抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性測定方法

1、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測定方法一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍(lán)四唑光化還原法）1、試劑的配制（1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO412H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO42H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙

2、烯吡咯烷酮）參考文獻(xiàn)：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術(shù).高等教育出版社，2000：267268。（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至100ml。網(wǎng)上說定容到100ML我也不懂。拜托（3）100mol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至1000ml；（4）100M核黃素溶液：取0.0075g核黃素用蒸餾水定容至100ml，避光保存，隨用隨配，并稀釋10倍（5）750mol/L氮藍(lán)四唑（NBT）溶液：稱取0.06133g NBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存；酶液制備：取一定部位的植物

3、葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加2ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為10ml。取5ml于10000r/min下離心10min，上清液即為SOD粗提液。提取酶液時如何保存;如果沒有測完的需要放在4的冰箱里。2、酶活性測定2顯色反應(yīng) 取試管（要求透明度好）5支，3支為樣品測定管，1支為對照管，另外1支作為空白，按表39-1加入各溶液?；靹蚝髮⒖瞻坠苤冒堤?，其它各管于4000lx日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，反應(yīng)室的溫度高時時間可適當(dāng)縮短，溫度低時時間可適當(dāng)延長）。表39-1 各溶液加入量試 劑（酶）用量(ml)終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸

4、緩沖液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100mol/L EDTA-Na2液20mol/L核黃素酶 液蒸餾水總體積1.50.30.30.30.3 0.05 0.253.013mmol75mol10mol2.0mol空白和對照管加緩沖液代替酶液加核黃素時記得要快并且要避光，SOD活性測定與計算 至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的作空白，分別測定其它各管560nm波長下的消光度值，已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。按下式計算SOD活性： SOD總活性= 式中 SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位/mg蛋白表示；A0照光對照管的消光度值

5、；AS樣品管的消光度值；VT樣液總體積（ml）；V1測定時樣品用量（ml）；FW樣重（g）；蛋白質(zhì)濃度單位為每克鮮重含蛋白毫克數(shù)(mg/g)。用熒光燈20w照20min可以嗎 不可以,二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。1、 過氧化物酶（POD）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取A母液(Na2HPO4 ) 61.5ml和B母液(NaH2PO4 ) 438.5ml混勻即為1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；（2）反應(yīng)混合液配制：取50ml PBS(100mmM，pH6.0)，加入28ul愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌

6、溶解，冷卻后加入19ul 30的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。（3）樣品測定：稱取1g，放入預(yù)冷研缽，加適量磷酸緩沖液研磨至勻漿以4000r/min離心15min，上清液轉(zhuǎn)入100ml容量瓶,用磷酸緩沖液定容至刻度，貯于冷處備用。取試管3支，一支取3ml反應(yīng)液并加入磷酸緩沖液1ml作調(diào)零，兩支取3ml反應(yīng)液并加入1ml酶液，立即計時，在470nm測定，酶隔30s讀書一次。測一個樣加一個，不要全部加上。（邊加樣邊測定，測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）（4）酶活性計算：以每min OD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。POD=（

7、A470Vt）/（WVs0.01t） (u/g min)A470：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積；Vs為測定時取用酶液體積。2、 過氧化氫酶（CAT）活性測定（1）試劑配制：0.2mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 61.0 ml 和B母液(NaH2PO4) 39.0 ml混合后至100ml。(加1gPVP)（2）反應(yīng)液配制：吸取5.68ml 30%的H2O2（原液）稀釋至1000ml，搖勻即可。（3）樣品測定：1.酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入23ml 4下預(yù)冷的pH7.0

8、磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度。混合均勻?qū)⒘科恐?冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。4下保存?zhèn)溆? 2.測定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管（加入酶液后在沸水中煮沸5-10min，冷卻之后加入H2O2測定吸光值），按表40-2順序加入試劑。表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表管 號 粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) 蒸餾水(ml)S1 0.2 1.5 1.0 S2 0.2 1.5 1.0 S3 0.2 1.5 1.02

9、5預(yù)熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。調(diào)零用磷酸緩沖液（pH=7.8）3.結(jié)果計算： 以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。 過氧化氫酶活性(u/g/min)= A240Vt/0.1V1tFW式中 A240 = AS0 （AS1+AS2）/2 AS0加入煮死酶液的對照管吸光值； AS1, AS2樣品管吸光值； Vt粗酶提取液總體積（ml）； V1測定用粗酶液體積（ml）；FW樣品鮮重（g）；0.1A240每下降0

10、.1為1個酶活單位（u）； t加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間（min）五、丙二醛含量的測定1、試劑配制：10%TCA：100g 三氯乙酸 1L0.6%TBA：0.6g硫代巴比妥酸 ,加少量氫氧化鈉（1mol/l）溶解 用10%TCA定容100ml （避光）1mol/l氫氧化鈉；稱4gNaOH用蒸餾水溶解定容100ml3、 測定步驟:稱取剪碎的試材1g，加入2ml 10TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml TCA進(jìn)一步研磨，勻漿離心（4000r）離心10min，上清液為樣品提取液。3.顯色反應(yīng)和測定吸取離心的上清液2ml（對照加2ml蒸餾水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上

11、反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的消光度。(2)雙組分分光光度法按公式可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。用上述任一方法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計算測定樣品中MDA的含量：MDA（mol/g FW） C2(umol/L)=6.45*(D532D600)0.56*D450C2為MDA的濃度；D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的消光度值。七、可溶性蛋白含量的測定（考馬斯亮藍(lán)染色法）1、試劑的配制（1）考馬斯亮藍(lán)溶液配制：稱取0.001g考馬斯亮藍(lán)，溶于50 ml 90乙醇中，加入100 ml 85（W/V）的磷酸（不懂），85%是磷酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，買回來時直接就是85%的磷酸，加入100ml就行。再用蒸餾水定容到1，貯放在棕色瓶中，此溶液在常溫下可放置1個月。（2）100g/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再從中吸取40ml用蒸餾水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即為100g/ml標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液）。2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1）樣品可溶性蛋白含量測定：稱取鮮樣0.5g, 用5ml蒸餾水或磷酸緩沖液研磨提取。吸取樣品提取液1.0Ml，放