Chapter+1液質(zhì)原理

1、 什么是LC-MS? 是將液相色譜的分離性能和質(zhì)譜的質(zhì)量分析能力結(jié)合在一起的一種分析化學(xué)技術(shù) LC-MS是一種強(qiáng)大的技術(shù),用于很多應(yīng)用領(lǐng)域,具有高靈敏度和選擇性.通常用于復(fù)雜基質(zhì)中的化合物分析和鑒定. 3色譜圖lUV 或 MS 光譜m/z時(shí)間m/zl響應(yīng)404550556065707580859095100105110115120125130135Scan0100%PGF2ALPHALC22: Scan ES- 353.3313.94e71.54Scan NumberAbundanceChromatogram51525453555758565960Scan 56Scan 56100150200

2、250300350400m/z0100%Terry1 96 (0.985)1: Scan ES+ 3.40e5182.1102.2115.1271.2183.1272.3Spectrum 分析物轉(zhuǎn)換為氣相離子 離子通過(guò)動(dòng)能,與質(zhì)荷比相關(guān)(m/z),分離,檢測(cè) 總離子流(信號(hào))與m/z做圖,成質(zhì)譜LCFlow InjectorPB-EIESIAPCIMALDIQuadrupoleHybrid instrumentTime of FlightIon TrapFT-MS分析器Electron MultiplierPhotomultiplierMicrochannel PlateTurboMechan

3、ical真空樣品引入離子源APPI檢測(cè)器誰(shuí)在用制藥制造醫(yī)療大學(xué)和研究所環(huán)境隨著軟件和儀器的發(fā)展,用戶(hù)群越來(lái)越廣為什么用 選擇性靈敏度易用. 串聯(lián)四極桿已成為復(fù)雜機(jī)質(zhì)中痕量物質(zhì)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn) 四極桿可用于篩查或確定分析物的存在 四極桿非常穩(wěn)定 四極桿不提供高分辨率 四極桿可解決一些定性分析,但不能用于完全未知樣品的分析物確認(rèn).9 ACQUITY TQD儀器概述 離子源 真空引入接口 質(zhì)量分析器 檢測(cè)器 大氣壓電離 電噴霧電離理論 大氣壓化學(xué)電離 四極桿理論 串聯(lián)四極桿采集模式10228 m/z162 m/zMinutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0

4、0198 m/z數(shù)據(jù)LC過(guò)來(lái)的液體樣品導(dǎo)入11MS1碰撞室MS21213萃取錐孔霧化氣脫溶劑氣樣品錐孔氣源排廢取樣錐孔真空隔離閥機(jī)械泵渦淪分子泵六極桿四極桿14機(jī)械泵渦淪分子泵萃取錐孔霧化氣脫溶劑氣樣品錐孔氣源排廢六極桿取樣錐孔真空隔離閥四極桿Corona電暈針加熱器15六極桿四極桿取樣錐孔1617打拿極磷PMT18 電噴霧電離 液體從導(dǎo)電毛細(xì)管?chē)姵?毛細(xì)管帶高電壓. 產(chǎn)生帶電液滴的噴霧 液滴蒸發(fā)、分裂直至離子蒸發(fā)生成氣相離子 大氣壓 化學(xué)電離(APCI) 液體通過(guò)加熱管蒸發(fā)，生成氣相分子 Corona電針加有高壓，生成離子化的氮原子電暈團(tuán)，進(jìn)而離子化溶劑。 溶劑通過(guò)電荷轉(zhuǎn)移電離分子19-+-

5、液體電噴霧探頭末端+高電壓+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+Taylor錐負(fù)離子多于正離子正離子多于負(fù)離子正電液滴20High Voltage Power Supply+2.5-4.0 kVCounter Electrode+-21 電噴霧 液滴從毛細(xì)管出來(lái)時(shí)帶正電荷 為了平衡正電流，毛細(xì)管也生成了電子 由靠近毛細(xì)管壁表面的負(fù)離子發(fā)生電化學(xué)氧化，產(chǎn)生電子。 電噴霧可以被理解成電化學(xué)過(guò)程22+ + +庫(kù)侖分裂庫(kù)侖分裂+23 溶液應(yīng)該有高比例的有機(jī)溶劑，例如乙腈或甲醇 溶液必須含一定水相成分,含水合氫離子或氫氧根離子等離子化物種24 由液滴生成氣相離子的模型 離子蒸

