總是在順時針運轉(zhuǎn)可以延長移液器的使用壽命在順時針運轉(zhuǎn)可以延長移液器的使用壽命。移液移液 1.連接恰當(dāng)?shù)奈爝B接恰當(dāng)?shù)奈欤?2.按下控制鈕至第一檔按下控制鈕至第一檔（在

11、空氣中在空氣中）；）； 3.將移液器吸嘴垂直進入液面下將移液器吸嘴垂直進入液面下1- -6mm（視移液器容量大小而定）注：為使測量（視移液器容量大小而定）注：為使測量準(zhǔn)確可將吸嘴預(yù)洗準(zhǔn)確可將吸嘴預(yù)洗3 次，即反復(fù)吸排液體次，即反復(fù)吸排液體3 次。次。 4.使控制鈕使控制鈕緩慢緩慢滑回原位；滑回原位； 5.移液器移出液面前移液器移出液面前略等略等1- -3秒秒；1000ul 以下停頓以下停頓 1 秒；秒；5- -10ml停頓停頓2- -3秒秒 6.緩慢取出吸嘴，確保吸嘴外壁無液體。緩慢取出吸嘴，確保吸嘴外壁無液體。排液排液 1.將吸嘴以一定角度抵住容量內(nèi)壁；將吸嘴以一定角度抵住容量內(nèi)壁； 2.緩

12、慢將控制鈕按至第一檔并等待約緩慢將控制鈕按至第一檔并等待約13秒；秒； 3.將控制鈕按至第二檔過程中，吸嘴將剩將控制鈕按至第二檔過程中，吸嘴將剩余液體排凈余液體排凈，可反復(fù)在，可反復(fù)在1,2檔間按壓，確保檔間按壓，確保排凈；排凈； 4.慢放控制鈕；慢放控制鈕； 5.按壓彈射鍵彈射出吸嘴。按壓彈射鍵彈射出吸嘴。移液移液 一是前進移液法。用大拇指將按鈕按下至一是前進移液法。用大拇指將按鈕按下至第一停第一停點點，然后慢慢松開按鈕回原點。接著將按鈕按至，然后慢慢松開按鈕回原點。接著將按鈕按至第一停點排出液體，稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二第一停點排出液體，稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點吹出殘余的液體。最后松開

13、按鈕。停點吹出殘余的液體。最后松開按鈕。 二是反向移液法。此法一般用于轉(zhuǎn)移二是反向移液法。此法一般用于轉(zhuǎn)移高粘高粘液體、液體、活性液體、活性液體、易起泡易起泡液體或液體或極微量極微量的液體。其操作的液體。其操作是先按下按鈕至第二停點，慢慢松開按鈕至原點。是先按下按鈕至第二停點，慢慢松開按鈕至原點。接著將按鈕按至第一停點排出設(shè)置好量程的液體，接著將按鈕按至第一停點排出設(shè)置好量程的液體，繼續(xù)保持按住按鈕位于第一停點（千萬別再往下繼續(xù)保持按住按鈕位于第一停點（千萬別再往下按），取下有殘留液體的槍頭，棄之。按），取下有殘留液體的槍頭，棄之。移液槍的養(yǎng)護及注意事項移液槍的養(yǎng)護及注意事項 1.當(dāng)移液器吸嘴

14、有液體時當(dāng)移液器吸嘴有液體時切勿切勿將移液器水將移液器水平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕平或倒置放置，以防液體流入活塞室腐蝕移液器活塞。移液器活塞。 2.移液器使用完畢后，把移液器量程調(diào)至移液器使用完畢后，把移液器量程調(diào)至最大值，且將移液器垂直放置在移液器架最大值，且將移液器垂直放置在移液器架上。上。 3.如液體不小心進入活塞室應(yīng)及時清除污如液體不小心進入活塞室應(yīng)及時清除污染物。染物。 4.平時檢查是否漏液的方法：吸液后在液平時檢查是否漏液的方法：吸液后在液體中停體中停1- -3 秒觀察吸頭內(nèi)液面秒觀察吸頭內(nèi)液面是否下降是否下降；如果液面下降首先檢查吸頭是否有問題，如果液面下降首先檢查吸頭是否有問題，如有問題更換吸頭，更換吸頭后液面仍下如有問題更換吸頭，更換吸頭后液面仍下降說明活塞組件有問題，應(yīng)找專業(yè)維修人降說明活塞組件有問題，應(yīng)找專業(yè)維修人員修理。員修理。 5.吸取液體時一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，吸取液體時一定要緩慢平穩(wěn)地