6、發(fā)o 通過(guò)蒸發(fā)和分裂, 液滴體積變小.o 離子然后從液滴表面蒸發(fā).o 表面活性的分子，更容易生成電噴霧離子. 電荷殘余o 液滴通過(guò)蒸發(fā)連續(xù)失去溶劑分子，直至僅剩帶電電荷。25+霧化大氣壓取樣錐孔真空M+nHn+離子蒸發(fā)機(jī)理1M+nHn+庫(kù)侖分裂機(jī)理2HV+26脫溶劑氣流加熱絲電噴霧 羽流27 溶液過(guò)程 溶液中容易離子化的分子會(huì)有更強(qiáng)的電噴霧信號(hào).o LC/MS分析流動(dòng)相中添加某些添加劑，有助于提高電噴霧信號(hào). 舉例:o 正離子電噴霧 LC/MS 分析流動(dòng)相添加甲酸. 通過(guò)幫助溶液中的分析物質(zhì)子化，產(chǎn)生更強(qiáng)的電噴霧信號(hào).28流動(dòng)相(揮發(fā)性)添加劑、pH調(diào)節(jié)劑，有助于離子生成酸性:甲酸, 低pH緩

7、沖液堿 + H3O+堿 + H+ + H2O堿性:高pH緩沖液,氫氧化銨酸 + HO-酸 - H- + H2O29NNCH3OCH3H+ H+LidocaineNNCH3OCH3H+H正離子電噴霧正離子電噴霧CH3OOHCH3CH3CH3OOCH3CH3+ H+Ibuprofen負(fù)離子電噴霧負(fù)離子電噴霧30(M H)-(M + H)+Acetaminophen MW = 151.1Solvent : H2O/ACN (90/10)NHOOHCH331 質(zhì)譜測(cè)定是基于質(zhì)荷比 (m/z). 單電荷離子m/z = (M + H+)/1z 雙電荷離子m/z = (M + 2H+)/2z 多電荷離子m/

8、z = (M + nH+)/nz 多電荷離子的同位素峰等于 1/n Da 多電荷離子可以擴(kuò)展質(zhì)譜的質(zhì)量范圍.3233 1 Da(M + H)+(M + 2H)+1347.71348.71349.61350.71351.9674.6675.1675.6676.1676.534n = 20n = 22n = 18n = 16, m/z = 1060n = 23, m/z = 738n = 21n = 19n = 17Horse Heart Myoglobin(馬心肌紅蛋白)Deconvolution software去卷積軟件Transform, MaxEnt135 通常正電離的樣品: 肽和蛋白

9、小分子極性化合物 藥物及代謝物 環(huán)境污染物 染料化合物 某些有機(jī)金屬 小分子糖類(lèi) 通常負(fù)電離的樣品:某些蛋白質(zhì)某些藥物的代謝物 (例如 葡糖苷酸共軛物)寡核苷酸某些糖和多糖36 一般而言,樣品信號(hào)強(qiáng)度響應(yīng)隨著其它流動(dòng)相添加劑濃度的增高而降低,這一現(xiàn)象叫作”離子抑制” 樣品離子和電解質(zhì)離子對(duì)電荷及占據(jù)液滴表面產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng).37樣品離子與電解質(zhì)離子竟相轉(zhuǎn)化為氣相離子的競(jìng)爭(zhēng)使樣品響應(yīng)降低.NH4+NH4+NH4+NH4+OAc-NH4+OAc-AH+AH+NH4+AH+OAc-NH4+1.表面競(jìng)爭(zhēng)2.電荷競(jìng)爭(zhēng)OAc- + AH+ HOAc + A電解質(zhì)濃度樣品響應(yīng)AANH4+NH4+NH4+AH+AH+

10、A38 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)分子量確定高分子量測(cè)定適合于揮發(fā)性和非揮發(fā)性分析物通過(guò)多電荷離子檢測(cè)高分子量化合物適合于離子型/極性分析物低溫，不容易裂解靈敏度高適合定量適合毛細(xì)管高效液相色譜 缺點(diǎn)缺點(diǎn)在溶液中必須形成離子在高鹽濃度的條件下，容易有離子抑制流動(dòng)相添加劑會(huì)影響電離39 低分子量(小于 1000 Da) 單電荷物種 碎裂，即使在低錐孔電壓下 可使用非極性流動(dòng)相（正相色譜）40等離子放電(蒸發(fā)的樣品離開(kāi)探頭，在此離子化)Corona電針(加電壓)石英玻璃毛細(xì)管(樣品流)霧化氣APCI加熱器41 更高溫度,破壞性電離 溶劑和分析物分子成氣相 離子化發(fā)生在等離子區(qū) 對(duì)于某些非極性分子,靈敏度高于電噴霧

11、電離42 APCI正離子 與電噴霧正離子相似的結(jié)構(gòu) :(M + H)+ or (M + Na)+ 電子去除,形成M+, 陽(yáng)離子自由基 APCI負(fù)離子 與電噴霧負(fù)離子相似的結(jié)構(gòu)(M - H) 通過(guò)corona電針生成自由電子o 某些類(lèi)型的分子可以抓住電子,形成分子量無(wú)變化的負(fù)電基團(tuán). 有時(shí)稱(chēng)做M-,陰離子自由基43電噴霧 溶液離子化 反相色譜或帶柱后溶劑修飾的正相色譜 離子化o 探頭不加熱o 毛細(xì)管電壓 受流動(dòng)相影響強(qiáng) 極性化合物 適合熱不穩(wěn)定化合物APCI 氣相離子化 反相和正相色譜 離子化o 加熱的探頭o Corona電針 受流動(dòng)相影響小 極性小的化合物 不適合熱不穩(wěn)定化合物44 TQD M

12、S結(jié)合了ESI 和APCI 雙重功能 使用現(xiàn)有的ESI探頭,外加 corona放電針 ESCi 提供一種選擇, 從傳統(tǒng)方法到一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)做ESI-, ESI+, APCI-和APCI+ 多種模式,縮短整個(gè)分析時(shí)間. 如果當(dāng)分析物僅ESI- 模式電離,可快速獲得該分析物電離信息.45OOOHOHOCH346 電離后,離子進(jìn)入ACQUITY TQD的離子塊(ion block) 離子化后的情況與電離模式無(wú)關(guān)47離子和簇的羽流ESI 或 APCI 探頭N2N2481 ng/mL DextroMTP 20 L XTerra C82.002.503.003.504.004.505.005.50Time0

13、100%0100%0100%0100%Dextro_1_04 Sb (2,1.00 ); Sm (Mn, 2x1)MRM of 2 Channels ES+ TIC8.53e3x604.093.092.602.803.243.43Dextro_1_05 Sb (2,1.00 ); Sm (Mn, 2x1)MRM of 2 Channels ES+ TIC8.28e3x604.093.333.092.81Dextro_1_06 Sb (2,1.00 ); Sm (Mn, 2x1)MRM of 2 Channels ES+ TIC8.43e3x604.09Dextro_1_07 Sb (2,1.0

14、0 ); Sm (Mn, 2x1)MRM of 2 Channels ES+ TIC7.28e3x604.09錐孔氣 = 275錐孔氣 = 225錐孔氣 = 175錐孔氣 = 12549ESI或APCI探頭取樣錐孔和源塊,處于錐孔電壓萃取錐孔和離子透鏡位于低電壓和更低氣壓下大氣壓下的離子到初級(jí)泵四極桿離子透鏡50RFRF51時(shí)間時(shí)間離子離子前行波脈沖前行波脈沖52SourceDetectorNonresonant IonResonant Iondc and Rf voltages53MS1碰撞室MS25400.20.40.60.811.201如果四極桿以該區(qū)域的U、V值工作， m3 處于不穩(wěn)定

15、軌跡如果四極桿以該區(qū)域的U、V值工作， m3 處于穩(wěn)定軌跡U = DC VoltageV = RF VoltageUV55如果四極桿以該區(qū)域的U、V值工作， m2 處于穩(wěn)定軌跡00.20.40.60.811.201m3穩(wěn)定線(xiàn)UVU = DC 電壓V = RF 電壓5600.20.40.60.811.201m3 穩(wěn)定m2 穩(wěn)定m2 和 m3 同時(shí)穩(wěn)定兩種離子都不穩(wěn)定UVU = DC 電壓V = RF 電壓57四極桿舉例:三種離子通過(guò)四極桿, m1 有穩(wěn)定路徑,m2 和 m3 無(wú)穩(wěn)定軌跡5800.20.40.60.811.200.20.40.60.811.2m3m2m1m1, m2 和 m3 同時(shí)

16、通過(guò)m2 和 m3 通過(guò)只有 m3 通過(guò)差的四極桿質(zhì)量程序UV0123200250300350400450500550600m1m2m3m/z5900.20.40.60.811.200.20.40.60.811.2m3m2m1m3 通過(guò)通過(guò)m2 通過(guò)通過(guò)m1 通過(guò)通過(guò)UV01200250300350400450500550600m1m2m3m/z6000.20.40.60.811.200.20.40.60.811.2m3m2m1UV01200250300350400450500550600m1m2m3m/z61 特定分辨率下的RF和DC比值恒定. 同時(shí)梯度變化RF和DC，恒定比例，可實(shí)現(xiàn)沿質(zhì)量標(biāo)尺范圍的質(zhì)量數(shù)掃描 改變RF或DC將影響分辨率.62020406080100998.5999999.510001000.510011001.510021002.5m / z10% 峰谷分離m 在5%處FWHM為 0.6 Da6301631632633634635636637m / zFWHM = 0.60 Da峰質(zhì)心= 633.2 Da質(zhì)量分辨率633.2 / 0.60 = 105564020406080100634635636637638639單位分辨率單峰在5% 高度處的峰寬為1 amu如果你得到了單位分辨